基于納米金的過氧化物模擬酶比色檢測樂果

鄒小波，石海軍，黃曉瑋，石吉勇，翟曉東，蔣彩萍，李志華

樂果是一種內(nèi)吸性有機磷農(nóng)藥，化學(xué)名稱為O,O-二甲基-S-（N-甲基氨基甲酰基）二硫代磷酸酯，其是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中最常使用的有機磷農(nóng)藥之一[1-2]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中使用的有機磷農(nóng)藥有很大一部分進入自然環(huán)境，對生態(tài)造成嚴重污染，現(xiàn)在有機磷農(nóng)藥在自然界的含量已被列為國際評判自然環(huán)境質(zhì)量重要參數(shù)[3-4]，所以建立快速、精確的農(nóng)藥檢測體系已尤為重要。

傳統(tǒng)的農(nóng)藥檢測方法有氣相色譜法[5]、高效液相色譜法[6]、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[7]等，這些方法雖然具有靈敏度高、可靠性強的優(yōu)勢，但檢測耗時長、儀器價格昂貴、需專業(yè)人士操作等缺點，所以不滿足現(xiàn)場檢測的需求；現(xiàn)場快速檢測方法有酶聯(lián)免疫法[8]、酶抑制法[9]等，但這些方法利用乙酰膽堿酶、植物酯酶等，這些生物蛋白具有制備成本高、受天然蛋白工作條件限制等缺點。所以建立便捷、精確、快速、低成本的可視化檢測方法更符合現(xiàn)場檢測的需要。

自從基于金納米粒子（gold nanoparticles，AuNPs）的比色檢測方法建立后，近年來其在生物分析和環(huán)境污染物檢測方面的應(yīng)用備受關(guān)注[10-12]。Weerathunge等[13]在AuNPs修飾上能特異性結(jié)合啶蟲脒的核酸適配體實現(xiàn)了對啶蟲脒高靈敏度的檢測，但適配體價格昂貴而且對環(huán)境條件要求苛刻限制了其在實際檢測中的應(yīng)用；Liu Yanpin等[14]發(fā)現(xiàn)帶負電的AuNPs具有過氧化物模擬酶活性，利用多巴胺吸附到AuNPs，減少3,3’,5,5,’-四甲基聯(lián)苯胺（3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine，TMB）藍色氧化產(chǎn)物生成，導(dǎo)致吸光度下降，從而實現(xiàn)對多巴胺的檢測，該檢測方法不僅檢測精度高，而且具有操作方便、成本低、貯存性能好等優(yōu)點；Momi?等[15]研究中發(fā)現(xiàn)有機磷農(nóng)藥樂果能穩(wěn)定有效地吸附在帶正電性的納米金表面；為了合成帶正電性的AuNPs過氧化物模擬酶采用金晶種生長法制備AuNPs，該AuNPs模擬酶比表面帶負電的AuNPs有更高的催化活性[16]；利用AuNPs模擬酶催化H2O2產(chǎn)生自由基氧化TMB，生成藍色氧化產(chǎn)物（ox-TMB），最后加入H2SO4穩(wěn)定反應(yīng)體系同時溶液變?yōu)辄S色，測定波長450 nm處紫外吸收峰信號。農(nóng)藥樂果能通過帶負電性的酰胺鍵結(jié)合在AuNPs表面，從而降低模擬酶的催化活性減少ox-TMB的生成，據(jù)此建立如圖1所示的便捷、快速、可視化的比色農(nóng)藥檢測方法。

圖1 AuNPs模擬酶檢測樂果的方法Fig. 1 Schematic of the detection of rogor with AuNPs as peroxidase mimetics

