特基拉芽孢桿菌精氨酸酶基因的重組表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)

趙 齊，馮志彬，秦 雪，徐勤省，任夢云，潘 瀟，張洪霞，張 娟,*

精氨酸酶是具有兩個活性中心（金屬離子結(jié)合位點(diǎn)與底物結(jié)合位點(diǎn)）的一類堿性氨基酸水解酶，活性需要金屬離子的參與[1-5]。早在20世紀(jì)初，人們在哺乳動物的肝臟中首次發(fā)現(xiàn)了精氨酸酶[6]，該酶具有水解精氨酸的作用。隨著研究的深入，在動物、植物和微生物中都發(fā)現(xiàn)了精氨酸酶。在脊椎動物中，目前發(fā)現(xiàn)存在兩種類型的精氨酸酶，精氨酸酶1型稱為細(xì)胞質(zhì)或者肝型精氨酸酶，主要存在于動物的肝臟細(xì)胞中，精氨酸酶2型為線粒體型或者非肝型精氨酸酶，常見于小腸、腎等肝細(xì)胞外的臟器細(xì)胞中[7-12]。由于精氨酸酶能夠催化精氨酸生成鳥氨酸和尿素[13]，而正常細(xì)胞對精氨酸缺乏的耐受性要強(qiáng)于腫瘤細(xì)胞，因此精氨酸酶能夠通過分解細(xì)胞中的精氨酸有效地抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[14-16]。有研究發(fā)現(xiàn)，人類1型精氨酸酶的點(diǎn)突變造成了高精氨酸敗血癥[17-19]。在植物中，精氨酸是很多植物種子N元素的重要組成部分，占總含氮量17%左右，因此在種子萌發(fā)和幼苗的生長發(fā)育階段，精氨酸酶活力逐漸升高，分解精氨酸以促進(jìn)氮素的循環(huán)利用。對玉米精氨酸酶的研究發(fā)現(xiàn)，提高玉米中精氨酸酶活力能夠顯著促進(jìn)植株的生長，提高干物質(zhì)的積累。在一些微生物中也發(fā)現(xiàn)了精氨酸酶，并對其催化特性進(jìn)行了深入的研究。

目前精氨酸酶的工業(yè)應(yīng)用主要在于酶法生產(chǎn)L-鳥氨酸，L-鳥氨酸是生物體內(nèi)普遍存在的一種非蛋白氨基酸，參與蛋白質(zhì)、糖以及脂肪的分解代謝。近年來的醫(yī)療研究顯示，L-鳥氨酸在保肝護(hù)肝、促進(jìn)病人康復(fù)方面療效顯著，同時作為一種功能性氨基酸，L-鳥氨酸能夠改善營養(yǎng)，具有保健作用[1-4]，目前L-鳥氨酸已被廣泛應(yīng)用于制藥、工業(yè)、保健和食品生產(chǎn)，其市場前景遠(yuǎn)大。L-鳥氨酸的化學(xué)合成法步驟繁多，產(chǎn)物含有外消旋混合物，分離困難，難以大規(guī)模生產(chǎn)。微生物發(fā)酵法因微生物代謝途徑復(fù)雜，突變菌株的篩選困難，易發(fā)生突變，并且L-鳥氨酸產(chǎn)量低，發(fā)酵液成分復(fù)雜，后續(xù)分離純化成本高，而酶水解法因?qū)Ｒ恍院軓?qiáng)受到研究者的關(guān)注。

精氨酸酶的挖掘與研究是利用酶法大規(guī)模生產(chǎn)L-鳥氨酸的基礎(chǔ)。微生物來源的精氨酸酶多見于芽孢桿菌屬，其催化精氨酸產(chǎn)生L-鳥氨酸的活性較高。其中Bacillus caldovelox來源的精氨酸酶與L-精氨酸的Km最低，為3.4 mmol/L。其次是芽孢桿菌屬B. brevis、B. subtilis KY3281以及B. thuringierisis，它們與L-精氨酸的Km值均較低，這表明它們與底物的親和力高，非常適用于以L-精氨酸為底物催化生產(chǎn)L-鳥氨酸[4,19-22]。B. caldovelox來源的精氨酸酶相應(yīng)的重組蛋白發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸的產(chǎn)量達(dá)112.3 g/L，該酶的最適反應(yīng)溫度較高，達(dá)到60 ℃，然而此溫度下酶的穩(wěn)定性受到影響，限制了其工業(yè)化應(yīng)用[4]。最近研究發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬B. amyloliquefaciens來源的精氨酸酶在B. subtilis中過量表達(dá)，其L-鳥氨酸的產(chǎn)量達(dá)到356.9 g/L[13]。由此可見，芽孢桿菌屬精氨酸酶的開發(fā)潛力巨大。

