自組裝法制備丁香酚納米膠囊及其性能表征

張 力，張 娟，馬凌艷，王 綪，丁 武*

納米技術(shù)包埋食品添加劑制備緩釋型納米膠囊在食品領(lǐng)域中應(yīng)用廣泛[1]，與宏觀狀態(tài)下食品性質(zhì)與功能相比，將食品材料納米化可賦予食品許多優(yōu)良性質(zhì)[2]，包括風(fēng)味、質(zhì)構(gòu)、加工性能[3]以及貨架期的穩(wěn)定性[4]等。自組裝是包埋生物活性化合物的有效途徑，其定義為基本結(jié)構(gòu)單元（分子、納米材料等）在氫鍵、親疏水作用、范德華力、靜電力等非共價(jià)鍵作用力下，自發(fā)形成有序結(jié)構(gòu)或形態(tài)的過程[5-6]，制備過程簡單，易操作，不需使用交聯(lián)劑，可以產(chǎn)生穩(wěn)定的納米尺寸顆粒[7]。

丁香酚（4-烯丙基-2-甲氧基苯酚）是從桃金娘科丁香屬植物提取的天然酚類化合物，是丁香精油中主要的抑菌成分，作為植物源天然食品防腐抗菌劑，其抑菌譜廣，兼?zhèn)淇寡趸?，但其不溶于水、易揮發(fā)、穩(wěn)定性差[8]，直接應(yīng)用難以保證其功能得到充分發(fā)揮，在食品實(shí)際應(yīng)用中受到一定的限制[9-10]。將丁香酚作為芯材制成緩釋型納米膠囊，可以達(dá)到緩慢釋放、延長抑菌作用時(shí)間、提高其生物利用度的效果，目前成為研究的熱點(diǎn)[11-12]。殼聚糖是一種經(jīng)甲殼素脫乙?；苌奶烊划a(chǎn)物，是具有廣泛來源的唯一陽離子多糖，由于其無毒性，具備良好的生物相容性、生物可降解性以及成凝膠、成顆粒的能力，被用作各種維生素、蛋白質(zhì)、營養(yǎng)素和酚類化合物的外包封材料[13-19]。明膠來源于膠原蛋白，除缺乏色氨酸外，各類氨基酸豐富，能通過靜電力、氫鍵等相互作用與其他活性物質(zhì)相結(jié)合，被廣泛用作食品納米載體材料[20-24]。

本實(shí)驗(yàn)選用明膠、殼聚糖作為載體，采用自組裝制備丁香酚-明膠-殼聚糖納米膠囊（eugenol-gelatin-chitosan nanocapsule，Euo-Gel-CS NPs），通過正交試驗(yàn)得到最佳制備工藝條件，采用包封率、緩釋效果和納米表征方法，評價(jià)Euo-Gel-CS NPs形態(tài)、微觀結(jié)構(gòu)和活性成分含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

殼聚糖（脫乙酰度≥95%） 上海阿拉丁試劑有限公司；明膠 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；丁香酚（純度99%） 上海麥克林生化科技有限公司；冰醋酸、氫氧化鈉 廣東光華科技股份有限公司；乙醇 成都市科隆化學(xué)品有限公司；所用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

MS-01H恒溫測速磁力攪拌器 美國精祺有限公司；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋 天津市泰斯特儀器有限公司；pHS-3C精密pH計(jì) 上海日島科學(xué)儀器有限公司；UV-1900雙光束紫外-可見分光光度計(jì) 上海佑科儀器儀表有限公司；ZS90激光粒度分析儀 英國馬爾文儀器有限公司；HT7700透射電子顯微鏡 日立高新技術(shù)公司；Vetex 70傅里葉變換紅外光譜儀 德國布魯克公司；Q2000差示掃描量熱儀 美國TA公司；HC-3018R高速冷凍離心機(jī) 安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 丁香酚標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

