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      青稞麩皮阿拉伯木聚糖的提取工藝優(yōu)化及結(jié)構(gòu)分析

      2018-04-20 08:59:24徐中香李季楠
      食品科學(xué) 2018年8期
      關(guān)鍵詞:阿拉伯糖單糖木糖

      徐中香,胡 浩,李季楠,吳 艷*

      青稞(Hordeum vulgare Linn. var. nudum Hook. F.),又稱裸大麥、元麥,禾本科大麥屬,是我國西北高寒地區(qū)極為重要的一種高原谷類作物[1-2]。青稞營養(yǎng)價值豐富,富含β-葡聚糖和阿拉伯木聚糖(arabinoxylan,AX)等非淀粉多糖,具有高蛋白質(zhì)、高維生素、高纖維、低糖、低脂等特點[2-3]。AX主要存在于谷物麩皮中,質(zhì)量分數(shù)可達干基的20%~25%,而胚乳及籽粒中含量相對較低,質(zhì)量分數(shù)分別為1.5%~2.5%及4%~8%[4]。麩皮AX因與纖維素、木質(zhì)素等存在共價結(jié)合[5],水法提取效果較差,多采用堿法NaOH溶液、飽和Ba(OH)2、Ca(OH)2溶液等提取[6-9],而使用阿拉伯木聚糖酶法亦可提高AX提取率[6]。李雪等[10]比較了不同堿性提取劑對小麥麩皮水不溶性AX的提取效果,發(fā)現(xiàn)以NaOH溶液為提取溶劑時,AX得率雖然不如飽和Ba(OH)2溶液提取得率高,但是提取時間短、成本低、工藝簡單。Wang Jing等[11]采用超聲波輔助酶法優(yōu)化了小麥麩皮AX的提取工藝,其中得率為14.26%,超聲波提高了酶處理效率,進而得率提高。Gong等[12]研究了3 種青稞麩皮中AX質(zhì)量分數(shù)分別為14.21%、18.18%及21.06%,阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值分別為0.83、0.76及0.58。國內(nèi)外對AX的研究多集中于小麥、大麥及其加工副產(chǎn)物,而對青稞乃至青稞麩皮AX的研究還較少。

      本研究采用堿法提取青稞麩皮AX,研究料液比、提取溫度、提取時間、NaOH質(zhì)量濃度對青稞麩皮AX提取的影響,通過響應(yīng)面法優(yōu)化AX的最佳提取工藝。采用高效凝膠滲透色譜(high-performance gel permeation chromatography,HPGPC)對青稞麩皮AX進行純度鑒定,紫外吸收光譜、紅外吸收光譜和高效陰離子色譜法對其結(jié)構(gòu)進行初步分析,旨在為青稞麩皮AX的進一步開發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

      1 材料與方法

      1.1 材料與試劑

      青稞麩皮(品種:肚里黃)產(chǎn)地為青海省貴南市,青稞麩皮粉碎后過40 目篩備用。

      考馬斯亮藍試劑盒、耐高溫α-淀粉酶、透析袋上海源葉生物科技有限公司;氫氧化鈉、乙酸鈉、硝酸鈉、鹽酸、硫酸、苯酚、三氟乙酸、乙醇、葡萄糖均為國產(chǎn)分析純。

      1.2 儀器與設(shè)備

      SF-2000高速粉碎機 上海市藥材有限公司;R206B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司;SHB-III循環(huán)水式真空泵 上海誠育儀器設(shè)備有限公司;TD5A-WS臺式低速離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;U1810紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海恒科學(xué)儀器有限公司;冷凍干燥機 上海比朗儀器制造有限公司;MDF-U52V超低溫冰箱 日本Sanyo公司;Mili-Q超純水系統(tǒng) 美國Millipore公司;PL203電子天平梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;ICS-5000離子色譜儀 美國戴安公司;Waters E2695高效液相色譜儀美國沃特世公司。

