不同泌乳期人乳與牛乳中游離氨基酸的對(duì)比

吳尚儀，吳 尚，韓宏嬌，孔繁華，關(guān)博元，張熙桐，曹雪妍，康世墨，陶冬冰，岳喜慶*

乳是由哺乳動(dòng)物乳腺分泌的一種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，含有蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖、礦物質(zhì)等各種生物活性成分，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值十分豐富，易于被人體消化吸收，是動(dòng)物幼崽及嬰幼兒獲得營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的重要來源。一般將母體在產(chǎn)后7 d內(nèi)分泌的免疫活性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的略帶黃色的乳汁稱為初乳，母體在產(chǎn)后15 d以后分泌的乳汁稱為常乳[1]。研究表明，人乳中蛋白質(zhì)的組成含量與牛乳不同，人乳中乳清蛋白含量約為50%～60%，而在牛乳中約為20%，其余80%為酪蛋白，分子質(zhì)量較大的酪蛋白不利于嬰幼兒消化吸收[2-3]。人初乳、牛初乳的乳清蛋白中均含有免疫球蛋白、乳鐵蛋白以及乳過氧化物酶等生物活性蛋白，但人初乳乳清蛋白參與的細(xì)胞組成多，且在生物過程如應(yīng)激反應(yīng)發(fā)揮的作用更強(qiáng)[4-6]。人乳中脂肪組成含量和牛乳無大差異，但在脂肪酸的組成方面，牛乳全脂中多為C4010的低級(jí)脂肪酸而人乳中高度不飽和脂肪酸含量較高，說明人乳的抗氧化、降血脂等一些功能性更強(qiáng)[7]。人乳低聚糖和牛乳低聚糖組成和結(jié)構(gòu)有差異，研究表明人乳低聚糖更有利于嬰兒腸道菌群的構(gòu)建和大腦發(fā)展[8-9]。人乳中所含的一些營(yíng)養(yǎng)成分較牛乳更易于嬰幼兒消化吸收，且更有助于促進(jìn)嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育以及維持機(jī)體健康。隨著科學(xué)的母乳化喂養(yǎng)方式的提出，人乳和牛乳營(yíng)養(yǎng)成分對(duì)比研究也越來越受到重視[10-11]。

氨基酸是指含有一個(gè)堿性氨基及一個(gè)酸性羧基的有機(jī)化合物，但通常是指構(gòu)成蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)單位，信使RNA分子中的4 種核苷酸（堿基）的序列能決定構(gòu)成蛋白質(zhì)的20 種氨基酸的種類和排列次序。非編碼蛋白氨基酸是指遺傳基因中無相應(yīng)的密碼，不能編碼于蛋白質(zhì)分子中的氨基酸，即除組成蛋白質(zhì)的20 種常見氨基酸以外的含有氨基和羧基的化合物。游離氨基酸是指沒有形成聚合狀態(tài)的單個(gè)氨基酸，它可以直接被人體吸收和利用。人乳和牛乳中均含有一定量的游離氨基酸，不同來源乳中游離氨基酸的含量有所差異。從嬰幼兒消化吸收的角度分析乳中氨基酸被利用的多少，可在一定程度上反映乳的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[12-13]。同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)是近年來最新開發(fā)的一種定量研究技術(shù)，iTRAQ試劑可與氨基酸N端氨基及賴氨酸側(cè)鏈ε氨基共價(jià)連接從而標(biāo)記肽段，在質(zhì)譜圖中，不同樣品中經(jīng)過iTRAQ試劑標(biāo)記的同一種氨基酸的質(zhì)荷比相同。且相比傳統(tǒng)蛋白質(zhì)組學(xué)定量方法，iTRAQ技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)高通量檢測(cè)，同步比較8 種或4 種樣品，還具有分析范圍廣泛、定量結(jié)果準(zhǔn)確、分析時(shí)間短、效率高等優(yōu)點(diǎn)[14-15]。高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS/MS）法是近年來發(fā)展起來的最新技術(shù)，在食品檢測(cè)研究中得到廣泛應(yīng)用[16]。