根據(jù)韓春然等[25]描述方法稍作改進(jìn)，用無水乙醇溶解1 mg/L丁香酚對照品，配制成不同質(zhì)量濃度梯度的丁香酚溶液，橫坐標(biāo)為丁香酚質(zhì)量濃度，縱坐標(biāo)為吸光度，得到丁香酚標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為y=22.62x－0.053 2，R2=0.999。

1.3.2 可溶性明膠-殼聚糖復(fù)合物的制備

稱取一定量的殼聚糖和明膠，分別溶解于0.5%醋酸溶液和超純水中，制備成2 mg/mL的殼聚糖溶液和2 mg/mL明膠溶液，用0.45 μm的微孔濾膜過濾，將殼聚糖溶液緩慢滴入明膠溶液中（使明膠-殼聚糖質(zhì)量比分別為1∶1、2∶1、3∶1、4∶1、5∶1、6∶1、7∶1），調(diào)節(jié)pH值至6.0，轉(zhuǎn)速800 r/min攪拌30 min，60 ℃水浴加熱20 min，在600 nm波長處測定各混合溶液的吸光度，空白對照為2 mg/mL殼聚糖溶液，測定其吸光度，利用ZS90激光粒度分析儀進(jìn)行粒徑分析，得到可溶性復(fù)合物最佳質(zhì)量比。

1.3.3 Euo-Gel-CS NPs的制備

量取一定體積丁香酚液體，溶于40%乙醇溶液，與2 mg/mL殼聚糖溶液均勻混合后（殼聚糖-丁香酚質(zhì)量比固定為1∶2），逐滴緩慢加入2 mg/mL明膠溶液中，轉(zhuǎn)速為800 r/min，室溫狀態(tài)下攪拌10 min后，調(diào)節(jié)體系pH值至6.0，勻速攪拌30 min后，60 ℃水浴加熱20 min，即形成Euo-Gel-CS NPs。

1.3.4 單因素試驗(yàn)

分別以殼聚糖質(zhì)量濃度（0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mg/mL）、明膠質(zhì)量濃度（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0 mg/mL）、交聯(lián)時(shí)間（10、20、30、40、60 min）、轉(zhuǎn)速（600、700、800、900、1 000 r/min）、丁香酚質(zhì)量濃度（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL）為單因素試驗(yàn)條件，考察其對Euo-Gel-CS NPs粒徑及包封率的影響。

1.3.5 正交試驗(yàn)

基于單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取殼聚糖質(zhì)量濃度、明膠質(zhì)量濃度、丁香酚質(zhì)量濃度進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)，固定條件為轉(zhuǎn)速800 r/min以及交聯(lián)時(shí)間30 min，試驗(yàn)因素與水平見表1。綜合加權(quán)評分根據(jù)武陶等[26]描述方法稍作改進(jìn)，包封率占60%權(quán)重，粒徑占40%權(quán)重，其加權(quán)分?jǐn)?shù)為粒徑與包封率按照權(quán)重相加而得，確定制備Euo-Gel-CS NPs的最優(yōu)制備工藝。

表1 正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Code and level of independent variables used in orthogonal array design

1.3.6 包封率的測定

精確吸取5 mL的Euo-Gel-CS NPs溶液于Ultra-15超濾離心管，4 000 r/min轉(zhuǎn)速離心30 min，截留Euo-Gel-CS NPs，分離出未被包埋的丁香酚芯材部分，在282 nm波長處測定其吸光度，通過丁香酚標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算平均包封率。包封率按公式（1）計(jì)算：

1.3.7 粒徑分布的測定和形態(tài)觀察

采用ZS90激光粒度分析儀測定其粒徑大小及分布。取Euo-Gel-CS NPs懸浮液，用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%磷鎢酸復(fù)染后置于銅網(wǎng)上，自然干燥后，置于樣品臺(tái)上用透射電子顯微鏡觀察顆粒的外觀形態(tài)。

