聯(lián)合酶解法提取馬鈴薯渣膳食纖維的研究

姚 琦，郭天時(shí)，劉文博，劉 穎

（西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州 730030）

0 引言

膳食纖維是植物中的可食用部分，包括纖維素、菊粉、果膠等，是一些聚合度≥3的木質(zhì)素和碳水化合物[1]。膳食纖維對身體健康有很多益處：一是其不能被消化吸收但可通過發(fā)酵作用產(chǎn)生短鏈脂肪酸，基本不為人體供能；二是具有減少胃排空時(shí)間、調(diào)節(jié)腸道菌群、緩解便秘[2]，預(yù)防肥胖和結(jié)腸癌的作用；三是可通過調(diào)節(jié)人體糖分與脂肪代謝，預(yù)防和治療糖尿病[3]及心血管疾病[4]。目前，在面包、面條、米飯、飲料、冰激凌、乳制品和肉制品等食品中都有添加了膳食纖維的功能性食品。

馬鈴薯是繼小麥、水稻和玉米之后的第四大糧食作物，既可直接食用也可用于生產(chǎn)粉條、粉絲和淀粉等產(chǎn)品。同時(shí)，馬鈴薯還是重要的工業(yè)輔料，食品、紡織、醫(yī)藥等產(chǎn)業(yè)中都可以發(fā)現(xiàn)它的應(yīng)用。我國是馬鈴薯生產(chǎn)消費(fèi)大國，2007年以來，我國的馬鈴薯種植面積和生產(chǎn)產(chǎn)量位居世界領(lǐng)先行列[5]。由于缺乏科學(xué)的貯藏方法和設(shè)備，每年都會有大量的加工淀粉后殘留的副產(chǎn)物（馬鈴薯渣）得不到有效利用，不僅造成資源浪費(fèi)，還會出現(xiàn)占據(jù)貯藏空間、污染環(huán)境等問題。目前，馬鈴薯渣的再利用主要分為發(fā)酵制成新產(chǎn)品和提取有效成分。發(fā)達(dá)國家用于加工升值的馬鈴薯渣占比已達(dá)50%～70%，加工技術(shù)水平高、產(chǎn)品種類豐富[6]。例如，薯渣通過發(fā)酵和噴霧干燥等技術(shù)可生產(chǎn)薯片、動物飼料、乙醇、潤滑劑及生物氣體等產(chǎn)品。但我國薯渣通常被用作廢渣處理，只有少數(shù)被用于發(fā)酵利用，利用率極低，造成資源嚴(yán)重浪費(fèi)[7]。馬鈴薯渣水分含量高（85%左右），膳食纖維含量豐富（總膳食纖維含量達(dá)到28.46%）[8]，是重要的膳食纖維資源。利用馬鈴薯渣提取膳食纖維，可以有效提高馬鈴薯渣的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，提高企業(yè)競爭力和薯農(nóng)的收入，還能有效降低環(huán)境污染，促進(jìn)我國馬鈴薯加工產(chǎn)業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。

膳食纖維提取方法主要分為物理、化學(xué)及生物提取3類，屬于生物提取方法的酶解法是用多種酶（主要是蛋白酶、酯酶、淀粉酶等）降解其他組分，最后獲得膳食纖維的方法[9-10]。因其反應(yīng)條件溫和、副產(chǎn)物少、產(chǎn)品安全、節(jié)能環(huán)保等優(yōu)點(diǎn)受到很多學(xué)者的關(guān)注，尤其是原料中淀粉等糖分含量相對較高的制備工藝[11]。由于酶解法中所使用的酶只能特異性地降解某一類物質(zhì)，因此，通過聯(lián)合酶法提取，選取2種或2種以上的酶，如α-淀粉酶、蛋白酶和糖化酶等去除膳食纖維中含有的多糖、蛋白等雜質(zhì)，再用有機(jī)溶劑清洗抽濾，干燥后可得到百分含量較高的膳食纖維。因此，試驗(yàn)采用酶聯(lián)法提取膳食纖維，分別對提取過程中使用的2種酶——α-淀粉酶和糖化酶的酶解工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，以膳食纖維的百分含量為評價(jià)指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，來確定這2種酶的最佳工藝條件。