目前，國(guó)際衛(wèi)生組織提倡6 個(gè)月以前嬰幼兒需母乳喂養(yǎng)，因此，本實(shí)驗(yàn)選取初乳和常乳為研究對(duì)象。大多數(shù)學(xué)者對(duì)于乳中游離氨基酸的研究，僅限于乳中17 種主要游離氨基酸的檢測(cè)，而本研究利用先進(jìn)的iTRAQ標(biāo)記結(jié)合HPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)不同泌乳期人乳和牛乳中42 種氨基酸進(jìn)行檢測(cè)及對(duì)比分析，比較游離氨基酸的種類及含量的差異性，彌補(bǔ)前人對(duì)氨基酸種類研究的不足，為未來嬰幼兒配方奶粉的母乳化，研制輔助調(diào)血糖、調(diào)血脂、增強(qiáng)免疫力的功能性乳制品提供更加精確、全面的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人初乳、人常乳：實(shí)驗(yàn)選取沈陽市婦嬰醫(yī)院正常生產(chǎn)、身體健康、頭胎、飲食正常、年齡在26～35 歲之間，產(chǎn)后1～5 d和30～45 d的產(chǎn)婦各10 人，每天上午9點(diǎn)采取人工擠奶的方式收集乳樣，將其放入已消毒的采樣瓶中，置于超低溫冰箱中保存，并在實(shí)驗(yàn)前混合（防止個(gè)體差異），由授乳母親自愿提供。

牛初乳、牛常乳：實(shí)驗(yàn)選取沈陽輝山乳業(yè)奶牛場(chǎng)，奶牛在1～5 齡之間，飼喂以苜蓿草為主的苜蓿型粗飼料，體重相近，泌乳日齡為1～7 d（初乳）和30～45 d（常乳）的健康荷斯坦奶牛各10 頭，分別在上午9點(diǎn)進(jìn)行人工擠奶，將其放入已消毒的采樣瓶中，置于超低溫冰箱中保存，并在實(shí)驗(yàn)前混合（防止個(gè)體差異）。

甲酸、乙腈、羥胺、磺基水楊酸（均為分析純）美國(guó)Fisher公司。

1.2 儀器與設(shè)備

API 45AA氨基酸試劑盒 北京普瑞華盛生物科技有限公司；TG16-WS臺(tái)式離心機(jī) 湘儀離心機(jī)儀器有限公司；U3000液相色譜系統(tǒng) 美國(guó)戴安公司；API3200 QTrap質(zhì)譜系統(tǒng)、移液器 美國(guó)應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；超低溫冰箱（－80 ℃） 青島海爾集團(tuán)；TWK-2001氮吹儀 湖北武漢泰沃康儀器設(shè)備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品衍生化處理

移取40 μL原始乳樣，置于1.5 mL離心管中，向離心管中加入10 μL磺基水楊酸，渦旋振蕩30 s后13 200 r/min高速離心4 min。小心吸取10 μL上層液體于另一1.5 mL干凈的離心管中。向離心管中加入40 μL標(biāo)記緩沖液，渦旋振蕩混勻后13 200 r/min高速離心4 min。移取10 μL上層液體置于另一1.5 mL干凈的離心管。每個(gè)離心管中分別加入5 μL稀釋的iTRAQ試劑，混勻。室溫條件下孵化至少30 min。加入5 μL羥胺，渦旋振蕩混勻后13 200 r/min離心4 min。加入32 μL內(nèi)標(biāo)物，渦旋混勻，13 200 r/min高速離心4 min，上樣檢測(cè)。

1.3.2 HPLC-MS/MS檢測(cè)條件

HPLC條件：色譜柱MSLab HP-C18（150 mm×4.6mm，5 μm）；流速0.8 mL/min；柱溫50 ℃；流動(dòng)相A為水-0.1%甲酸；B為乙腈-0.1%甲酸溶液；進(jìn)樣量3 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Gradient elution program

MS條件：電噴霧離子源，正離子模式；多反應(yīng)監(jiān)測(cè)掃描方式；氣簾氣20 psi；碰撞氣為Medium；噴霧電壓＋5 500 V；霧化溫度500 ℃；霧化氣55 psi；輔助氣60 psi；去族電壓35 V；射入電壓10 V；碰撞能量30 eV；碰撞室射出電壓5 V。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

本研究測(cè)定氨基酸質(zhì)量濃度結(jié)果均以 ±s表示，使用SPSS 17.0程序?qū)z測(cè)的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，使用Levene法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差齊性分析。根據(jù)P值大小來判斷差異性。當(dāng)P值小于0.05時(shí)則被認(rèn)為差異顯著，P值大于0.05則被認(rèn)為無顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 游離氨基酸種類的鑒定

