基于酪蛋白自組裝法制備α-生育酚/酪蛋白納米粒及其α-生育酚穩(wěn)定性分析

何 盼，徐偉麗,*，米雅清，何勝華，李 洋，佟云嬌

α-生育酚（α-tocopherol，α-TOC）廣泛分布在動(dòng)植物油中，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式為C29H50O2，分子結(jié)構(gòu)式如圖1所示[1-2]。α-TOC為淡黃色油狀液體，不溶于水，在無(wú)氧條件下即使加熱到200 ℃也不易分解，但對(duì)氧十分敏感，其在堿性條件下特別容易氧化[3-4]。一般認(rèn)為生育酚的主要功能是抗氧化作用，其在人體內(nèi)的抗氧化作用主要表現(xiàn)為延緩衰老、抗不育、提高免疫力等，在醫(yī)學(xué)上廣泛用于治療心血管疾病、抗腫瘤和預(yù)防衰老，并取得了良好的效果[5-7]。但由于α-TOC不溶于水，很難添加于食品中，又因?yàn)槠浣Y(jié)構(gòu)特性，易被氧化破壞，使得生物利用率較低甚至失去生物活性，使α-TOC在儲(chǔ)藏和應(yīng)用方面存在一定的局限性。采用納米體系對(duì)其進(jìn)行保護(hù)是目前解決這一問(wèn)題最有效的手段之一。

酪蛋白（casein，CN）廣泛存在于牛奶中，在牛奶中形成的高度水合膠粒稱為CN膠束[8-10]，CN表面的兩親基團(tuán)使CN包埋疏水性分子的同時(shí)可形成納米粒子懸液[11-18]。由于CN能自組裝成納米粒從而成為包埋營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的良好載體[19-23]；其自身也具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，水解后可以產(chǎn)生生物活性肽和多種氨基酸，在人體內(nèi)具有其他生理作用[10]。因此選擇CN作為載體，通過(guò)自組裝形成α-TOC/CN納米顆粒并測(cè)試其穩(wěn)定性，從而改善α-TOC的光敏性、熱敏性、易氧化等加工適應(yīng)性，保持其原有的化學(xué)特性和生物活性，并實(shí)現(xiàn)可控釋放，為解決α-TOC的應(yīng)用局限性提供參考，以期擴(kuò)大α-TOC在食品加工中的應(yīng)用和深化CN資源的開(kāi)發(fā)利用。

圖1 α-TOC結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structure of α-TOC

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

α-TOC、酪蛋白酸鈉 美國(guó)Sigma公司；檸檬酸三鉀 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鉀天津市天力化學(xué)試劑有限公司；無(wú)水氯化鈣 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；鹽酸 哈爾濱伊世達(dá)有限公司；氫氧化鈉 天津市永大化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

BSA223S型電子分析天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；pHS-3C型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 上海偉業(yè)儀器廠；101-2A型電熱鼓風(fēng)干燥箱 天津市泰斯特儀器有限公司；79-3型恒溫磁力攪拌器 上海司樂(lè)儀器廠；XMTD-3302型電熱恒溫水浴鍋、RHYG-4S型電動(dòng)攪拌器 常州市人和儀器廠；NanoZS90型激光粒度儀 英國(guó)Malvern儀器有限公司；Quanta x50 FEG掃描電鏡 FEI香港有限公司；Nicolet 6700傅里葉變換紅外光譜儀、SuperModulyo型真空冷凍干燥機(jī) 美國(guó)Thermo Fisher公司；H-7650透射電子顯微鏡、F-2700熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；UV-2100型紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì) 尤尼柯（上海）儀器有限公司；BCD-221型4 ℃冰箱 河南新飛電器集團(tuán)有限公司；BCD-208K/A型－20 ℃冰箱 青島海爾有限公司；Winne801光相關(guān)納米粒度儀 濟(jì)南微納顆粒儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 α-TOC/CN納米粒的制備

α-TOC溶液的制備：250 mg α-TOC溶于10 mL無(wú)水乙醇中，充分溶解后4 ℃避光保存。

根據(jù)Semoet等[24]的方法制備重組CN膠束：在200 mL 5%酪蛋白酸鈉溶液（溶于蒸餾水中）中加入3 mg α-TOC（對(duì)照只加同體積乙醇）、4 mL 1 mol/L檸檬酸三鉀、24 mL 0.2 mol/L K2HPO4溶液和20 mL 0.2 mol/L CaCl2溶液。而后每隔15 min在37 ℃恒溫浴邊攪拌邊加入2.5 mL 0.2 mol/L K2HPO4溶液和5 mL 0.2 mol/L CaCl2溶液，共計(jì)8 次。使用0.1 mol/L HCl溶液或1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值為6.7，用蒸餾水定容到400 mL。然后適度攪拌1 h（350 r/min），每個(gè)實(shí)驗(yàn)都重復(fù)進(jìn)行。