1.3.8 Euo-Gel-CS NPs的傅里葉變換紅外光譜分析

分別取干燥明膠、殼聚糖、丁香酚、Euo-Gel-CS NPs與純KBr粉末質(zhì)量比為1∶100混合，分別研磨成細(xì)粉末，壓成片狀，使用純KBr粉末作為背景。光譜數(shù)值范圍為500～4 000 cm－1進(jìn)行掃描，分辨率為2 cm－1。

1.3.9 Euo-Gel-CS NPs的差示掃描量熱分析

以殼聚糖、明膠、丁香酚粉末、明膠-殼聚糖復(fù)合物和Euo-Gel-CS NPs凍干顆粒為樣品，每份樣品測試質(zhì)量范圍保持5～7 mg，溫度升高速率10 ℃/min，掃描樣品溫度范圍25～225 ℃。

1.3.10 Euo-Gel-CS NPs體外釋放實(shí)驗(yàn)

精確稱取Euo-Gel-CS NPs 10 mg，于截留分子質(zhì)量為10 kDa的透析袋中，加入5 mL PBS緩沖液（pH 7.4）使其完全溶解，置于裝有50 mL PBS的小燒杯中，封口膜密封。37 ℃恒溫100 r/min振蕩。分別于1、2、4、10、12 h取5 mL透析液在282 nm波長處測定吸光度，并向體系補(bǔ)加5 mL PBS緩沖液（pH 7.4）使其完全溶解，置于裝有50 mL PBS的小燒杯中，封口膜密封。37 ℃恒溫100 r/min振蕩。分別于1、2、4、10、12 h取5 mL透析液在282 nm波長處測定吸光度，并向體系補(bǔ)加5 mL PBS溶液以保持后續(xù)被測定透析液的體積，采用PBS緩沖溶液為對照，由標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算丁香酚含量。體外釋放率按公式（2）計(jì)算：

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用Excel 2007及SPSS 20進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，新復(fù)極差法（Duncan’s multiple）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，在P＜0.05和P＜0.01水平下進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 可溶性明膠-殼聚糖復(fù)合物的制備結(jié)果

圖1 不同質(zhì)量比明膠-殼聚糖吸光度、粒徑測定結(jié)果Fig. 1 Effect of gelatin to chitosan on absorbance and particle size

如圖1所示，第1階段：明膠-殼聚糖質(zhì)量比小于3∶1，溶液體系pH值為6.0，介于殼聚糖解離常數(shù)與明膠的等電點(diǎn)之間，殼聚糖和明膠間發(fā)生靜電作用形成可溶性絡(luò)合物，明膠在加熱時(shí)變性凝膠化得到微型納米尺度凝膠，發(fā)生了靜電自組裝。第2階段：隨明膠-殼聚糖質(zhì)量比增加，溶液pH值超過靜電平衡點(diǎn)，體系形成肉眼可見的不可溶性凝膠顆粒，吸光度與粒徑均增大。體系中明膠-殼聚糖質(zhì)量比為3∶1時(shí)，溶液出現(xiàn)淡藍(lán)色乳光且有丁達(dá)爾效應(yīng)，粒徑達(dá)到最小值為182.34 nm，明膠與殼聚糖產(chǎn)生糖基化反應(yīng)，體系趨于穩(wěn)定，為制備可溶性復(fù)合物創(chuàng)造最佳條件。

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 殼聚糖質(zhì)量濃度對粒徑及包封率的影響

圖2 殼聚糖質(zhì)量濃度對粒徑及包封率的影響Fig. 2 Effect of chitosan concentration on particle size and encapsulation efficiency