      1.3 方法

      1.3.1 青稞麩皮預(yù)處理

      青稞麩皮粉中加入10 倍體積的體積分數(shù)95%乙醇溶液,不斷攪拌,浸泡1 d,除去小分子、低聚糖、揮發(fā)油等物質(zhì)[13]。將除去乙醇的青稞麩皮于60 ℃烘箱中過夜干燥。向脫脂后的青稞麩皮去離子水體系中(料液比1∶10(g/mL))加入耐高溫α-淀粉酶,95 ℃水浴30 min[14]。60 ℃烘箱中過夜干燥得到脫脂除淀粉的青稞麩皮粉。

      1.3.2 堿提工藝

      青稞麩皮預(yù)處理粉→加入NaOH溶液→水浴振蕩→離心→等電點除蛋白[15]→旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮→去離子水透析→乙醇沉淀→離心后水復(fù)溶→冷凍干燥→青稞麩皮AX。

      1.3.3 AX得率計算

      采用苯酚-硫酸比色法測定多糖的含量[16],以葡萄糖制作標準曲線,測得提取液中多糖含量后,按下式計算樣品中多糖得率(以預(yù)處理粉計):

      式中:C為提取液中多糖質(zhì)量濃度/(μg/mL);V為提取液體積/mL;n為提取液稀釋倍數(shù);m為預(yù)處理粉質(zhì)量/g。

      1.3.4 單因素試驗

      固定基本提取參數(shù)為料液比1∶15(g/mL)、提取溫度25 ℃、提取時間2 h、NaOH質(zhì)量濃度10 g/L。在基本提取參數(shù)下,分別考察料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30(g/mL))、提取溫度(25、35、45、55、65 ℃)、提取時間(1、2、3、4、5 h)、NaOH質(zhì)量濃度(1、5、10、15、25 g/L)4 個單因素對AX得率的影響。

      1.3.5 響應(yīng)面試驗

      在單因素試驗的基礎(chǔ)上,以料液比、提取溫度、提取時間、NaOH質(zhì)量濃度為自變量,以AX得率為響應(yīng)值,采用Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計原理[17],以青稞麩皮AX得率為指標,采用SAS V8.0分析軟件設(shè)計四因素三水平響應(yīng)面組合設(shè)計,對堿法提取AX工藝參數(shù)進行優(yōu)化。試驗因素與水平設(shè)計見表1。

      表1 AX提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗因素與水平Table 1 Independent variables and their coded values tested in response surface analysis

      1.3.6 青稞麩皮AX純度鑒定

      青稞麩皮AX經(jīng)過多次乙醇沉淀后,采用HPGPC法對其進行純度鑒定。色譜條件:Ultrahydrogel liner柱(7.8 mm×300 mm),示差折光檢測器,柱溫、檢測器溫度35 ℃,0.10 mol/L NaNO3溶液為流動相,流速0.6 mL/min。流動相溶解樣品,配制青稞麩皮AX溶液2 mg/mL,過0.45 μm微孔過濾膜后,供進樣分析。

      1.3.7 青稞麩皮AX紫外光譜分析

      配制青稞麩皮AX溶液0.5 mg/mL,于紫外-可見分光光度計中進行波長190~400 nm范圍內(nèi)紫外光譜掃描。

      1.3.8 青稞麩皮AX紅外光譜分析

      將2.0 mg多糖干燥樣品,與200 mg KBr研磨后壓片,在4 000~400 cm-1區(qū)域內(nèi)進行紅外光譜掃描。

      1.3.9 青稞麩皮AX單糖組成分析

      采用帶有脈沖安培檢測器的高效離子交換色譜系統(tǒng)測定單糖組成[18]。取多糖樣品5 mg于具塞管中,加入2 mol/L的三氟乙酸溶液2 mL于121 ℃水解2 h,氮吹除去過量的三氟乙酸,加水溶解定容后過0.45 μm微孔過濾膜,供進樣分析[19]。

      色譜柱:CarboPac PA20;流動相A:H2O;B:250 mmol/L NaOH溶液;C:1 mol/L CH3COONa溶液,三元梯度洗脫程序見表2;流速:0.5 mL/min;積分脈沖安培檢測器。

      表2 AX單糖組成分析梯度淋洗程序Table 2 Gradient elution procedure for monosaccharide composition analysis of AX

      2 結(jié)果與分析

      2.1 青稞麩皮AX提取單因素試驗結(jié)果

      2.1.1 料液比對青稞麩皮AX得率的影響

      圖1 料液比對青稞麩皮AX得率的影響Fig. 1 Effect of solid to solvent ratio on the extraction efficiency of AX