1 試驗(yàn)方法

1.1 馬鈴薯渣中基本成分的測定

膳食纖維、淀粉、水分、灰分、蛋白質(zhì)、脂肪分別參照 GB 5009.88—2014，GB/T 5009.9—2008，GB/T 5009.3—2010，GB/T5009.4—2010，GB/T5009.5—2010，GB/T 5009.6—2003所描述的方法進(jìn)行。膳食纖維百分含量計(jì)算公式如下：

式中：X——膳食纖維的占比，%；

mR1、mR2——雙份試樣殘?jiān)馁|(zhì)量，mg；

mP——試樣殘?jiān)械鞍踪|(zhì)的質(zhì)量，mg；

mA——試樣殘?jiān)谢曳值馁|(zhì)量，mg；

mB——空白的質(zhì)量，mg；

m1、m2——試樣的質(zhì)量，mg。

1.2 馬鈴薯渣提取膳食纖維的工藝流程

按料液比1∶12稀釋馬鈴薯渣（20.0 g） 并調(diào)節(jié)pH值，加入α-淀粉酶后用玻璃棒緩慢攪勻，然后置于恒溫水浴鍋中酶解一定時(shí)間。轉(zhuǎn)移至另一水浴鍋中滅活酶（100℃，8 min）后冷卻至室溫。然后，加入糖化酶并用玻璃棒攪均，按條件在水浴鍋中酶解一段時(shí)間后再轉(zhuǎn)移至另一水浴鍋中滅活酶（100℃，8 min），經(jīng)離心及干燥處理后得到馬鈴薯渣膳食纖維。按乙醇與試液體積比4∶1的比例，向酶解液中加入經(jīng)過預(yù)熱處理的乙醇（95%，60℃），于室溫條件下冷卻沉淀1 h靜置分離。依次用體積分?jǐn)?shù)78%乙醇（2次）、體積分?jǐn)?shù)95%乙醇（2次） 及丙酮（2次）洗滌殘?jiān)?，再抽濾去除洗滌液，將坩鍋和殘?jiān)^夜烘干（105℃），并計(jì)算試樣殘?jiān)|(zhì)量。

1.3 聯(lián)合酶解法提取馬鈴薯渣膳食纖維α-淀粉酶酶解條件的優(yōu)化

1.3.1 酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度和酶解pH值的確定

分別編好編號，采用單因素試驗(yàn)來確定α-淀粉酶的酶解條件（表1），α-淀粉酶酶解后滅活酶；添加糖化酶200 U/g，于60℃，30 min條件下酶解后，滅活酶，對殘?jiān)M(jìn)行洗滌、抽濾；放入烘箱中干燥，稱量后測定提取物中的膳食纖維百分含量；選擇提取物中膳食纖維百分含量最高的α-淀粉酶酶解條件作為參考設(shè)計(jì)之后的正交試驗(yàn)。

α-淀粉酶酶解工藝參數(shù)的確定見表1。

表1 α-淀粉酶酶解工藝參數(shù)的確定

1.3.2 工藝條件優(yōu)化

根據(jù)單因素試驗(yàn)得到的結(jié)果，確定正交試驗(yàn)因素水平表，進(jìn)一步優(yōu)化馬鈴薯α-淀粉酶酶解條件。以膳食纖維百分含量作為確定最優(yōu)工藝條件的依據(jù)。膳食纖維百分含量最高的組合即為馬鈴薯渣膳食纖維提取的最佳工藝組合。

正交因素與水平設(shè)計(jì)見表2。

表2 正交因素與水平設(shè)計(jì)