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶葉 八馬茶業(yè)有限公司；溴化十六烷基三甲銨（cetyl trimethylamine bromide，CTAB）、TMB、四水合氯金酸（HAuCl4·4H2O） 國藥集團（上海）化學(xué)試劑有限公司；樂果標(biāo)準品 北京世紀奧科生物技術(shù)有限公司；實驗所用試劑均為分析純，實驗用水均為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite PRO TWIN 200型酶標(biāo)儀 瑞士Tecan公司；JSM-7001F場發(fā)射掃描電鏡 日本電子株式會社；Nicolet is50型傅里葉紅外光譜儀 美國熱電賽默飛世爾有限公司；恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；85-2型恒溫磁力加熱攪拌器 江蘇省金壇市宏華儀器廠；TGL-15B型高速臺式離心機 上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 金晶種生長法制備AuNPs

在30 ℃恒溫水浴中向5 mL濃度為0.2 mol/L的CTAB溶液中加入5 mL濃度為0.5 mmol/L的氯金酸溶液，攪拌混勻后加入0.6 mL置于冰水浴中濃度為0.01 mol/L的硼氫化鈉溶液，反應(yīng)溶液由無色變?yōu)樽攸S色，最后700 r/min攪拌2 min并靜置2 h，得到AuNPs晶的金晶種溶膠[17]。

在5 mL濃度為0.2 mol/L的CTAB溶液中分別加入150 μL濃度為4 mmol/L的硝酸銀溶液和5 mL濃度為0.5 mmol/L的氯金酸溶液，攪拌均勻后緩慢加入70 μL濃度為78.8 mmol/L的VC溶液，VC將溶液立即由棕黃色還原至無色，將反應(yīng)溶液700 r/min攪拌2 min得到生長溶液；將12 μL金晶種溶膠加入10 mL生長液中200 r/min攪拌3 min溶液由無色變?yōu)樽霞t色，將溶液放置在35 ℃條件下12 h；最后取10 mL溶液在8 000 r/min條件下離心10 min，去掉上清液；加同樣量的去離子水，超聲處理2 min后，同樣條件下離心，得到濃度為1.41 nmol/L的AuNPs[18]。

1.3.2 AuNPs的表征

將一滴AuNPs溶液滴在經(jīng)過丙酮處理過的硅片上風(fēng)干后通過掃描電鏡測量AuNPs的平均直徑；測量400～900 nm全波段紫外吸收光譜，通過AuNPs長波縱向表面等離子體共振吸收峰的峰位與其軸比和粒子周圍介質(zhì)的介電常數(shù)的關(guān)系計算AuNPs的平均軸比，共振吸收峰的峰位按公式（1）計算[19]：

式中：λmax為AuNPs的長波縱向表面等離子體共振吸收峰的峰位/nm；R為AuNPs的平均軸比；εm為AuNPs周圍介質(zhì)的介電常數(shù)。

1.3.3 檢測機理

利用傅里葉變換紅外光譜圖研究樂果的活性基團結(jié)合到AuNPs表面的機理。在1 mL未稀釋的AuNPs溶液中加入1 mL 1 mg/mL樂果溶液，在微型振蕩器上振蕩1 min后35 ℃濕盒溫育30 min制得待測液；用壓片法在傅里葉變換紅外光譜儀上進行測定，儀器參數(shù)為：波數(shù)范圍400～4 000 cm－1，分辨率4 cm－1，掃描總數(shù)32 次，環(huán)境溫度22 ℃。

1.3.4 建立標(biāo)準曲線和特異性

先將樂果農(nóng)藥標(biāo)準品用丙酮配制成1、20、40、60、80 mmol/L不同梯度的溶液。測定樂果的標(biāo)準曲線如下，第1步：用微量加樣器依次取40 μL pH 4.0的鄰苯二甲酸氫鉀緩沖液、不同梯度的有機磷農(nóng)藥溶液、1.41 nmol/L AuNPs溶液加入到無色96 孔板樣孔中，在微型振蕩器上振蕩1 min后35 ℃濕盒溫育30 min；第2步，向上述反應(yīng)溶液中加入40 μL 5 mmol/L TMB溶液和40 μL 50 mmol/L H2O2溶液，在微型振蕩器上振蕩1 min后35 ℃濕盒育30 min，最后加入50 μL濃度為2 mmol/L硫酸溶液終止反應(yīng)，溶液由藍色變?yōu)辄S色，測定溶液在波長450 nm處測定吸光度（A450nm），以樂果濃度為橫坐標(biāo)、抑制率為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準曲線，其中抑制率按公式（2）計算：