由圖2可知，隨著殼聚糖質(zhì)量濃度的增加，Euo-Gel-CS NPs的粒徑以近似直線的趨勢上升，各組間均有顯著性差異（P＜0.01）。體系中殼聚糖分子增多，除交聯(lián)外還存在殼聚糖和明膠分子間多形式的相互作用[27]，導(dǎo)致體系納米粒徑增大。同時(shí)包封率呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，殼聚糖質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，包封率達(dá)到最大值為46.67%（P＜0.01），殼聚糖質(zhì)量濃度大于2 mg/mL時(shí)，隨殼聚糖質(zhì)量濃度增加，體系黏度增大，阻礙了體系內(nèi)分子自由運(yùn)動(dòng)，導(dǎo)致Euo-Gel-CS NPs包封率降低。

2.2.2 明膠質(zhì)量濃度對粒徑及包封率的影響

圖3 明膠質(zhì)量濃度對粒徑及包封率的影響Fig. 3 Effect of gelatin concentration on particle size and encapsulation efficiency

由圖3可知，當(dāng)明膠質(zhì)量濃度較低時(shí)，難以滿足交聯(lián)要求，體系Euo-Gel-CS NPs包封率較低，粒徑較??；隨著明膠質(zhì)量濃度增加，明膠與丁香酚非共價(jià)鍵相互作用增強(qiáng)，包埋效果明顯增加[28]。當(dāng)明膠質(zhì)量濃度為2 mg/mL時(shí)，包封率達(dá)到最大值為46.67%（P＜0.05），明膠質(zhì)量濃度超過2 mg/mL，顆粒包封率下降，其原因可能為殼聚糖分子與明膠分子鏈端的—COOH與—NH2基團(tuán)發(fā)生分子間相互作用，占據(jù)了有效作用位點(diǎn)，同時(shí)粒徑增大。明膠質(zhì)量濃度過高，體系穩(wěn)定性差，易于析出不溶性物質(zhì)，Euo-Gel-CS NPs難以形成。

2.2.3 交聯(lián)時(shí)間對粒徑及包封率的影響

圖4 交聯(lián)時(shí)間對粒徑及包封率的影響Fig. 4 Effect of cross-linking time on particle size and encapsulation efficiency

由圖4可知，交聯(lián)時(shí)間較短時(shí)有效交聯(lián)Euo-Gel-CS NPs難以形成。交聯(lián)時(shí)間最佳值為30 min，體系粒徑達(dá)到最小值為243.50 nm（P＜0.05），包封率達(dá)到最大值為46.67%（P＜0.05），且體系穩(wěn)定；交聯(lián)時(shí)間延長，明膠與殼聚糖分子黏度降低，顆粒包封率下降，導(dǎo)致顆粒形態(tài)不規(guī)則、分散度不佳。

2.2.4 轉(zhuǎn)速對粒徑及包封率的影響

圖5 轉(zhuǎn)速對粒徑及包封率的影響Fig. 5 Effects of stirring speed on particle size and encapsulation efficiency

由圖5可知，轉(zhuǎn)速過低時(shí)丁香酚和殼聚糖溶液滴加到明膠溶液后不能立即充分分散，造成混合體系中局部濃度過高，不能發(fā)生有效交聯(lián)。隨著轉(zhuǎn)速的增加，基團(tuán)間交聯(lián)充分，當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到最優(yōu)值800 r/min時(shí)，Euo-Gel-CS NPs粒徑達(dá)最小值為237.60 nm（P＜0.05），包封率達(dá)到最大值為45.53%（P＜0.05）。超過最佳轉(zhuǎn)速時(shí)，過高的轉(zhuǎn)速形成了高剪切力，破壞了體系殼聚糖與明膠分子的內(nèi)部結(jié)構(gòu)和體系穩(wěn)定性，溶液出現(xiàn)分子凝聚，使得包封率降低，Euo-Gel-CS NPs粒徑增大。

2.2.5 丁香酚質(zhì)量濃度對粒徑及包封率的影響

圖6 丁香酚質(zhì)量濃度對粒徑及包封率的影響Fig. 6 Effect of eugenol concentration on particle size and encapsulation efficiency

