高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法鑒別五味子中木脂素成分

丁 博，陳文銳，王志元，謝建軍，曾廣豐，王 璐，佘志剛

五味子是傳統(tǒng)中醫(yī)藥材原料，最早記載于東漢的《神農(nóng)本草經(jīng)》，具有悠久的食用歷史；因?yàn)槠溆邢?、甘、酸、辛、苦等味道，被成為五味子[1]。中國(guó)傳統(tǒng)文化提倡藥食同源，很多中藥材都被作為膳食功能補(bǔ)品供人們食用，比如人參、靈芝等藥材在一定食用量條件下，作為食品被人們食用。五味子主要化學(xué)成分為木脂素、揮發(fā)油、有機(jī)酸、維生素、萜類(lèi)、多糖類(lèi)等化學(xué)成分，其中木脂素類(lèi)化合物主要生物藥理活性成分，包括有五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲等[2]。我國(guó)學(xué)者研究表明，五味子木脂素類(lèi)化合物具有護(hù)肝作用、抗氧化性、增強(qiáng)免疫力、抗疲勞等作用[3-5]。因此，許多保健食品用五味子作為功能作用原料，通過(guò)檢測(cè)保健食品中五味子甲素、五味子乙素和五味子醇甲3 個(gè)化合物的含量，評(píng)估保健食品中五味子功效作用。

目前五味子木脂素類(lèi)化合物檢測(cè)方法主要高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用兩種方法。張延妮等[6]利用反相-HPLC方法，采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)南五味子中五味子醇甲、五味子酯甲和五味子乙素；竇志華[7]、趙玥[8]等用HPLC測(cè)定五味子種子及果皮中五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素和五味子丙素6 種含量，結(jié)果顯示木脂素主要存在于種子中。胡俊揚(yáng)[9]與沈曉君[10]等利用HPLC測(cè)定不同產(chǎn)地五味子中8 種木脂素成分，不同產(chǎn)地五味子中五味子醇甲為主要成分。有學(xué)者[11-13]提出中藥有效成分的內(nèi)在函數(shù)關(guān)系與比例關(guān)系，提出“一測(cè)多評(píng)”方法利用HPLC測(cè)定五味子醇甲成分評(píng)估其他4、6 種或8 種木脂素成分，并與外標(biāo)法對(duì)比表明“一測(cè)多評(píng)”方法誤差符合要求。譚春梅等[14]利用HPLC分析五味子和南五味子中指紋圖譜，以木脂素指紋圖譜分析評(píng)價(jià)五味子產(chǎn)品的質(zhì)量。李曉亮等[15]利用HPLC測(cè)定五味子和南五味子中木脂素成分的指紋圖譜，其中南五味子藥材指紋圖譜中標(biāo)定25 個(gè)共有峰，顯示不同產(chǎn)地五味子木脂素成分差異顯著。高文新[16]采用超高效液相色譜聯(lián)用高分辨質(zhì)譜分析五味子提取物的木脂素成分，利用木脂素成分質(zhì)譜行為差異，分別對(duì)南五味子和北五味子的木脂素成分進(jìn)行比較分析。王寶蓮等[17]應(yīng)用HPLC聯(lián)用紫外/質(zhì)譜方法建立五味子醇提物的化學(xué)、體外代謝、體內(nèi)藥代和藥效指紋圖譜。由此可見(jiàn)，五味子中木脂素化合物主要為液相色譜檢測(cè)方法，復(fù)雜樣品基質(zhì)嚴(yán)重干擾木脂素化合物的色譜分離、鑒定，需要研究開(kāi)發(fā)質(zhì)譜尤其是高分辨質(zhì)譜法檢測(cè)五味子中木脂素類(lèi)化合物，以此評(píng)估不同地區(qū)五味子的產(chǎn)品質(zhì)量。

2003年國(guó)際分析化學(xué)年會(huì)上，一種新的檢測(cè)蔬菜與水果農(nóng)藥殘留的分析法被科研工作人員提出，并命名為QuEChERS（quick, easy, cheap, effective, rugged and safe）法，該方法操作原理是樣品依次加入乙腈與水體積比為70∶30作提取劑，硫酸鎂和氯化鈉（質(zhì)量比4∶1）為有機(jī)相與水相分散劑，C18、石墨化碳、陰陽(yáng)離子交換劑等雜質(zhì)吸附劑，均質(zhì)、攪拌與離心，從而提取純化樣品，進(jìn)行儀器檢測(cè)分析[18]。目前，廣泛應(yīng)用于蔬菜和水果農(nóng)藥殘留檢測(cè)領(lǐng)域[19-20]。近年來(lái)也有文獻(xiàn)報(bào)道將QuEChERS法類(lèi)比用于其他天然有機(jī)物提取前處理領(lǐng)域，比如大豆異黃酮類(lèi)樣品[21-23]。本研究利用HPLC-串聯(lián)三重四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-quadrupole-time of flight mass spectrometry，HPLC-Q-TOF-MS）技術(shù)結(jié)合QuEChERS前處理方法分析五味子中五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲的含量，同時(shí)通過(guò)數(shù)據(jù)依存獲取高分辨質(zhì)譜（information dependent acquisition-mass spectrometry，IDA-MS）技術(shù)評(píng)估南北五味子質(zhì)量的差異。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