本研究通過對特基拉芽孢桿菌（B. tequilensis）進(jìn)行全基因組比對分析，從本實(shí)驗(yàn)室1 株B. tequilensis PanD37[23]克隆到一個精氨酸酶基因，并命名為BteqARG，構(gòu)建原核表達(dá)載體后在大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）中高效表達(dá)該基因，酶活力分析顯示該酶對pH 8.0～10.0的催化環(huán)境以及50～60℃高溫耐受性好，酶活力高，生產(chǎn)成本低，有重要應(yīng)用價值。此研究可以為精氨酸酶基因的研究提供參考素材，也為進(jìn)一步研究和開發(fā)新型精氨酸酶提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

產(chǎn)精氨酸酶的菌株來自于本實(shí)驗(yàn)保存菌種B. tequilensis PanD37[23]；原核表達(dá)載體pET28a（＋）EMD Biosciences （Novagen）公司；E. coli DH5α、E.coli BL21（DE3） 北京全式金生物有限公司。

Ex Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒、改良型Bradford蛋白濃度測定試劑盒 上海生工生物工程股份有限公司；Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒 北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；L-精氨酸、L-鳥氨酸、三氯乙酸 北京鼎國生物技術(shù)有限公司；PCR引物合成 生工生物工程（上海）股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

核酸電泳儀、蛋白電泳儀 美國伯樂公司；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀德國Eppendorf公司；高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 安捷倫科技（中國）有限公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)基的配制

LB液體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g/L，酵母提取物 5 g/L，氯化鈉5 g/L，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為7.0；LB固體培養(yǎng)基是在LB液體培養(yǎng)基中加入15 g/L的瓊脂粉，培養(yǎng)基的滅菌條件皆為：121 ℃，20 min。

1.3.2 BteqARG基因的擴(kuò)增

根據(jù)NCBI公布的B. tequilensis全基因組序列（LGRW01000001）設(shè)計(jì)引物，在上游加入NcoI酶切位點(diǎn)，引物命名為BteqARG-NcoIF：5’-AACCATGGATAA AACGATTTCGGTTATTGG-3’；在下游加入XhoI酶切位點(diǎn)，引物命名為BteqARG-XhoIR：5’-TTCTCGAGTTACA GCAGCTTCTTCCCTAAC-3’，下劃線部分為酶切位點(diǎn)。

在LB液體培養(yǎng)基中接種本實(shí)驗(yàn)保存的B. tequilensis，30 ℃、200 r/min培養(yǎng)16 h，離心收集菌體，利用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（B518225）提取其基因組DNA。具體抽提方法詳見該試劑盒說明書。

以提取的B. tequilensis基因組DNA為模板，進(jìn)行BteqARG基因的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為20 μL，其中基因組DNA 0.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，Ex Taq DNA聚合酶 0.2 μL，10×聚合酶緩沖液 2 μL，dNTPs（10 mmol/L） 0.4 μL，不足部分用ddH2O補(bǔ)齊。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性40 s，56 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min；PCR產(chǎn)物使用1.0 g/100 mL瓊脂糖凝膠電泳檢測，使用DNA凝膠回收試劑盒（B511139）進(jìn)行回收。

1.3.3 重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建

使用NcoI和XhoI對載體pET28a（＋）和BteqARG基因瓊脂糖凝膠電泳回收的目的片段分別進(jìn)行雙酶切，目的基因片段和載體片段用T4 DNA連接酶于16 ℃連接過夜，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E. coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，并涂布在含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)12～16 h進(jìn)行篩選，篩選得到的重組載體進(jìn)行菌落PCR和質(zhì)粒雙酶切鑒定，陽性克隆進(jìn)行測序驗(yàn)證（華大基因），將驗(yàn)證正確的質(zhì)粒載體命名為pET28a-BteqARG。

1.3.4 重組工程菌的構(gòu)建及重組蛋白的表達(dá)純化

重組表達(dá)載體pET28a-BteqARG熱激轉(zhuǎn)化至E. coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含50 μg/mL卡那霉素的LB固體培養(yǎng)基平板進(jìn)行篩選，37 ℃培養(yǎng)12～16 h后，挑取單菌落進(jìn)行PCR鑒定，陽性克隆可進(jìn)一步進(jìn)行蛋白的誘導(dǎo)和純化，該重組工程菌菌株被命名為BteqARG-BL21（DE3）。