圖1 44 種氨基酸的總離子圖Fig. 1 Total ion current chromatogram of 44 amino acids

乙腈和0.1%甲酸溶液作為流動(dòng)相采用梯度洗脫的液相條件下，12 min內(nèi)44 種氨基酸全部流出，其中正異亮氨酸（Nle）和正纈氨酸（Nva）屬于非人體內(nèi)氨基酸，Nle在樣品預(yù)處理步驟引入，通過Nle回收率來校準(zhǔn)測(cè)定結(jié)果，Nva于標(biāo)記步驟引入，用以檢驗(yàn)標(biāo)記反應(yīng)的效率，在80%～120%范圍內(nèi)為合格，反之作廢[17]。樣品中42 種氨基酸和2 種質(zhì)控氨基酸（Nva、Nle）即44 種氨基酸的總離子檢測(cè)水平如圖1所示。樣品檢測(cè)較為順利，各離子分離較好，質(zhì)控的2 種氨基酸回收率上無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明在本實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)過程中系統(tǒng)誤差較小。

2.2 人初乳、人常乳、牛初乳、牛常乳中游離必需氨基酸的差異分析

表2 人初乳、人常乳、牛初乳、牛常乳中游離必需氨基酸檢測(cè)結(jié)果Table 2 Contents of free essential amino acids in human colostrum,human milk, bovine colostrum and bovine milk μg/L

人初乳中游離氨基酸總量約為0.63 g/L；人常乳中游離氨基酸總量約為0.37 g/L，人初乳和人常乳中均含有9 種必需氨基酸。經(jīng)t檢驗(yàn)分析得知，人初乳和人常乳中His、Ile、Lys、Met具有顯著性差異（P＜0.05），其余的5 種必需氨基酸在兩者間無顯著性差異（P＞0.05），如表2所示。早有研究證明人乳可增強(qiáng)免疫力，人初乳和人常乳中Thr、Val的含量最高，且這2 種氨基酸都具有提高免疫力的功能[18-19]。人初乳中只有His質(zhì)量濃度高于人常乳，His可參與外周神經(jīng)的感覺與信號(hào)傳遞，對(duì)嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育起著重要作用[20]。人常乳中Lys的質(zhì)量濃度顯著高于人初乳，可增強(qiáng)機(jī)體免疫力和具有促進(jìn)脂肪分解等功能[21]。質(zhì)量濃度最高，且具有提高免疫活性的Thr、Val在人初乳和人常乳中無顯著差異，未來可對(duì)這2 種游離氨基酸功能進(jìn)一步研究，探究其與人初乳較強(qiáng)免疫活性的關(guān)系。

牛初乳中游離氨基酸總量約為0.32 g/L；牛常乳中游離氨基酸總量約為0.16 g/L。牛初乳和牛常乳中均含有9 種必需氨基酸。牛初乳中除游離Lys含量顯著低于牛常乳（P＜0.05），其他8 種必需氨基酸含量都顯著高于牛常乳（P＜0.05），特別是游離的Val在牛初乳中含量最高，這同劉鋒[22]、楊檢林[23]等的研究結(jié)果近似。有研究證明，牛初乳能夠調(diào)節(jié)機(jī)體血糖，對(duì)糖尿病具有較好的輔助治療效果，通過對(duì)表2數(shù)據(jù)的分析發(fā)現(xiàn)，牛初乳中Val、Leu質(zhì)量濃度較高，且這2 種氨基酸均具有調(diào)節(jié)血糖濃度的作用，未來可據(jù)此添加適量Val、Leu，研制輔助降血糖的功能乳制品[24-26]。

經(jīng)t檢驗(yàn)分析得知，人常乳中9 種游離氨基酸質(zhì)量濃度均顯著高于牛常乳（P＜0.05）。人常乳中Thr質(zhì)量濃度最高，其次分別是Val、Lys、Leu。而牛常乳中Val質(zhì)量濃度最高，Lys其次。人常乳中的His質(zhì)量濃度顯著高于牛常乳近16 倍，其對(duì)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育極為重要。人常乳中Ile含量高于牛常乳約13 倍，而Ile在人體內(nèi)被消化吸收后可通過不同的代謝途徑成為各種人體激素和酶的原料，可促進(jìn)嬰幼兒的生長(zhǎng)發(fā)育。人常乳中，Thr、Val、Lys、Ile的質(zhì)量濃度都很高且都顯著高于牛常乳，這4 種氨基酸都具有增強(qiáng)免疫力的作用，其含量配比可作為生產(chǎn)嬰幼兒乳品時(shí)的參考[27-29]。

2.3 人初乳、人常乳、牛初乳、牛常乳中游離非必需氨基酸的差異分析

表3 人初乳、人常乳、牛初乳、牛常乳中游離非必需氨基酸檢測(cè)結(jié)果Table 3 Contents of free non-essential amino acids in human colostrum, human milk, bovine colostrum and bovine milk μg/L