如圖6所示，少量丁香酚分子吸附在明膠分子表面，并未與其形成包附作用，通過高速離心力可以使其小分子分離，導(dǎo)致Euo-Gel-CS NPs包封率較小，丁香酚質(zhì)量濃度為4 mg/mL時(shí)，殼聚糖、明膠、丁香酚分子達(dá)到最優(yōu)配比，包封率為48.02%（P＜0.05），觀察體系溶液出現(xiàn)淡藍(lán)色乳光，略有丁香香氣，氣味柔和不刺激。過量的丁香酚影響明膠分子內(nèi)的氫鍵相互作用，導(dǎo)致明膠自身網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)被破壞使粒徑增大，包封率降低。

2.3 正交試驗(yàn)結(jié)果

在得到的最佳單因素條件為轉(zhuǎn)速800 r/min、殼聚糖質(zhì)量濃度2 mg/mL、明膠質(zhì)量濃度2 mg/mL、明膠-殼聚糖質(zhì)量比3∶1、交聯(lián)時(shí)間30 min、丁香酚質(zhì)量濃度4 mg/mL基礎(chǔ)上，進(jìn)行殼聚糖質(zhì)量濃度、明膠質(zhì)量濃度和丁香酚質(zhì)量濃度三因素三水平的正交試驗(yàn)。Euo-Gel-CS NPs制備的正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with response variables

3 個(gè)因素的影響主次順序?yàn)椋好髂z質(zhì)量濃度＞殼聚糖質(zhì)量濃度＞丁香酚質(zhì)量濃度。觀察正交試驗(yàn)的各加權(quán)分?jǐn)?shù)，最優(yōu)為93.66分，得出制備Euo-Gel-CS NPs的最優(yōu)組合為A2B2C3，最優(yōu)制備工藝為殼聚糖質(zhì)量濃度2 mg/mL、明膠質(zhì)量濃度2 mg/mL、丁香酚質(zhì)量濃度5 mg/mL，調(diào)節(jié)pH值至6.0，轉(zhuǎn)速800 r/min，交聯(lián)時(shí)間30 min，攪拌結(jié)束后在60 ℃水浴加熱20 min。經(jīng)驗(yàn)證得Euo-Gel-CS NPs粒徑為229.09 nm，包封率達(dá)到50.69%。

2.4 Euo-Gel-CS NPs的表征

2.4.1 Euo-Gel-CS NPs的粒徑大小、分布和形態(tài)

圖7 Euo-Gel-CS NPs粒徑分布Fig. 7 Particle size distribution of Euo-Gel-CS NPs

由圖7可知，最優(yōu)制備工藝下Euo-Gel-CS NPs的平均粒徑為229.09 nm，粒徑分布系數(shù)為0.251，小于0.3，證明Euo-Gel-CS NPs的分散性良好，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖8 Euo-Gel-CS NPs的透射電鏡圖Fig. 8 TEM micrograph of Euo-Gel-CS NPs