式中：A0為未加入農(nóng)藥的吸光度；A1為未加入TMB反應(yīng)溶液的吸光度；A2為加入不同濃度樂果后的吸光度。

檢出限按公式（3）計算：

式中：LOD為檢出限；SD空白和b分別為空白對照和抑制率標(biāo)準曲線斜率的標(biāo)準偏差[20]。

為研究本檢測方法的特異性，及其他農(nóng)藥的對檢測結(jié)果的影響，實驗選用與樂果結(jié)構(gòu)相似的乙酰甲胺磷、帶負電的敵百蟲、殺螟松、氯甲磷和滅線磷有機磷農(nóng)藥，在農(nóng)藥濃度為100 mmol/L條件下測試其單獨作用時的抑制率，研究不同農(nóng)藥對AuNPs模擬酶活性的影響。

1.3.5 茶葉樣品中的樂果檢測

回收率實驗是通過標(biāo)準加入法，將已知量的樂果標(biāo)準品加入至綠茶葉提取液中進行檢測，參照文獻[21]進行預(yù)處理。具體步驟：稱量1 g樣品茶到50 mL的圓底燒瓶中，加入10 mL二氯甲烷，并進行15 min的超聲振蕩。此提取振蕩過程重復(fù)3 次，濾除葉渣，收集濾液。隨后，取提取的混合液至旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器進行蒸發(fā)濃縮；接著，加入不同濃度的樂果標(biāo)準品，均勻混合；最終，收集上清液根據(jù)1.3.4節(jié)步驟進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 AuNPs表征結(jié)果

圖2 AuNPs掃描電鏡圖（a）和紫外吸收光譜（b）Fig. 2 TEM image (a) and UV-Vis absorption spectrum of AuNPs (b)

以CTAB作為穩(wěn)定劑，VC為還原劑的金晶種生長法制備得到表面帶正電性的AuNPs。由圖2a可知，掃描電鏡的結(jié)果顯示AuNPs的平均直徑為25 nm，由圖2b可知，種子液生長法制備的AuNPs在波長540 nm和735 nm處有2 個吸收峰[17]，在波長540 nm處的吸收峰是電子沿長軸方向的共振引起的短波橫向表面等離子體共振吸收峰，在波長735 nm處的峰是電子沿短軸方向的共振引起的長波縱向表面等離子體共振吸收峰；根據(jù)長軸的峰的位置確定AuNPs的軸向比為1.35。

2.2 檢測機理

圖3 傅里葉變換紅外光譜圖Fig. 3 Fourier transform infrared spectrum of AuNPs rogor

如圖3A所示，樂果出現(xiàn)明顯的吸收峰，1 644 cm－1處的吸收峰是酰胺I譜帶C＝O的伸縮振動，1 566 cm－1處的吸收峰是酰胺II譜帶C—N的伸縮振動，3 088 cm－1和3 252 cm－1處的吸收峰來自于C—N中酰胺III譜帶和N—H的振動[22]。AuNPs的吸收峰主要是其表面的CTAB的吸收峰（圖3B），2 845 cm－1和2 914 cm－1對應(yīng)CH3的對稱伸縮振動和不對稱伸縮振動，C—N的伸縮振動峰出現(xiàn)在960 cm－1。樂果加入到AuNPs后（圖3C），酰胺I譜帶的吸收峰向頻率高位遷移至1 652 cm－1，酰胺II譜帶遷移到1 555 cm－1，而N—H鍵的吸收峰遷移到了3 078 cm－1和3 274 cm－1處且譜帶范圍變寬；CH3的對稱和不對稱伸縮振動峰分別遷移到2 852 cm－1和2 924 cm－1，而且C—N吸收峰遷移到了968 cm－1。通過傅里葉變換紅外光譜的變化推斷樂果可能是通過酰胺鍵結(jié)合到AuNPs表面的CTAB上，降低AuNPs周圍由H2O2產(chǎn)生的羥自由基局部濃度，從而抑制AuNPs的過氧化物酶活性[23-26]。