五味子樣品購(gòu)于百姓中藥批發(fā)公司、東北長(zhǎng)白山特色食品公司（淘寶網(wǎng)）。

3 種五味子標(biāo)準(zhǔn)品：五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲 德國(guó)Dr Ehrestorfer公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 美國(guó)賽默飛世爾科技公司；甲酸（色譜純） 上海阿拉丁試劑公司；硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉（均為分析純） 廣州化學(xué)試劑廠；吸附劑C18填料（100～200 目） 德國(guó)CNW公司；石墨化碳吸附劑填料 美國(guó)西格瑪試劑公司；所有用水均為純水機(jī)制備的超純水（電導(dǎo)率18.2MΩ·cm）。

分別配制五味子甲素、五味子乙素、五味子醇甲3 種五味子質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，根據(jù)需要配制成系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.2 儀器與設(shè)備

Triple TOFR5600＋高分辨質(zhì)譜儀 美國(guó)ABsciex公司；HPLC 20AD HPLC儀 日本島津公司；Xbridge BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm） 美國(guó)Waters公司；Turbo Vap?LV氮吹濃縮儀 瑞典Biotage公司；T25高速均質(zhì)機(jī)、VORTEX 4旋渦混勻器 德國(guó)IKA公司；4k-15離心機(jī) 美國(guó)Sigma公司；Milli-Q超純水裝置 美國(guó)Millipore公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Xbridge C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.5 mL/min； 柱溫：40 ℃；梯度洗脫：流動(dòng)相A為0.1%甲酸溶液，流動(dòng)相B為乙腈；梯度洗脫條件：初始30% B相5 min升至80%，1 min升至100%，保留1 min，0.5 min降至30%，保留2.5 min。

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離和大氣壓化學(xué)電離復(fù)合源；正離子掃描方式；大氣壓化學(xué)離子源連接動(dòng)校正系統(tǒng)，每10 個(gè)樣品自動(dòng)校正1 次，大氣壓化學(xué)離子源利血平混合液正離子校正液流速0.3 mL/min，氣簾氣壓力：40 psi，霧化氣壓力：50 psi，輔助氣壓力：50 psi，離子源溫度：500 ℃，離子源電壓：5 500 V。一級(jí)TOF-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍：100～1 000 Da，數(shù)據(jù)采集時(shí)間100 ms， 去簇電壓：100 V，碰撞電壓：10 V；二級(jí)IDA-MS掃描準(zhǔn)確質(zhì)量范圍：50～1 000 Da，去簇電壓：100 V，碰撞電壓：（35±15）V；高靈敏模式，數(shù)據(jù)采集時(shí)間50 ms，信號(hào)閾值100 cps，IDA實(shí)驗(yàn)每循環(huán)采集6 次數(shù)據(jù)，動(dòng)態(tài)背景減法扣除。

1.3.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱(chēng)量1.000 g五味子原料，加入20 mL的70%乙腈溶液，1.0 g硫酸鎂和0.25 g氯化鈉，80 mg C18吸附劑，振蕩1 min，超聲振蕩15 min，渦旋、離心，轉(zhuǎn)移上清液至25 mL刻度管，加入純凈水定容，取1 mL溶液過(guò)0.22 μm濾膜，稀釋10 倍或100 倍上機(jī)測(cè)試。

1.4 數(shù)據(jù)分析

高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)在ABSciex公司的Analyst TF 1.6軟件采集，質(zhì)譜數(shù)據(jù)在PeakView 2.0，MasterView 2.0和MultiQuant 3.0等軟件上定性定量處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 五味子定性、定量分析依據(jù)

本研究選擇五味子中木脂類(lèi)化合物五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素目標(biāo)分析對(duì)照參考物質(zhì)。首先將3 個(gè)目標(biāo)化合物進(jìn)行HPLC-Q-TOF-MS分析，獲得目標(biāo)化合物高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)信息；根據(jù)一級(jí)TOF-MS和二級(jí)IDA-MS信息，結(jié)合HPLC留時(shí)間定性定量分析目標(biāo)化合物。3 個(gè)五味子木脂素類(lèi)化合物的定性定量分析質(zhì)譜數(shù)據(jù)依據(jù)見(jiàn)表1。根據(jù)目標(biāo)化合物的準(zhǔn)確分子離子峰、同位素峰、準(zhǔn)確二級(jí)碎片峰以及液相保留時(shí)間，可以進(jìn)行檢測(cè)分析五味子樣品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量。