      由圖1可知,低溶劑用量時料液呈糊狀,不利于AX的溶出,因而AX得率較低。隨著溶劑用量的增加,麩皮粉與溶劑充分接觸,加速AX的溶出。料液比1∶20(g/mL)前,AX得率隨著溶劑用量的提高快速增大,料液比1∶20(g/mL)后得率增加趨于平緩,提高不再明顯。鑒于后續(xù)旋蒸濃縮的易操作性及經(jīng)濟角度,確定最佳料液比為1∶20(g/mL)。

      2.1.2 提取溫度對青稞麩皮AX得率的影響

      圖2 提取溫度對青稞麩皮AX得率的影響Fig. 2 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of AX

      由圖2可知,青稞AX得率對提取溫度依賴性較高,提取溫度的升高顯著提高了AX得率,低于55 ℃前隨著溫度的升高得率快速上升,高于55 ℃后得率趨于平緩。雖然較高溫度利于AX的提取,但高溫下得到的AX顏色明顯加深,其中色素等雜質(zhì)較高,不利于后續(xù)的純化,此外,高溫會導(dǎo)致多糖的降解。因此確定最佳提取溫度為55 ℃。

      2.1.3 提取時間對青稞麩皮AX得率的影響

      圖3 提取時間對青稞麩皮AX得率的影響Fig. 3 Effect of extraction time on the extraction efficiency of AX

      由圖3可知,提取時間較短時,青稞麩皮中的AX尚未充分溶解出來,隨著提取時間的延長,AX得率總體呈現(xiàn)上升趨勢,但3 h后增速較慢,漸趨于平緩。因此從提取周期及能耗角度,確定最佳提取時間為3 h。

      2.1.4 NaOH質(zhì)量濃度對青稞麩皮AX得率的影響

      圖4 NaOH質(zhì)量濃度對青稞麩皮AX得率的影響Fig. 4 Effect of sodium hydroxide concentration on the extraction efficiency of AX

      由圖4可知,AX作為植物細胞壁多糖,不僅與材料中的木質(zhì)素、纖維素等存在復(fù)雜的物理纏繞,與多糖、蛋白質(zhì)之間還存在著以阿魏酰相連的共價鍵[20],因而在極低的堿濃度下,絕大部分AX無法溶出,得率極低,這也是AX一般均采用堿提法提取的主要原因。NaOH的質(zhì)量濃度為1~5 g/L時,AX得率增速較低,質(zhì)量濃度為15 g/L時,得率顯著提高,此后得率有所提高但較平緩。雖然溶劑濃度越大越利于物質(zhì)的溶出,但因麩皮中含有較多色素物質(zhì),AX得率提高的同時也伴隨著其他雜質(zhì)(色素、蛋白、木質(zhì)素等)的溶出。因此從后續(xù)除雜及經(jīng)濟角度,確定最佳NaOH質(zhì)量濃度為15 g/L。

      2.2 青稞麩皮AX提取的響應(yīng)面分析

      2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果

      響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果見表3,共27 個試驗點,其中包括24 個析因試驗點,其自變量取值在各因素構(gòu)成三維頂點,3 個中心試驗點,用于估計試驗誤差。采用SAS V8.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行分析,得到青稞麩皮AX得率與各變量的二次多項方程的數(shù)學(xué)回歸模型為:Y=14.256 67+1.810 833X1+0.22X2+0.695X3+0.269 167X4-2.138 333X12-0.307 083X22-0.932 083X32-0.858 333X42-0.122 5X1X2-0.137 5X1X3+0.217 5X1X4-0.145X2X3-0.137 5X2X4-0.242 5X3X4。

      由表4可知,該回歸模型P值小于0.000 1,說明該模型極顯著,其響應(yīng)值與各試驗因素之間存在顯著的線性相關(guān)性;R2值為0.998 3,R2Adj值為0.996 3,說明該模型與試驗值擬合較好,能很好地表述青稞麩皮AX提取過程中其得率隨提取條件的變化規(guī)律;失擬項P值為0.332 4,不顯著,同樣確定了模型的可行性;自變量X1、X2、X3、X4的P值均小于0.000 1,說明它們對AX得率都有極顯著的影響,而據(jù)自變量的F值可判斷各因素對AX得率的影響由大到小依次為:X1>X3>X4>X2;交互項X1X2、X1X3、X1X4、X2X3、X2X4、X3X4P值小于0.05,均影響顯著,說明各因素對AX得率均有顯著的交互作用。