挑取陽性轉(zhuǎn)化子接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，于37 ℃過夜培養(yǎng)獲得種子培養(yǎng)液。然后以體積比1∶100的比例將種子培養(yǎng)液接種于含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.2左右，調(diào)節(jié)培養(yǎng)溫度至20 ℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.4～0.5時，取出1 mL菌液作對照組，剩下菌液加入終濃度為1.0 mmol/L的異丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)時間為12～16 h，誘導(dǎo)完成后，4 ℃離心收集菌體，超聲波破碎后離心收集上清液，使用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析，收集的上清液可溶性蛋白利用Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白，獲得BteqARG純化蛋白，利用Bradford蛋白分析試劑盒測定純化蛋白的濃度，并利用SDS-PAGE進(jìn)行檢測。

1.3.5 BteqARG酶學(xué)性質(zhì)測定

1.3.5.1 BteqARG酶活力測定

以L-精氨酸為底物，根據(jù)參考文獻(xiàn)[19,24-25]方法在pH 10.0條件下測定BteqARG的酶活力。反應(yīng)體系為200 μL：5 μL提純酶液，100 μL Tris-HCl緩沖液（pH 10.0，50 mmol/L）、5 μL底物（L-精氨酸，其終濃度為200 mmol/L），添加終濃度為2 mmol/L Mn2＋作為激活劑，反應(yīng)液45 ℃溫育15 min，然后加入等體積10 g/100 mL三氯乙酸終止反應(yīng)，AccQ·Tag法[17]測定酶活力，使用Waters公司的AccQ·Fluor試劑盒柱前衍生，HPLC檢測L-鳥氨酸含量。精氨酸酶活力定義：在pH 10.0、溫度45 ℃的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化生成產(chǎn)物L(fēng)-鳥氨酸1 μmol所需的酶量定義為1個酶活力單位，簡稱為U/mL。

1.3.5.2 溫度、pH值和金屬離子對BteqARG酶活力的影響

按上述方法，以L-精氨酸為底物，在Tris-HCl緩沖液（pH 10.0、50 mmol/L）中分別測定不同溫度（30～60 ℃）條件下的酶活力，以最高酶活力為100%，分析溫度對酶活力的影響；分別把提純的酶液保存在30～60 ℃之間的不同溫度條件下4 h，然后依據(jù)上述方法測定酶活力，檢測酶的溫度穩(wěn)定性，以不進(jìn)行溫度處理直接測定的酶活力為100%。

配制pH值范圍為7.0～11.5的Tris-HCl緩沖液，以L-精氨酸為底物，在45 ℃條件下測定酶活力，以最高酶活力為100%，分析pH值對酶活力的影響；利用不同pH值緩沖液稀釋酶液，放置4 ℃，4 h后取樣測定酶活力，以最高酶活力為100%，分析酶的pH值穩(wěn)定性。

在上述確定的最適反應(yīng)條件下，以L-精氨酸為底物，在反應(yīng)液中分別添加1 mmol/L不同二價金屬離子的氯鹽（Cu2＋、Ca2＋、Co2＋、Mn2＋、Ni2＋、Fe2＋、Mg2＋和Zn2＋），以不添加任何金屬離子時的酶活力為100%，分析金屬離子對酶活力的影響。

1.3.5.3 BteqARG酶米氏常數(shù)（Km）和最大反應(yīng)速率（Vmax）測定

酶的反應(yīng)在最適溫度、最適pH值條件下進(jìn)行，分別添加不同濃度的L-精氨酸（0、5、10、20、40、80、100 mmol/L）為底物，反應(yīng)終止后，測定反應(yīng)生成的鳥氨酸的量，利用米氏方程的雙倒數(shù)法測定精氨酸對該酶的Km值和最大反應(yīng)速率Vmax，以已知濃度的鳥氨酸作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 BteqARG基因的克隆與重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用PCR方法克隆獲得B. tequilensis精氨酸酶基因BteqARG（圖1A，泳道1，箭頭所示），該精氨酸酶基因含有一個891 bp的開放閱讀框，編碼297 個氨基酸序列。將該基因的PCR片段連接到pET28a載體上，獲得重組質(zhì)粒pET28a-BteqARG。該質(zhì)粒經(jīng)NcoI和XhoI雙酶切鑒定，可切出預(yù)期大小的目的條帶（圖1B，泳道1）。取該重組質(zhì)粒送華大基因進(jìn)行測序，獲得的基因序列長度為891 bp，其對應(yīng)的氨基酸序列與幾個文獻(xiàn)報道的芽孢桿菌屬的精氨酸酶的氨基酸序列進(jìn)行同源比對（圖2），結(jié)果顯示，BteqARG基因的氨基酸序列與解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）精氨酸酶基因的氨基酸序列同源性最高達(dá)92%；與熱溶芽孢桿菌（B. caldovelox）精氨酸酶的氨基酸序列同源性有70%，與炭疽芽孢桿菌（B. anthracis）來源的精氨酸酶氨基酸同源性為71%。