1.4 聯(lián)合酶解法提取馬鈴薯渣膳食纖維糖化酶酶解條件的優(yōu)化

1.4.1 糖化酶添加量、酶解時(shí)間、酶解溫度和酶解pH值的確定

按順序分別編好編號，利用1.3中確定的最佳α-淀粉酶酶解工藝進(jìn)行酶解反應(yīng)后，滅活酶，再添加糖化酶，采用單因素試驗(yàn)來確定糖化酶的酶解條件（表3），酶解后滅活酶，并對殘?jiān)M(jìn)行洗滌、抽濾，放入烘箱中干燥，稱量，再測定提取物中的膳食纖維百分含量。選擇提取物中膳食纖維含量最高的糖化酶酶解條件作為參考設(shè)計(jì)之后的正交試驗(yàn)。

糖化酶酶解工藝參數(shù)的確定見表3。

表3 糖化酶酶解工藝參數(shù)的確定

1.4.2 工藝條件的優(yōu)化

由于在不同的糖化酶添加量（A'）、酶解溫度（B'）、酶解時(shí)間（C'）、酶解pH值（D'）的條件馬鈴薯渣提取膳食纖維百分含量會有所不同，為了得到更佳的工藝參數(shù)，在單因素試驗(yàn)結(jié)論的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)了L9（34）正交試驗(yàn)。馬鈴薯渣膳食纖維提取單因素試驗(yàn)研究分析確定正交試驗(yàn)因素水平表（表4），以膳食纖維百分含量作為正交試驗(yàn)的指標(biāo)。膳食纖維百分含量最高的組合即為馬鈴薯渣膳食纖維提取的最佳工藝組合。

正交因素與水平設(shè)計(jì)見表4。

表4 正交因素與水平設(shè)計(jì)

1.5 馬鈴薯渣膳食纖維物化性質(zhì)的影響

挑選具有代表性的樣品，樣品的持水性和持油性參考高宇萍等人[12]和張華等人[13]描述的方法檢測，計(jì)算公式如下。

式中，m0——離心前干質(zhì)量，g；

m——離心后濕質(zhì)量，g。

式中：m1——離心管與沉淀物質(zhì)量，g；

m0——離心管質(zhì)量，g；

m——待測樣品質(zhì)量，g。

2 結(jié)果與討論

2.1 α-淀粉酶酶解條件對膳食纖維含量的影響

2.1.1 不同添加量的α-淀粉酶對膳食纖維含量的影響

酶添加量逐漸增加至250 U/g，其膳食纖維含量從59.25%持續(xù)提高至72.24%，但如果繼續(xù)增加酶的添加量，膳食纖維含量變化幅度不大，甚至?xí)霈F(xiàn)一定的下降趨勢。

不同α-淀粉酶添加量對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響見圖1。

圖1 不同α-淀粉酶添加量對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響

α-淀粉酶主要作用于馬鈴薯渣的淀粉類物質(zhì)，將其分解為小分子糖類，小分子糖類溶于水后被分離出來，提高了膳食纖維含量。因此，隨著酶添加量的增加，馬鈴薯渣中的淀粉分解得越來越徹底，進(jìn)而造成膳食纖維含量的增大，但進(jìn)一步增加酶的添加量，由于可供降解的底物不足，則不會進(jìn)一步提升酶解效果的情況。酶添加量為250 U/g時(shí)，膳食纖維含量最高為72.24%。以提取膳食纖維含量和盡量節(jié)約酶為標(biāo)準(zhǔn)，選擇200，250，300 U/g進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.2 α-淀粉酶酶解時(shí)間對膳食纖維含量的影響

酶促反應(yīng)初期，膳食纖維含量隨著時(shí)間的延長從54.14%升高至73.27%，酶解50 min得到最大值（73.27%），繼續(xù)增加酶解時(shí)間未顯著影響其含量。

不同酶解時(shí)間對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響見圖2。

圖2 不同酶解時(shí)間對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響

這主要是因?yàn)椋复呋孜镄枰欢ǖ拿附鈺r(shí)間，起初隨著酶解時(shí)間的延長，會使更多的底物參與到反應(yīng)中。但酶解一段時(shí)間后，底物濃度的降低，反應(yīng)效率會下降，進(jìn)一步延長時(shí)間則不會對其組成產(chǎn)生顯著影響。綜合考慮膳食纖維含量及效率問題，選擇40，50，60 min進(jìn)行后續(xù)正交試驗(yàn)。