      表3 青稞麩皮AX提取工藝優(yōu)化響應(yīng)面分析試驗設(shè)計及結(jié)果Table 3 Experimental design and corresponding results for response surface analysis

      表4 響應(yīng)面模型方差分析Table 4 Analysis of variance (ANOVA) for response surface quadratic regression model

      2.2.2 響應(yīng)面交互作用分析

      響應(yīng)面及等高線圖可分析因素對AX得率的交互作用并確定最佳提取參數(shù)。等高線形狀可反映各因素間交互作用的強弱,橢圓形表示兩因素交互作用顯著,圓形則相反[11]。

      圖5 兩因素交互作用對提取效果影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig. 5 Response surface and contour plots showing the interactive effects of factors on extraction efficiency

      選取3 組交互作用作響應(yīng)面圖,其他兩因素水平取0。由圖5a可知,AX得率隨著料液比和提取時間水平的增大而提高,但當兩者達到一定組合后,AX得率趨于平緩,兩者交互作用顯著??赡苁钱斄弦罕群吞崛r間達到一定值后,AX得到了充分提取,再之后水平提高AX得率增加不再顯著。由圖5b可知,在一定范圍內(nèi),AX得率隨著料液比及NaOH質(zhì)量濃度水平的增加顯著提高,而當兩者達到一定組合后,AX得率隨著組合條件的提高而呈緩慢下降趨勢??赡苁沁^高的NaOH質(zhì)量濃度造成了部分多糖的降解。由圖5c可知,在一定范圍內(nèi),隨著提取時間的延長,AX得率不斷增加,當提取時間超過3.5 h后,AX得率趨于穩(wěn)定;此條件下NaOH質(zhì)量濃度對AX得率的影響與圖5b類似,兩者交互作用顯著。

      2.2.3 最佳工藝條件的確定及模型驗證

      回歸模型預(yù)測的青稞麩皮AX最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶25(g/mL)、提取溫度55 ℃、提取時間3 h、NaOH質(zhì)量濃度15 g/L,在此條件下,AX得率可達14.27%。以確定的最佳工藝參數(shù)進行3 次青稞麩皮AX提取的平行實驗,得到AX得率平均值為14.31%,接近回歸方程所得AX得率的預(yù)測值。說明回歸方程能較真實地反映各因素對青稞麩皮AX得率的影響,采用響應(yīng)面分析方法優(yōu)化得到的提取工藝參數(shù)準確可靠。

      2.3 青稞麩皮AX的純度鑒定

      HPGPC因其快速、簡便和高分辨率等優(yōu)點,是目前多糖純度鑒定最常用的方法。青稞麩皮AX的高效液相色譜圖如圖6所示,在其純度檢測中,只有一個對稱的信號峰,可見其均一性較好,可以認為該青稞麩皮AX為單一組分的多糖聚合物。

      圖6 青稞麩皮AX HPGPC法純度測定Fig. 6 HPGPC analysis of AX

      2.4 青稞麩皮AX的紫外光譜分析

      圖7 青稞麩皮AX紫外吸收光譜圖Fig. 7 UV absorption spectrum of AX

      由圖7可知,青稞麩皮AX在192 nm波長處有一個較強的吸收峰,這是多糖的特征吸收峰,在280 nm波長處有微弱的吸收,說明青稞麩皮AX中含有少量蛋白質(zhì),而在260 nm波長處無吸收峰,說明該多糖中不含核酸[20]。