表1 3 種五味子木脂素化合物高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)Table 1 Mass spectral data of individual lignanoids analyzed by IDA-MS

2.2 定量分析校準(zhǔn)曲線(xiàn)、檢測(cè)限與定量限測(cè)定結(jié)果

樣品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量，根據(jù)目標(biāo)化合物的一級(jí)TOF-MS高分辨質(zhì)譜信息進(jìn)行分析。首先利用HPLC-Q-TOF-MS分析方法獲得目標(biāo)化合物的離子流色譜（圖1），3 種目標(biāo)化合物配制成混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋成一系列質(zhì)量濃度，獲得目標(biāo)化合物的校正曲線(xiàn)，以及線(xiàn)性范圍；同時(shí)以3 倍信噪比和10 倍信噪比依據(jù)，確定方法的檢測(cè)限與定量限（表2）。結(jié)果表明，校準(zhǔn)曲線(xiàn)的R2在0.999 6以上，檢測(cè)限為0.3～1.5 μg/L，定量限為1～5 μg/L。

圖1 五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素離子流色譜圖Fig. 1 Extracted ion chromatograms of three lignanoid standards

表2 五味子木脂素類(lèi)校準(zhǔn)曲線(xiàn)、檢測(cè)限與定量限Table 2 Calibration curves, coefficients of determination, LODs and LOQs for lignanoids

2.3 五味子前處理方法的優(yōu)化

采用QuEChERS前處理方法提取樣品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素。分別選擇硫酸鎂與氯化鈉（方案1），硫酸鎂、氯化鈉與檸檬酸鈉（方案2），硫酸鎂、氯化鈉與C18吸附劑（方案3），硫酸鎂、氯化鈉、檸檬酸鈉與C18吸附劑（方案4）4 種方案優(yōu)化五味子木脂素類(lèi)化合物的提取條件，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同萃取條件下五味子木脂素化合物的含量Fig. 2 Lignanoids contents determined using different extraction conditions

圖2 顯示：4 種前處理萃取條件差異不顯著，方案3硫酸鎂、氯化鈉與C18吸附劑提取樣品時(shí)，五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量較好。為此，以下實(shí)驗(yàn)均選擇硫酸鎂、氯化鈉與C18吸附劑的QuEChERS前處理方法提取五味子樣品中五味子木脂素類(lèi)化合物。

2.4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果

為了進(jìn)一步驗(yàn)證QuEChERS前處理方法與HPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素的含量分析方法，實(shí)驗(yàn)選擇100 μg/L和200 μg/L兩個(gè)水平（表3）。結(jié)果顯示，加標(biāo)回收率在110.6%～115.3%之間，表明本方法可以用于五味子中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素含量的檢測(cè)。

表3 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 3 Recoveries of deoschisandrin, schisandrin and schisandrin B from spiked sample

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果

5 個(gè)樣品的五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素含量的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。結(jié)果顯示北五味子中五味子醇甲和五味子乙素含量比較高，分別在1.72～2.22 mg/g和1.00～1.31 mg/g之間，而南五味子中五味子醇甲和五味子乙素含量在0.2 mg/g以下。南五味子中五味子甲素含量在2.88～3.76 mg/g之間，北五味子含量在0.7 mg/g以下。結(jié)果表明南北五味子中木脂素類(lèi)化合物含量存在顯著差異。

表4 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果Table 4 Lignanoids contents of commercial samples

2.6 五味子木脂素化合物的鑒定

表5 五味子木脂素類(lèi)化合物XIClist[24-30]Table 5 XIClists of lignanoids in S. chinensis

續(xù)表5

五味子木脂素類(lèi)化合物是五味子主要生物活性化合物，為了進(jìn)一步分析抽查的5 個(gè)南北五味子樣品的木脂素類(lèi)化合物的分布情況，研究查閱整理國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道從五味子植物提取分離到木脂素類(lèi)化合物[24-30]，建立高分辨質(zhì)譜XIClist列表（表5），在PeakView軟件根據(jù)木脂素類(lèi)化合物的分子結(jié)構(gòu)式與IDA-MS信息，進(jìn)行結(jié)構(gòu)與質(zhì)譜數(shù)據(jù)匹配度分析，在非標(biāo)準(zhǔn)品條件下鑒定樣品中木脂素類(lèi)化合物的分布情況。

圖3 樣1 IDA-MS篩查離子流色譜圖Fig. 3 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 1

由圖3可知，樣1分子式為C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，還含有戈米辛N與γ-五味子素；分子式為C23H30O6的木脂素化合物為戈米辛K1、K2與K3；分子式為C28H36O8木脂素化合物為巴豆酰戈米辛H和當(dāng)歸酰戈米辛H。