2.3 AuNPs過氧化物模擬酶催化活性分析及實驗條件優(yōu)化

圖4 不同混合組分吸收光譜和反應(yīng)機理Fig. 4 Absorption spectra of different reaction products and schematic of molecular reaction mechanism

為了證明AuNPs模擬酶催化活性，分析在顯色反應(yīng)中單一物質(zhì)、兩兩物質(zhì)混合后的全波段吸收光譜和顏色變化。用AuNPs作為催化劑，在H2O2存在和不存在的情況下對典型的過氧化物酶底物TMB進行催化顯色實驗。結(jié)果表明，當(dāng)AuNPs加入TMB與H2O2的反應(yīng)體系中才能顯色，而且反應(yīng)體系在波長450 nm處具有最大吸光度，如圖4a～c所示，其反應(yīng)式如圖4d所示；在本實驗建立的催化顯色反應(yīng)體系中，H2O2在水中能電離產(chǎn)生過氧根孤對電子，且AuNPs中的Au核外電子軌道有空軌道容易配位過氧根；在弱酸環(huán)境中過氧根的O—O鍵可被打斷形成羥自由基（·OH），所以AuNPs周圍羥自由基局部濃度增高[16]，從而能夠催化H2O2氧化TMB，體現(xiàn)出其過氧化物模擬酶活性[27-28]。

圖5 反應(yīng)條件優(yōu)化圖Fig. 5 Optimization of reaction conditions

AuNPs的催化顯色速率依賴于pH值、溫度、TMB濃度和H2O2濃度。固定加入40 μL AuNPs通過改變pH值從1.0～9.0，溫度從20～55 ℃，TMB濃度從0～3 mmol/L，過氧化氫濃度從3～60 mmol/L，測量反應(yīng)液體的吸光度后比較相對催化活性（A450nm/Amax），相對催化活性最大時的條件為最佳條件。如圖5所示，AuNPs反應(yīng)的最佳條件是pH 4.0、溫度35 ℃、TMB濃度1 mmol/L和H2O2濃度10 mmol/L。因為在pH值為4的條件下，溶液中H＋有利于H2O2配位在AuNPs表面產(chǎn)生自由基，促進催化反應(yīng)的進行；模擬酶在廣泛的溫度范圍內(nèi)保持良好的催化性能；適量濃度的雙氧水有利于催化反應(yīng)的進行，但當(dāng)濃度過高時，會抑制TMB顯色且容易發(fā)生非特異性反應(yīng)產(chǎn)生黑色沉淀；作為顯色底物的TMB在濃度升高時有利于催化反應(yīng)的進行。

2.4 抑制率標(biāo)準曲線的建立和特異性

在最優(yōu)條件下測定樂果農(nóng)藥，抑制率與樂果濃度在1～80 mmol/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為y=0.527x＋3.881（y為抑制率，x為樂果濃度），相關(guān)系數(shù)為0.985。檢出限為1.39 mmol/L。

為研究本檢測方法的特異性，及其他農(nóng)藥對檢測結(jié)果的影響，實驗選用與樂果結(jié)構(gòu)相似的乙酰甲胺磷、帶負電的敵百蟲、殺螟松、氯甲磷和滅線磷有機磷農(nóng)藥在100 mmol/L濃度條件下單獨進行測試。如圖6所示，分子結(jié)構(gòu)中含有酰胺鍵的樂果和乙酰甲胺磷的抑制率遠高于其他4 種沒有酰胺鍵的農(nóng)藥，所以該方法能特異性的檢測樂果這一類帶有帶酰胺鍵的農(nóng)藥。