樣品和對(duì)照分散體系（10 mL）被放置在擰緊蓋的20 mL小瓶中，于74 ℃恒溫水浴熱處理20 s以便更好地形成自組裝粒子。

1.3.2 單因素試驗(yàn)

以熒光強(qiáng)度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，固定其他條件按照上述制備方法分別對(duì)組裝溫度（25、28、32、37、44、48 ℃）、α-TOC與CN質(zhì)量比（1∶5、1∶10、1∶20、1∶50、1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500）、pH值（6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4）進(jìn)行單因素試驗(yàn)。使用熒光光度計(jì)測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度，其中激發(fā)波長(zhǎng)為301 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為409 nm（稀釋倍數(shù)為2）。以確定自組裝法的最佳組裝溫度、質(zhì)量比和pH值。

1.3.3 α-TOC/CN納米粒的表征

1.3.3.1 粒徑測(cè)定

將α-TOC/CN納米粒用激光粒度儀分析其粒徑，對(duì)照組用200 mL 5%的酪蛋白酸鈉溶液定容至400 mL。粒徑測(cè)定參照Thiebaud等[25]的方法：用去離子水將樣品稀釋至原來(lái)體積的1/10，室溫靜置1 h，以破壞CN膠束。接著再稀釋至1/1 000，稀釋液于20 ℃適度攪拌。取100 mL處理好的樣品用激光粒度儀進(jìn)行粒徑分析。

1.3.3.2 形貌觀察

將干燥后的納米顆粒噴金，在Quanta x50 FEG掃描電鏡下（加速電壓5 kV）觀察外部形態(tài)。取一滴納米溶液加到銅網(wǎng)上，采用漂浮法進(jìn)行負(fù)染，負(fù)染劑為3%鈾染色，負(fù)染時(shí)間為35 s，置于透射電鏡下觀察形貌（加速電壓80 kV）。

1.3.3.3 傅里葉變換紅外光譜分析

將納米顆粒壓片后進(jìn)行衰減全反射傅里葉變換紅外光譜分析，波數(shù)范圍為400～4 000 cm－1，分辨率為4 cm－1。

1.3.4 α-TOC含量的測(cè)定

1.3.4.1 α-TOC包封率和載藥量計(jì)算

CN重組裝后的體系中除有包埋的α-TOC，還有游離的α-TOC。測(cè)定α-TOC總質(zhì)量和游離α-TOC質(zhì)量，按公式（1）和（2）計(jì)算納米粒的包封率和載藥量：

1.3.4.2 α-TOC標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取200 mg 93% α-TOC醇溶液溶于50 mL正己烷中，待完全溶解后用正己烷定容至100 mL，配制成2 mg/mL的α-TOC溶液，作為標(biāo)準(zhǔn)品備用液。取1 mL樣品溶液置于10 mL容量瓶中，用正己烷定容至刻度，作為工作液。精確吸取工作液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL置于10 mL容量瓶中，加正己烷稀釋至刻度，搖勻。用正己烷作空白，用紫外分光光度計(jì)于297 nm波長(zhǎng)處分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度，以α-TOC質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為y=0.006 4x－0.003 5，R2=0.999 6。

1.3.4.3 樣品游離α-TOC質(zhì)量的測(cè)定

游離的α-TOC用膜分離方法獲得：4 000×g離心30 min，游離的α-TOC會(huì)滲透到濾液接收器，封裝在CN納米顆粒的α-TOC會(huì)留在過(guò)濾裝置。濾液中得到的游離α-TOC先用氮?dú)饬鞒ヒ掖?，然后用正己烷提取至適當(dāng)?shù)臐舛?，最后徹底渦旋，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定在297 nm波長(zhǎng)處的吸光度。代入回歸方程，算出游離α-TOC的質(zhì)量。

1.3.5 α-TOC/CN納米粒穩(wěn)定性的測(cè)定

將α-TOC/CN納米粒于培養(yǎng)皿中－20 ℃冷凍過(guò)夜，放入冷凍干燥機(jī)真空干燥48 h，調(diào)蒸餾水pH值至與樣品pH值相同，用其溶解凍干樣品并用相關(guān)納米粒度儀測(cè)定粒徑大小。