圖4 樣2 IDA-MS篩查離子流色譜圖Fig. 4 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 2

由圖4可知，樣2分子式為C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，還含有戈米辛N與γ-五味子素；分子式為C23H30O6的木脂素化合物是戈米辛K1、K2與K3；分子式為C28H36O8木脂素化合物是巴豆酰戈米辛H和當(dāng)歸酰戈米辛H。

圖5 樣3 IDA-MS篩查離子流色譜圖Fig. 5 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 3

由圖5可知，樣3分子式為C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，還含有戈米辛N與γ-五味子素；分子式為C28H34O9的木脂素化合物是巴豆酰戈米辛P和當(dāng)歸酰戈米辛P；分子式為C23H38O7木脂素化合物是戈米辛A。

圖6 樣4 IDA-MS質(zhì)譜篩查離子流色譜圖Fig. 6 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 4

由圖6可知，樣4分子式為C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，還含有戈米辛N、γ-五味子素以及其他未知化合物；分子式為C22H24O7化合物是戈米辛N及其同分異構(gòu)的木脂素類(lèi)化合物，分子式為C28H34O9的木脂素化合物為巴豆酰戈米辛P和當(dāng)歸酰戈米辛P以及其他同分異構(gòu)體化合物；分子式為C28H36O8木脂素化合物是巴豆酰戈米辛H與當(dāng)歸酰戈米辛H兩個(gè)化合物其中一個(gè)。

圖7 樣5 IDA-MS篩查離子流色譜圖Fig. 7 Extracted ion chromatogram of IDA-MS for sample 5

由圖7可知，樣5分子式為C23H28O6的木脂素化合物，除了五味子乙素外，還含有戈米辛N、γ-五味子素以及其他未知化合物；分子式為C22H24O7化合物是戈米辛N及其同分異構(gòu)的木脂素類(lèi)化合物，分子式為C28H34O9的木脂素化合物為巴豆酰戈米辛P和當(dāng)歸酰戈米辛P以及其他同分異構(gòu)體化合物；分子式為C28H36O8木脂素化合物是巴豆酰戈米辛H與當(dāng)歸酰戈米辛H兩個(gè)化合物其中一個(gè)。

對(duì)比分析圖3～7發(fā)現(xiàn)，3 個(gè)北五味子中樣1和樣2離子流指紋色譜圖相似，樣3北五味子的木脂素成分與樣1和樣2存在一定差異性；樣4與樣5兩個(gè)南五味子的離子流指紋色譜圖相似。綜上所述可以通過(guò)IDA-MS篩查保健食品中功效成分的特征化合物的差異，判斷保健食品產(chǎn)品的質(zhì)量?jī)?yōu)劣。

2.7 方法對(duì)比優(yōu)勢(shì)

早期文獻(xiàn)報(bào)道[14-15]五味子HPLC-質(zhì)譜圖譜鑒定分析評(píng)估五味子產(chǎn)品的品質(zhì)，需要標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌?，以及液相色譜分離條件，進(jìn)行樣品的鑒定分析，本實(shí)驗(yàn)研究開(kāi)發(fā)QuEChERS結(jié)合HPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)五味子中木脂素化合物的分析方法，可以在非標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌罚约皬?fù)雜樣品基質(zhì)條件下，通過(guò)提過(guò)提取木脂素類(lèi)化合物的高分辨質(zhì)譜離子流色譜圖，利用49 種木脂素化合物結(jié)構(gòu)式與IDA-MS的匹配關(guān)系，鑒定樣品中木脂素成分。準(zhǔn)確快速地篩查鑒定樣品中木脂素化合物及其產(chǎn)地來(lái)源。

3 結(jié) 論

以五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素3 個(gè)五味子木脂素化合物為目標(biāo)物，優(yōu)化QuEChERS前處理技術(shù)提取五味子中木脂素最佳萃取凈化條件，開(kāi)發(fā)了HPLC-Q-TOF-MS檢測(cè)五味子中木脂素的分析方法。與HPLC及液相色譜-質(zhì)譜等分析方法相比，該方法在液相色譜分離度低、復(fù)雜樣品基質(zhì)以及無(wú)標(biāo)準(zhǔn)品條件下，可根據(jù)一級(jí)TOF-MS和二級(jí)IDA-MS信息，實(shí)現(xiàn)五味子中木脂素化合物的分析與鑒定；同時(shí)根據(jù)IDA-MS信息鑒別樣品中木脂素化合物分布情況，從而鑒定五味子產(chǎn)品的品質(zhì)。由此可見(jiàn)，QuEChERS與HPLC-Q-TOF-MS分析方法快速篩查五味子中木脂素成分的選擇性好、靈敏度高、準(zhǔn)確性高；將該方法用于5 個(gè)五味子樣品的鑒定，明顯篩查鑒別出南五味子與北五味子的差異。

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