由圖8可知，Euo-Gel-CS NPs顆粒呈較規(guī)則圓形，粒徑均勻，形態(tài)飽滿，粒徑約為220 nm，與激光粒度儀測量結(jié)果一致。

2.4.2 紅外光譜分析

圖9 傅里葉變換紅外光譜檢測結(jié)果Fig. 9 FTIR spectra

由圖9可知，殼聚糖在1 597 cm－1的吸收峰是—NH2的伸縮振動(dòng)，而Euo-Gel-CS NPs的傅里葉紅外光譜在1 539 cm－1出現(xiàn)了新峰，說明殼聚糖—NH2與明膠的—COOH相互作用形成了C—N鍵；丁香酚—OH伸縮振動(dòng)在3 452 cm－1處有吸收峰，Euo-Gel-CS NPs在3 500～3 300 cm－1內(nèi)出現(xiàn)一個(gè)寬峰，說明納米膠囊中存在較強(qiáng)的氫鍵。明膠傅里葉紅外光譜圖顯示了典型的酰胺I和II峰分別在1 674 cm－1和1 539 cm－1處，酰胺I帶的吸收主要是由于C＝O伸縮振動(dòng)，而酰胺II帶由C—N拉伸和C—N—H在平面彎曲兩者組成[29]，丁香酚在1 423 cm－1處的吸收峰是—OCH中C—O伸縮振動(dòng)，Euo-Gel-CS NPs的吸收峰在1 651 cm－1和1 047 cm－1處，表現(xiàn)出向低波數(shù)的轉(zhuǎn)移，表明丁香酚和明膠-殼聚糖之間的作用主要由氫鍵和疏水相互作用組成，與文獻(xiàn)[30]中結(jié)果一致，傅里葉變換紅外光譜技術(shù)的定性分析是確定丁香酚裝載到納米顆粒中的直接方法，反映丁香酚的成功裝載。

2.4.3 差示掃描量熱分析結(jié)果

圖10 差示掃描量熱分析圖Fig. 10 DSC curves

如圖10所示，丁香酚在152 ℃有一個(gè)較寬的放熱峰；在98、147、173 ℃位置明膠均有吸熱峰；殼聚糖吸熱峰分別在137、163 ℃出現(xiàn)。明膠-殼聚糖復(fù)合物的差示掃描量熱分析圖顯示在59 ℃的吸熱峰和在171 ℃的吸熱峰，出現(xiàn)吸熱峰融合的現(xiàn)象，說明明膠與殼聚糖分子發(fā)生靜電作用形成了復(fù)合凝聚絡(luò)合物。Euo-Gel-CS NPs僅在較高溫度（150 ℃）顯示吸熱峰，說明三者之間發(fā)生強(qiáng)相互作用[31]，促使化學(xué)鍵交聯(lián)形成結(jié)構(gòu)緊密的納米顆粒，與紅外光譜圖結(jié)果相符。

2.4.4 體外釋放實(shí)驗(yàn)分析

圖11 Euo-Gel-CS NPs體外釋放率Fig. 11 Release rate of Euo-Gel-CS NPs in vitro

如圖11所示，在37 ℃的條件下，Euo-Gel-CS NPs在6 h和8 h后丁香酚釋放率分別為34.02%和43.12%，處于初期快速釋放階段。而10 h后為緩慢釋放階段，此階段殼聚糖和明膠的溶脹能力減弱，抑制丁香酚從納米膠囊的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)釋放通道擴(kuò)散到介質(zhì)中，驗(yàn)證了丁香酚在明膠-殼聚糖的可溶性絡(luò)合物中達(dá)到了控制釋放的效果。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)探究了明膠與殼聚糖自組裝最適質(zhì)量比，制備Euo-Gel-CS NPs的單因素優(yōu)化條件，最后通過正交試驗(yàn)得出最優(yōu)工藝為殼聚糖質(zhì)量濃度2 mg/mL、明膠質(zhì)量濃度2 mg/mL、丁香酚質(zhì)量濃度5 mg/mL、轉(zhuǎn)速800 r/min、交聯(lián)時(shí)間30 min，制得的Euo-Gel-CS NPs粒徑為229.09 nm，包封率達(dá)到50.69%。制備不使用交聯(lián)劑，過程綠色。傅里葉變換紅外光譜、差示掃描量熱對Euo-Gel-CS NPs微觀化學(xué)結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，表明丁香酚和明膠間主要由氫鍵和疏水相互作用組成，確定了丁香酚被裝載到納米顆粒中；體外釋放實(shí)驗(yàn)證明Euo-Gel-CS NPs具有緩釋作用。考察和表征了Euo-Gel-CS NPs的部分特性，其防腐抗菌作用還有待進(jìn)一步深入研究。

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