如表3所示，人初乳和人常乳中均含有以上11 種非必需氨基酸，人初乳和人常乳中Gly、Tyr、Cys的質(zhì)量濃度無顯著性差異（P＞0.05）。人初乳中Ser、Asn、Asp、Glu、Gln、Ala這6 種氨基酸質(zhì)量濃度顯著高于人常乳，Arg、Pro的質(zhì)量濃度顯著低于人常乳（P＜0.05）。游離氨基酸總量隨著泌乳時(shí)間的延長(zhǎng)基本呈下降趨勢(shì)，其中Glu在不同時(shí)期的質(zhì)量濃度均為最高，這與徐麗[30]、吳立芳[31]等的結(jié)論一致。這些氨基酸在機(jī)體生命活動(dòng)過程中起著十分重要的作用，其中，Glu、Asp為“興奮性氨基酸”，可維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)平衡[32]，有助于嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育。

實(shí)驗(yàn)測(cè)得牛初乳中含有8 種游離的非必需氨基酸，牛常乳中含有7 種，牛初乳中未檢出Asn、Asp，而牛常乳中還未檢出Pro。經(jīng)t檢驗(yàn)得，牛初乳和牛常乳中的Ser無顯著性差異（P＞0.05）。牛初乳中Arg、Gly、Tyr、Ala質(zhì)量濃度顯著高于牛常乳（P＜0.05）。牛初乳中Ala的質(zhì)量濃度最高，其在機(jī)體內(nèi)可輔助葡萄糖代謝，緩解由機(jī)體血糖水平較低引起的癥狀，Gly質(zhì)量濃度約為牛常乳中的3 倍，其對(duì)肝、腎、骨骼肌中的多種細(xì)胞系具有保護(hù)作用，也可參與神經(jīng)信號(hào)傳遞[33]；Arg質(zhì)量濃度約為牛常乳中的2 倍，Arg對(duì)機(jī)體的內(nèi)分泌系統(tǒng)具有重要作用，促進(jìn)生長(zhǎng)激素、胰島素的生成和分泌[34]。牛初乳中以上這些游離氨基酸質(zhì)量濃度較高，可能是牛初乳具有保健功能的原因之一。在牛常乳中，Glu、Gln質(zhì)量濃度顯著高于牛初乳，Glu的質(zhì)量濃度最高，L-Glu可脫羧形成一種具有傳遞抑制性神經(jīng)信號(hào)的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸，可用于改善兒童神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育，而L-Gln具有抗氧化、調(diào)節(jié)代謝、減少胃腸源性炎癥、提高人體免疫力的功能[35]。

實(shí)驗(yàn)測(cè)得人常乳中含有11 種非必需游離氨基酸，牛常乳中含有其中7 種，人乳中氨基酸種類較牛乳中氨基酸種類更為齊全。比較發(fā)現(xiàn)，除Gln外，人常乳中非必需氨基酸質(zhì)量濃度均高于牛常乳，牛常乳和人常乳中非必需氨基酸質(zhì)量濃度均存在顯著性差異（P＜0.05）。牛常乳中未檢出Asn、Asp、Cys和Pro，而這4 種氨基酸在機(jī)體內(nèi)均具有一定的生理功能。Asp在機(jī)體的合成途徑是將Glu通過轉(zhuǎn)氨作用將氨基轉(zhuǎn)給草酰乙酸而獲得，在機(jī)體內(nèi)還是多種氨基酸例如Lys、Ile等以及堿基的前體；L-Asn在體內(nèi)的合成途徑是Asp通過β-羥基酰胺化作用轉(zhuǎn)化得來的[36]；L-Cys可抑制酪氨酸酶，調(diào)節(jié)黑色素[37]；L-Pro在生物體內(nèi)可被轉(zhuǎn)化成L-羥脯氨酸，L-羥脯氨酸可以穩(wěn)定膠原蛋白，進(jìn)而有抗骨質(zhì)疏松，減少皮膚皺紋并保濕的作用[38]。人常乳較牛常乳而特有的功能性，可能與這4 種游離氨基酸有關(guān)。

2.4 人初乳、人常乳、牛初乳、牛常乳中非蛋白質(zhì)編碼氨基酸的差異分析

人乳中一般含有游離的22 種非蛋白質(zhì)編碼氨基酸。由表4可知，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得人初乳、人常乳樣品中均含有其中15 種，人乳中未檢出Cth、Hcy、Car、Hyl、Sar、Asa、Hcit這7 種游離氨基酸。人初乳和人常乳中GABA、Ans、β-Ala、β-Aib、PEtN的質(zhì)量濃度無顯著性差異（P＞0.05）。人初乳中Tau、Cit、Orn、Abu、Etn、1-MHis質(zhì)量濃度顯著高于人常乳，其余4 種質(zhì)量濃度顯著低于人常乳（P＜0.05）。Tau在人乳中這22 種非蛋白質(zhì)編碼氨基酸中質(zhì)量濃度最高，它可促進(jìn)大腦細(xì)胞DNA、RNA及蛋白質(zhì)的合成，對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)傳導(dǎo)和視覺機(jī)能形成起著重要作用，有助于嬰兒智力發(fā)育，還具有降血糖功能[39-41]。