1.3.5.1 貯存穩(wěn)定性

實(shí)驗(yàn)設(shè)置4 ℃以及室溫2 個(gè)條件，將樣品在4 ℃（或室溫）避光貯存48 h后與無(wú)水乙醇等體積混合磁力攪拌，加入200 μL 1 mol/L NaOH溶液，用正己烷對(duì)α-TOC進(jìn)行萃取，直到水相呈無(wú)色透明。正己烷相于297 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度，根據(jù)公式（3）計(jì)算保留率：

1.3.5.2 組裝溫度對(duì)α-TOC穩(wěn)定性的影響

將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組樣品分別置于60 ℃下避光保存48 h，計(jì)算保留率。

1.3.5.3 氧化劑對(duì)α-TOC穩(wěn)定性的影響

將實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組樣品各取1 mL分別加入1 mL 20 μg/mL FeCl3溶液，室溫避光保存48 h，計(jì)算保留率。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行顯著性分析，采用單因素Duncan法進(jìn)行多重比較，顯著水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 組裝溫度對(duì)α-TOC/CN納米粒相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

CN能夠發(fā)出熒光，當(dāng)α-TOC與CN形成α-TOC/CN納米粒時(shí)，CN的疏水基團(tuán)發(fā)生熒光淬滅[26]，自組裝包埋形成的α-TOC/CN納米粒相對(duì)熒光強(qiáng)度比未包埋的α-TOC相對(duì)熒光強(qiáng)度低。因此，可以通過(guò)測(cè)定相對(duì)熒光強(qiáng)度的大小來(lái)反映復(fù)合納米粒的結(jié)合強(qiáng)度。

組裝溫度的改變會(huì)影響CN結(jié)構(gòu)上的變化，從而影響α-TOC/CN納米粒的結(jié)合，因此確定最適操作溫度會(huì)提高納米粒的結(jié)合強(qiáng)度。取3 mg α-TOC于400 mL CN溶液中（pH 6.7），對(duì)不同組裝溫度下制備的α-TOC/CN納米粒相對(duì)熒光強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)果如圖2所示，結(jié)果表明：在25～37 ℃范圍內(nèi)，相對(duì)熒光強(qiáng)度波動(dòng)不大；當(dāng)37～48 ℃時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度逐漸增大，這可能是由于溫度升高導(dǎo)致蛋白質(zhì)部分變性使得大部分α-TOC與CN不能緊密的結(jié)合。由圖2可知，組裝溫度為37 ℃左右時(shí)，納米粒的相對(duì)熒光強(qiáng)度最?。≒＜0.05），結(jié)合程度最高。

圖2 組裝溫度對(duì)α-TOC/CN納米粒的影響Fig. 2 Effect of temperature on fluorescence intensity of α-TOC/CN nanocomposites

2.1.2 α-TOC與CN質(zhì)量比對(duì)α-TOC/CN納米粒相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

據(jù)于鈺等[10]實(shí)驗(yàn)研究，納米復(fù)合物的包埋程度受原料量的影響，因此本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定α-TOC與CN質(zhì)量比以確定CN對(duì)α-TOC的包埋程度。在pH 6.7、組裝溫度37 ℃條件下，對(duì)不同質(zhì)量比條件下制備的納米粒相對(duì)熒光強(qiáng)度測(cè)定結(jié)果如圖3所示，結(jié)果表明：質(zhì)量比在1∶5～1∶100時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度變化不大，可能是由于與CN結(jié)合的α-TOC有限，導(dǎo)致α-TOC大部分都還處于未結(jié)合狀態(tài)，從而導(dǎo)致這一范圍內(nèi)相對(duì)熒光強(qiáng)度高且變化不大，當(dāng)質(zhì)量比為1∶100～1∶300時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度急劇下降，納米粒結(jié)合的程度較高，其原因可能是在質(zhì)量比為1∶100時(shí)雖然α-TOC的含量較高但其大部分以微晶形式存在，使得進(jìn)入CN被包埋的較少，而在質(zhì)量比1∶300時(shí)α-TOC是以分子形式存在，更易于結(jié)合到CN的疏水微區(qū)中，使得兩者的結(jié)合程度較高[10]，而質(zhì)量比為1∶300～1∶500時(shí)，相對(duì)熒光強(qiáng)度又逐漸增加，這可能是由于隨著質(zhì)量比的減小，溶液中α-TOC雖都能達(dá)到最大程度的結(jié)合，但未包埋的CN增多，所以其相對(duì)熒光強(qiáng)度又逐漸升高。因此當(dāng)α-TOC與CN質(zhì)量比為1∶300時(shí)，α-TOC與CN結(jié)合程度較高（P＜0.05）。