      2.5 青稞麩皮AX的紅外光譜分析

      圖8 青稞麩皮AX紅外吸收光譜圖Fig. 8 Fourier transform infrared spectrum of AX

      由圖8可知,3 429 cm-1處的吸收峰是—OH的伸縮振動吸收峰,寬吸收峰說明存在分子內(nèi)和分子間氫鍵;2 927 cm-1處的吸收峰是—CH的伸縮振動吸收峰;1 647 cm-1處的吸收峰是—C=O的伸縮振動;1 448 cm-1、1 399 cm-1處吸收峰是—CH2的變形吸收峰;1 340 cm-1處吸收峰是—CH彎曲振動吸收峰;1 038 cm-1處的則是醇羥基—OH的變角振動吸收峰。在893 cm-1處存在β-糖苷鍵的特征吸收峰,該多糖結(jié)構(gòu)中存在β-多糖[12,21-24],在864 cm-1處存在α-糖苷鍵的特征吸收峰,該多糖結(jié)構(gòu)中存在α-多糖[25-26]。而據(jù)文獻報道,AX結(jié)構(gòu)的主鏈是由β-D-吡喃木糖殘基經(jīng)β-(1→4)糖苷鍵連接而成的木聚糖,在C2和C3位β-D-木糖殘基可被α-L-呋喃阿拉伯糖取代,形成多分支結(jié)構(gòu)[27]。說明青稞麩皮中提取的多糖符合AX的結(jié)構(gòu)特征。

      2.6 青稞麩皮AX的單糖組成

      圖9 AX的高效陰離子交換色譜Fig. 9 High performance anion exchange chromatogram of AX

      根據(jù)各單糖標樣與多糖樣品的保留時間確定其單糖的種類,根據(jù)各峰面積計算樣品中各單糖的物質(zhì)的量比。由圖9可得,青稞麩皮AX主要由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖4 種單糖組成,單糖對應(yīng)的物質(zhì)的量比為11.61∶1∶3.62∶18,可以確定提取的青稞麩皮多糖中主要物質(zhì)為AX,且雜質(zhì)糖含量較低,阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值為0.645。Izydorczyk等[28]對一種加拿大蠟質(zhì)裸大麥糊粉層組織中AX的研究顯示,阿拉伯糖-半乳糖-葡萄糖-木糖物質(zhì)的量比為13.43∶1∶12.86∶20.33,阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值為0.66,該實驗中阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值與本實驗比值相近,但其中葡萄糖含量較高。Skendi等[29]發(fā)現(xiàn),小麥中提取的多糖阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值在0.57~0.71之間,而Rattan等[30]發(fā)現(xiàn),小麥粉中阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值在0.61~0.68之間,可見來源不同時其值會有不同。

      3 結(jié) 論

      本實驗通過Box-Behnken試驗設(shè)計建立了料液比、提取溫度、提取時間及NaOH質(zhì)量濃度4個影響因素與響應(yīng)值青稞麩皮AX得率相互作用的數(shù)學(xué)模型,并對試驗結(jié)果進行了模擬和預(yù)測,優(yōu)化后的最佳提取工藝為料液比1∶25(g/mL)、提取溫度55 ℃、提取時間3 h、NaOH質(zhì)量濃度15 g/L。在此條件下AX得率為14.31%,與理論值14.27%無顯著差異。提取工藝的優(yōu)化為青稞麩皮AX的進一步理化研究奠定了基礎(chǔ)。對青稞麩皮AX的結(jié)構(gòu)做了初步分析,HPGPC結(jié)果表明青稞麩皮AX均一性較好,可認為其為單一組分的多糖聚合物;紫外光譜檢測結(jié)果表明青稞麩皮AX中含有微量蛋白質(zhì),不含核酸;紅外光譜分析結(jié)果表明該多糖具有多糖特征吸收,并且含有α、β-糖苷鍵結(jié)構(gòu);高效離子交換色譜結(jié)果表明青稞麩皮AX的主要單糖組成為阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖,阿拉伯糖-半乳糖-葡萄糖-木糖物質(zhì)的量比為11.61∶1∶3.62∶18,阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值為0.645。阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值一定程度上反映了多糖結(jié)構(gòu)分支程度,谷物中該比值在0.3~1.1之間,而大麥糊粉層中阿拉伯糖與木糖物質(zhì)的量比值在大麥AX提取物中最低,在0.56~0.66之間,反映了大麥糊粉層AX的分支度低[31]。本實驗中青稞麩皮AX主要單糖組成為阿拉伯糖和木糖,分支度較低,與前人對大麥中AX的研究結(jié)果基本一致。

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