實(shí)驗(yàn)測(cè)定的22 種非蛋白質(zhì)編碼氨基酸中，牛初乳中含有16 種，牛常乳中含有15 種，而牛初乳中未檢出Cth、Hcy、Car、Hyl、Asa、Hcit，并且牛常乳中還未檢出Sar。經(jīng)t檢驗(yàn)得，牛常乳和牛初乳中除Ans、PSer的質(zhì)量濃度無顯著性差異（P＞0.05），其他14 種氨基酸具有顯著性差異（P＜0.05）。牛初乳中GABA、Aad、Cit、β-Ala、β-Aib、1-MHis這6 種游離氨基酸質(zhì)量濃度顯著低于牛常乳，其余8 種游離氨基酸質(zhì)量濃度均顯著高于牛常乳。牛初乳的16 種非蛋白質(zhì)編碼氨基酸中Tau質(zhì)量濃度最高，其次是PEtN、Etn，而牛常乳中PetN質(zhì)量濃度最高，但牛初乳中PEtN的含量約為常乳的2 倍。從游離氨基酸組成和質(zhì)量濃度推斷，牛初乳的生理活性可能強(qiáng)于牛常乳。

牛常乳和人常乳中均未檢出Cth、Hcy、Car、Hyl、Sar、Asa、Hcit這7 種氨基酸。在牛常乳和人常乳中除GABA、Ans質(zhì)量濃度無顯著性差異（P＞0.05），其余游離氨基酸都具有顯著性差異（P＜0.05）。人常乳中Tau質(zhì)量濃度最高，PEtN質(zhì)量濃度僅次于Tau。牛常乳中有Aad、Orn、Ans、β-Ala、β-Aib、Etn、Hyp、PEtN這8 種氨基酸質(zhì)量濃度高于人常乳，其余7 種氨基酸質(zhì)量濃度低于人常乳。

在本研究檢測(cè)的42 種游離氨基酸中，牛常乳中含有31 種，人常乳中含有35 種，其中25 種游離氨基酸的質(zhì)量濃度高于牛常乳。牛初乳中游離的His、Ile、Leu、Phe等17 種游離氨基酸隨著母體泌乳時(shí)間的延長(zhǎng)質(zhì)量濃度逐漸減少；人乳中的His、Phe、Thr等17 種游離的氨基酸質(zhì)量濃度隨著母體泌乳時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸降低。

3 結(jié) 論

通過iTRAQ標(biāo)記結(jié)合HPLC-MS/MS技術(shù)對(duì)不同泌乳期人乳和牛乳中42 種氨基酸進(jìn)行檢測(cè)，比較分析了其中必需游離氨基酸、非必需游離氨基酸、非蛋白質(zhì)編碼氨基酸的種類及含量的差異。從總體上看，測(cè)定的42 種氨基酸，其中有11 種游離氨基酸在牛常乳中未檢出，而在人常乳為7 種，即人乳中氨基酸種類較牛乳中游離氨基酸的種類更豐富。隨著泌乳時(shí)間的延長(zhǎng)，游離氨基酸總量呈下降趨勢(shì)。從氨基酸總量上看，無論是初乳時(shí)期還是常乳時(shí)期人乳中游離氨基酸含量總是高于牛乳，即人乳游離氨基酸總量高于牛乳，這些游離氨基酸具有促進(jìn)人體生長(zhǎng)發(fā)育、增強(qiáng)免疫力、調(diào)節(jié)血糖、調(diào)節(jié)脂肪代謝等作用。未來可參考人常乳與牛常乳檢測(cè)結(jié)果，研制更利于嬰幼兒生長(zhǎng)發(fā)育，游離氨基酸含量和種類更接近母乳的嬰幼兒配方奶粉，參考不同泌乳期的檢測(cè)結(jié)果研制具有輔助調(diào)血糖、調(diào)血脂、增強(qiáng)免疫力的功能性乳制品。隨著iTRAQ標(biāo)記結(jié)合HPLC-MS/MS技術(shù)的廣泛應(yīng)用，未來可以應(yīng)用此方法對(duì)不同地區(qū)的母乳氨基酸種類和含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，找出區(qū)域差異性，建立我國(guó)母乳氨基酸數(shù)據(jù)庫。

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