圖3 α-TOC與CN質(zhì)量比對(duì)α-TOC/CN納米粒的影響Fig. 3 Effect of α-TOC to sodium caseinate ratio on fluorescence intensity of α-TOC/CN nanoparticles

2.1.3 pH值對(duì)α-TOC/CN納米粒相對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

pH值的變化會(huì)改變聚合物的帶電狀態(tài)，從而影響聚合物分子之間的靜電作用、鹽鍵作用、氫健作用和疏水作用以及聚合物分子結(jié)合程度[11]。在組裝溫度37 ℃、α-TOC與CN質(zhì)量比為1∶300的條件下，對(duì)不同pH值下制備的α-TOC/CN納米粒熒光強(qiáng)度的測(cè)定結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明：隨著pH值的升高，納米粒相對(duì)熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)先減小后增大的趨勢(shì)，在pH值為6.8時(shí)，納米粒相對(duì)熒光強(qiáng)度最?。≒＜0.05），結(jié)合程度最高，這可能是由于在pH 6.8時(shí)使得α-TOC與CN疏水基團(tuán)氫鍵結(jié)合能力最強(qiáng)，使得其相對(duì)熒光強(qiáng)度最小，同時(shí)Sáiz-Abajo等[27]也表示在利用CN自組裝時(shí)在pH 6.7附近效果最佳。因此選用pH 6.8為制備α-TOC/CN納米粒最佳pH值。

圖4 pH值對(duì)α-TOC/CN納米粒的影響Fig. 4 Effect of pH value on fluorescence intensity of α-TOC/CN nanoparticles

2.2 α-TOC/CN納米粒的表征結(jié)果

2.2.1 α-TOC/CN納米粒粒徑

圖5 α-TOC/CN納米粒粒徑的測(cè)定Fig. 5 Particle size distribution of α-TOC/CN nanoparticles

由圖5可知，α-TOC/CN納米粒平均粒徑為（135.6±13.7）nm，粒徑范圍為80.3～306.5 nm，且多分散系數(shù)為0.157，表明經(jīng)自組裝后納米顆粒分散性良好，粒徑分布較均勻，體系穩(wěn)定，適合用于后期研究[28]。

2.2.2 形貌觀察

最佳條件下所制備的α-TOC/CN納米粒掃描電鏡和透射電鏡結(jié)果如圖6所示，復(fù)合納米顆粒形狀類似圓狀，分散性良好，粒徑分布比較均勻，粒徑與之前用激光粒度儀所測(cè)的結(jié)果一致。

圖6 α-TOC/CN納米粒掃描電鏡圖（A）與透射電鏡圖（B）Fig. 6 SEM (A) and TEM (B) images of α-TOC/CN nanoparticles

2.2.3 傅里葉變換紅外光譜結(jié)果

α-TOC/CN納米粒與未包埋α-TOC的CN納米粒紅外光譜測(cè)試如圖7所示，3 000 cm－1附近的寬峰為CN中N—H鍵伸縮振動(dòng)所致，α-TOC/CN納米粒在此處的吸收峰為3 300.25 cm－1，而對(duì)照CN納米粒的吸收峰為3 307.20 cm－1，通過(guò)對(duì)比可知，分子間、分子內(nèi)氫鍵作用使得該峰的伸縮振動(dòng)頻率向低波數(shù)方向移動(dòng)，表明α-TOC與CN的氫鍵作用增強(qiáng)了[29]。而α-TOC/CN納米粒中1 659.14 cm－1及CN納米粒中1 658.96 cm－1峰均能說(shuō)明兩者具有α-螺旋結(jié)構(gòu)，有利于蛋白質(zhì)在油水界面上快速吸附和定向。在920.20 cm－1處，α-TOC/CN納米粒出現(xiàn)了一小峰，可能是由于α-TOC與CN結(jié)合后引起CN中N—H面外彎曲振動(dòng)引起的，再次證明了α-TOC與CN之間存在相互作用力。通過(guò)上述分析證明了α-TOC被成功包埋進(jìn)入CN內(nèi)部。

圖7 α-TOC/CN納米粒與CN納米粒的紅外光譜圖Fig. 7 FTIR spectra of CN and α-TOC/CN nanoparticles

2.3 α-TOC包封率和載藥量

圖8 α-TOC包封率和載藥量Fig. 8 Encapsulation efficiency and drug loading capacity of α-TOC