2.1.3 α-淀粉酶酶解溫度對膳食纖維含量的影響

溫度由45℃升高至55℃，膳食纖維的含量則由62.77%升高至72.15%，但當(dāng)溫度超過55℃時(shí)，膳食纖維含量開始降低。

不同酶解溫度對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響見圖3。

圖3 不同酶解溫度對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響

這是因?yàn)槊富钍軠囟扔绊懀挥性谧钸m的酶解溫度下才能表現(xiàn)出最優(yōu)效果。升高溫度使酶逐漸接近最適溫度，進(jìn)而促進(jìn)酶的活性；進(jìn)一步升溫，則會使反應(yīng)溫度超過最適溫度，抑制酶活。綜上所述，可選擇50，55，60℃進(jìn)行后續(xù)正交分析試驗(yàn)。

2.1.4 α-淀粉酶酶解反應(yīng)pH值對膳食纖維含量的影響

當(dāng)酶解pH值達(dá)到6.0之前，提取膳食纖維含量變化曲線呈穩(wěn)定增長的趨勢（由64.89%升高至70.41%），但是pH值超過6.0之后，提取膳食纖維含量出現(xiàn)緩慢下降的趨勢（70.41%降至63.14%）。

不同酶解pH值對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響見圖4。

圖4 不同酶解pH值對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響

隨酶解體系pH值的升高，酶解pH值會先接近再遠(yuǎn)離最適pH值，酶活對應(yīng)地先增強(qiáng)再降低。綜上所述，酶解pH值為6.0時(shí)膳食纖維含量最高為70.41%，可選擇酶解pH值5.5，6.0，6.5進(jìn)行后續(xù)的正交分析試驗(yàn)。

2.1.5 馬鈴薯渣提取膳食纖維的工藝參數(shù)優(yōu)化

正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表5。

由表5可知，試驗(yàn)各因素對膳食纖維含量的影響主次順序?yàn)槊附鈺r(shí)間（B） ＞酶解溫度（C） ＞α-淀粉酶添加量（A） ＞酶解pH值（D）；極大值組合為A3B3C2D3，即α-淀粉酶添加量300 U/g，酶解時(shí)間60 min，酶解溫度55℃，酶解pH值6.5。該組合未在9組試驗(yàn)及之前的單因素試驗(yàn)中出現(xiàn)，最佳組合條件下進(jìn)行驗(yàn)證，膳食纖維含量為73.98%。同時(shí)，可說明酶解時(shí)間是影響可溶性膳食纖維含量的主因。

表5 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

2.2 糖化酶酶解條件對膳食纖維含量的影響

2.2.1 不同糖化酶添加量對膳食纖維含量的影響

隨糖化酶添加量由100 U/g增加到250 U/g，其膳食纖維含量由66.85%顯著升高至72.75%，但繼續(xù)添加糖化酶對膳食纖維含量影響不顯著。

不同酶添加量對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響見圖5。

圖5 不同酶添加量對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響

糖化酶主要將淀粉水解產(chǎn)物進(jìn)一步水解成葡萄糖，溶于水后被分離出來提高了膳食纖維的含量，但進(jìn)一步隨著酶的添加，由于可供降解的底物不足，則不會進(jìn)一步提升酶解效果。酶添加量為300 U/g時(shí)，馬鈴薯渣膳食纖維含量最高為72.77%，選擇200，250，300 U/g進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

2.2.2 酶解時(shí)間對膳食纖維含量的影響

隨著酶解時(shí)間從5 min增加到45 min，膳食纖維含量由64.24%增加至73.55%，繼續(xù)延長時(shí)間，對其含量影響不顯著。

不同酶解時(shí)間對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響見圖6。

圖6 不同酶解時(shí)間對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響

這主要是因?yàn)槊复呋孜镞M(jìn)行反應(yīng)需要一定的酶解時(shí)間，起初隨著酶解時(shí)間的延長，會使更多的底物參與到酶解中。但當(dāng)酶促反應(yīng)進(jìn)行到一定時(shí)間后，底物濃度降低，酶解效率下降，因此進(jìn)一步延長酶解時(shí)間未對其組成產(chǎn)生顯著影響。酶解時(shí)間為45 min時(shí)膳食纖維的含量最高為73.55%，選擇30，45，60 min進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