圖6 6 種有機磷農(nóng)藥的抑制率（a）及其化學(xué)結(jié)構(gòu)（b～g）Fig. 6 Inhibitory rates of six organophosphorus pesticides (a) and chemical structures of six organophosphorus pesticides (b-g)

2.5 茶葉樣本中樂果的檢測結(jié)果

為了研究該方法在實際綠茶葉樣本中檢測樂果農(nóng)藥的可行性與可靠性，利用標(biāo)準加入法進行考察。按照1.3.5節(jié)步驟處理3 個不同樂果農(nóng)藥梯度的茶葉樣本，然后按照1.3.4節(jié)方法進行檢測分析。如表1所示，數(shù)據(jù)表明在茶葉實際樣本中樂果農(nóng)藥的回收率范圍為91.36%～102.56%，相對標(biāo)準偏差小于5%。結(jié)果表明該方法可以準確的在實際樣品中分析樂果農(nóng)藥殘留。

表1 茶葉中樂果的檢測結(jié)果Table 1 Determination of rogor in tea by the proposed method

2.6 AuNPs的穩(wěn)定性

將AuNPs放在室溫避光貯存，每隔15 d取出在最佳反應(yīng)條件下進行反應(yīng)，以催化TMB顯色反應(yīng)后于波長450 nm處的吸光度代表催化活性，由圖7a可知，在室溫貯存15 d，吸光度保持0.32，催化活性基本無影響；在室溫貯存30 d，吸光度為0.3，依然具有良好的催化性能；貯存75 d后，AuNPs基本失活。實驗結(jié)果表明AuNPs在貯存過程中能保持良好的穩(wěn)定性。由圖7b可知，AuNPs在貯存75 d后粒子由直徑25 nm團聚成直徑400 nm的球狀大顆粒子，團聚現(xiàn)象可能是造成AuNPs酶催化活性降低的原因。據(jù)文獻[29]記載CTAB以單室囊泡形式均勻的包裹在AuNPs表面，只有當(dāng)表面的CTAB囊泡含量較低時，AuNPs易形成聚集狀態(tài)；并且因為囊泡結(jié)構(gòu)的物質(zhì)在水中的溶解度小，遷移的速度慢，相對層狀結(jié)構(gòu)有熵增加的特點，所以其在水中具有保存幾周至幾個月的穩(wěn)定性[30-31]；由于CTAB囊泡在水中的穩(wěn)定性好的特點，也增加了AuNPs貯存中的穩(wěn)定性。

圖7 AuNPs在室溫貯存不同時間的催化活性（a）和貯存75 d后的AuNPs掃描電鏡圖（b）Fig. 7 Reactivity after different days of storage (a) and scanning electron micrograph after 75 days of storage (b)

3 結(jié) 論

本實驗實現(xiàn)了AuNPs作為過氧化物模擬酶對有機磷農(nóng)藥樂果的快速檢測方法。AuNPs能夠催化過氧化氫典型的酶底物TMB產(chǎn)生顯色反應(yīng)，說明其具有過氧化物酶活性；有機磷農(nóng)藥樂果能結(jié)合到AuNPs表面從而降低過氧化物酶活性。在最優(yōu)條件下，樂果在1～80 mmol/L濃度范圍內(nèi)與抑制率呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)R2為0.985，檢出限為1.39 mmol/L；并且該方法能特異性檢測實際樣品中帶有酰胺鍵的農(nóng)藥殘留。此外，實驗證明AuNPs室溫條件下避光存放1 個月依然能保持良好的催化活性并能實現(xiàn)樂果有效的檢測，具有良好的貯存特性。

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