從圖8可以看出，隨著α-TOC加入量的增加，α-TOC/CN納米粒包封率先降低后增大，載藥量逐漸增大，在α-TOC與CN質(zhì)量比為1∶10時(shí)包封率和載藥量都呈上升趨勢(shì)，該測(cè)量結(jié)果與于鈺[10]的研究結(jié)果相符合。質(zhì)量比為1∶300～1∶100時(shí)，由于α-TOC含量增加，在溶液中以微晶形式存在的α-TOC也增多，使得α-TOC不易與CN結(jié)合，所以其包封率會(huì)逐漸下降。在α-TOC與CN質(zhì)量比為1∶300時(shí)，包封率和載藥量分別為（97.97±7.38）%和（0.33±0.03）%。

2.4 α-TOC/CN納米粒的穩(wěn)定性分析

2.4.1 凍干對(duì)納米粒粒徑的影響

將α-TOC/CN納米粒溶液進(jìn)行凍干處理后，測(cè)定其粒徑結(jié)果如圖9所示，經(jīng)凍干后的納米粒粒徑并未發(fā)生大幅改變（P＞0.05），因此可知α-TOC/CN納米粒具有良好的凍干穩(wěn)定性。

圖9 凍干前后α-TOC/CN納米粒粒徑變化Fig. 9 Change in particle size of α-TOC/CN nanoparticles after freeze drying

2.4.2 4 ℃貯存穩(wěn)定性

圖10 4 ℃避光30 d貯存α-TOC和α-TOC/CN的保留率Fig. 10 Retention rates of α-TOC and α-TOC/CN during 30 d storage at 4 ℃

由圖10可知，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，α-TOC保留率逐漸降低，但與純品α-TOC相比，α-TOC/CN納米粒保留率更高（P＜0.05），由此可知，在4 ℃條件下，經(jīng)過(guò)CN的包埋提高了α-TOC的貯存穩(wěn)定性。

2.4.3 室溫貯存穩(wěn)定性

圖11 室溫避光貯存α-TOC和α-TOC/CN納米粒的保留率Fig. 11 Retention rates of α-TOC and α-TOC/CN during 30 d storage at room temperature

由圖11可知，隨著貯存時(shí)間的延長(zhǎng)，雖然α-TOC/CN納米粒和α-TOC的保留率都逐漸降低，但與純品α-TOC相比，α-TOC/CN納米粒保留率更高且下降較緩慢（P＜0.05），因此可知室溫下經(jīng)過(guò)包埋的α-TOC要比純品的α-TOC貯存穩(wěn)定性好。

2.4.4 氧化劑對(duì)α-TOC穩(wěn)定性的影響

綜合比較α-TOC/CN納米粒和α-TOC純品分別經(jīng)4 ℃保存、室溫貯存、60 ℃加熱處理和氧化劑FeCl3處理避光保存48 h后所測(cè)得的保留率，結(jié)果如圖12所示。在各種處理中經(jīng)過(guò)包埋的α-TOC要比未包埋的α-TOC保留率有所提高，其中4 ℃和FeCl3組α-TOC納米粒的保留率顯著提高。4 ℃處理的納米粒與對(duì)照組相比沒(méi)有顯著差異（P＞0.05），故4 ℃貯存效果最好。

圖12 不同處理?xiàng)l件下α-TOC和α-TOC/CN保留率Fig. 12 Retention rates of α-TOC and α-TOC/CN with different treatments

3 結(jié) 論

采用自組裝法包埋疏水性α-TOC，在制備α-TOC/CN納米粒最佳條件的同時(shí)考察了不同條件下α-TOC/CN納米粒穩(wěn)定性的變化。結(jié)果表明，當(dāng)制備條件為組裝溫度37 ℃、pH 6.8、α-TOC與CN質(zhì)量比1∶300時(shí)，α-TOC與CN結(jié)合較緊密，為制備納米復(fù)合物的最佳條件。所得納米粒平均粒徑為（135.6±13.7）nm，包封率為（97.97±7.38）%，載藥量為（0.33±0.03）%。納米粒大小均一且分散性較好。此外，經(jīng)過(guò)凍干以及在不同溫度（4 ℃、室溫、60 ℃）和氧化劑FeCl3的處理后，由穩(wěn)定性測(cè)試結(jié)果可知該納米粒具有良好的穩(wěn)定性，其中在4 ℃下貯存該納米粒穩(wěn)定性最好。用CN包埋α-TOC不僅提高了α-TOC的穩(wěn)定性，同時(shí)在操作方法上較為簡(jiǎn)單和經(jīng)濟(jì)，除酸堿外未添加過(guò)多化學(xué)試劑，安全性高，符合食品加工標(biāo)準(zhǔn)，為CN進(jìn)一步資源化利用提供了可能。

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