2.2.3 不同酶解溫度對膳食纖維含量的影響

50～60℃范圍內(nèi)，膳食纖維含量隨溫度升高由64.68%提高到73.86%，當(dāng)酶解溫度為60℃時(shí)，其含量最大為73.86%，但當(dāng)酶解溫度超過60℃時(shí)，其含量又由73.86%降低至64.91%。

不同酶解溫度對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響見圖7。

圖7 不同酶解溫度對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響

這可能因?yàn)槊富顣艿綔囟鹊挠绊?，?dāng)越來越接近于酶解最適溫度時(shí)，對酶的活性會起到促進(jìn)作用；進(jìn)一步升溫會逐漸遠(yuǎn)離最適酶解溫度，抑制反應(yīng)酶活性。綜上所述，可選擇55，60，65℃進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

2.2.4 不同酶解pH值對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響

當(dāng)酶解pH值達(dá)到4.0之前，提取含量變化曲線從68.73%穩(wěn)定增長至72.46%，但pH值超過4.0后，含量由72.46%緩慢下降至68.68%。

不同酶解pH值對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響見圖8。

酶活受pH值的影響，隨pH值的升高，體系會越來越接近于最適pH值，進(jìn)而促進(jìn)反應(yīng)酶的活性；進(jìn)一步升高酶解pH值，則會超過最適酶解pH值，進(jìn)而抑制反應(yīng)酶的活性。綜上所述，酶解pH為4.0時(shí)膳食纖維的含量最高為72.46%，可選擇3.5，4.0和4.5進(jìn)行后續(xù)的正交試驗(yàn)。

2.2.5 馬鈴薯渣提取膳食纖維的工藝參數(shù)優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果分析見表6。

圖8 不同酶解pH值對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響

表6 正交試驗(yàn)結(jié)果分析

由表6可知，試驗(yàn)各因素對馬鈴薯渣膳食纖維含量的影響主次順序?yàn)?A'＞D'＞C'＞B'，即酶添加量 ＞pH值＞酶解溫度＞酶解時(shí)間；最優(yōu)方案組合為A'2B'1C'3D'2，即糖化酶添加量250 U/g，酶解時(shí)間30 min，酶解溫度65℃，酶解pH值4.0。該組合并不在9次試驗(yàn)及之前的單因素試驗(yàn)中，對其驗(yàn)證的結(jié)果顯示，在最佳組合條件下試驗(yàn)取平均值得到膳食纖維含量為76.92%。

2.2.6 提取對馬鈴薯渣膳食纖維物化性質(zhì)的影響

對比薯渣與聯(lián)合酶解法（應(yīng)用優(yōu)化條件）得到的膳食纖維的物化性質(zhì)進(jìn)行分析。提取后樣品的持水性和持油性顯著升高。

物化性質(zhì)分析結(jié)果見表7。

表7 物化性質(zhì)分析結(jié)果/%

3 結(jié)論

選用聯(lián)合酶解法來提取馬鈴薯渣中的膳食纖維，研究首先通過單因素試驗(yàn)，逐個(gè)明確了α-淀粉酶和糖化酶這2個(gè)提取膳食纖維過程中對含量影響較大的酶解條件，再據(jù)此設(shè)計(jì)正交條件，進(jìn)一步優(yōu)化提取條件。最終得到聯(lián)合酶解法提取膳食纖維的工藝條件為：首先使用α-淀粉酶進(jìn)行酶解，酶解條件為酶添加量300 U/g，酶解時(shí)間60 min，酶解溫度55℃，酶解pH值6.5；滅活酶后，再利用糖化酶進(jìn)行酶解，酶解條件為酶添加量250 U/g，酶解時(shí)間30 min，酶解溫度65℃，酶解pH值4.0。在最佳組合條件下試驗(yàn)取平均值得到馬鈴薯渣膳食纖維含量為76.92%。

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