圖1 精氨酸酶基因的克?。ˋ）與重組質(zhì)粒的酶切驗(yàn)證（B）Fig. 1 Electrophoretic analysis of PCR products of arginase gene and enzymatic digestion of recombinant plasmid

圖2 部分芽孢桿菌屬來源的精氨酸酶氨基酸序列同源性比對分析Fig. 2 Comparative analysis of sequence homology of arginases from some Bacillus species

2.2 重組BteqARG酶的原核表達(dá)

圖3 重組菌BteqARG-BL21（DE3）表達(dá)產(chǎn)物的SDS-PAGE圖Fig. 3 SDS-PAGE analysis of proteins expressed in recombinant BteqARG-BL21(DE3)

利用IPTG誘導(dǎo)重組BteqARG酶的表達(dá)，結(jié)果如圖3所示，目的蛋白即重組BteqARG酶的分子質(zhì)量在30～40 kDa之間。加入IPTG的終濃度為1 mmol/L，培養(yǎng)溫度為37 ℃，重組酶的誘導(dǎo)溫度為20 ℃，低溫誘導(dǎo)有利于重組蛋白的可溶性表達(dá)，避免包涵體的形成。利用Ni-NTA吸附柱，成功純化出重組BteqARG酶蛋白（圖3），箭頭所指為目的蛋白條帶。

2.3 BteqARG的酶學(xué)性質(zhì)分析

為了確定BteqARG酶活力，測定重組酶的粗酶催化精氨酸生成鳥氨酸的活力，該重組酶具有較高的精氨酸酶的活力，達(dá)到了1 109.8 U/mL，具有工業(yè)化應(yīng)用的潛力。

2.3.1 溫度、pH值和金屬離子對BteqARG酶活性的影響

2.3.1.1 最適反應(yīng)溫度與溫度穩(wěn)定性

圖4 溫度對BteqARG酶活力及穩(wěn)定性的影響Fig. 4 Effect of temperature on the activity and stability of arginase

如圖4所示，分析不同溫度對BteqARG酶活力的影響，該酶在30～60 ℃均具有一定的酶活力，隨著溫度的升高，酶活力逐漸增加，45 ℃時達(dá)到最高，然后隨著溫度的升高開始降低。推斷該酶的最適反應(yīng)溫度為45 ℃。在不同溫度下保存該酶4 h后，在最適反應(yīng)條件下測定酶活力，結(jié)果顯示，在30 ℃保溫4 h后，酶活力保持不變，繼續(xù)提高溫度，剩余相對酶活力保持穩(wěn)定，在60 ℃保溫4 h后，剩余酶活力仍保持在85%左右。

2.3.1.2 最適反應(yīng)pH值與pH值穩(wěn)定性

圖5 pH值對BteqARG酶活力及穩(wěn)定性的影響Fig. 5 Effect of pH value on the activity and stability of arginase

如圖5所示，在不同pH值條件下測定BteqARG酶活力，發(fā)現(xiàn)在pH值為10.0達(dá)到最大。將提純酶液在不同pH值緩沖液中低溫保存24h后測定剩余酶活力。從pH值穩(wěn)定性曲線可以看出，該酶對pH 8.0～10.0的耐受性較好，在pH 8.0～10.0的緩沖液中4 ℃保存24 h，酶活力都只下降約2.0%～10.0%。在pH 9.0的緩沖液中酶活力基本穩(wěn)定，僅下降2.0%。

2.3.1.3 不同金屬離子對BteqARG酶活力的影響

不同金屬離子對該酶的影響不同，其中Mn2＋、Ni2＋、Co2＋對酶活力有明顯的激活作用，而其他離子對該酶活力的影響微弱（圖6）。以往的研究也表明Mn2＋是精氨酸酶的催化因子，能夠顯著提高酶活力[19]。

圖6 金屬離子對BteqARG酶活力的影響Fig. 6 Effects of metal ions on arginase activity

2.3.2 BteqARG酶的Km和Vmax測定結(jié)果

在pH 10.0、45 ℃條件下，以不同濃度的L-精氨酸為BteqARG酶的反應(yīng)底物，測定其反應(yīng)速率，利用Lineweaver-Burk作圖法求得該酶對精氨酸的Km值為10.72 mmol/L，BteqARG酶的動力學(xué)參數(shù)Kcat為298.75 s－1，Vmax值為555.6 μmol/（min·mg）（圖7），與其他芽孢桿菌來源的精氨酸酶比較接近[4]（表1）。上述結(jié)果表明BteqARG酶與精氨酸的親和力較高，酶催化反應(yīng)速率快，具有催化生產(chǎn)鳥氨酸的潛力。

圖7 BteqARG酶的Lineweaver-Burk圖Fig. 7 Lineweaver-Burk plot of arginase

表1 不同來源精氨酸酶動力學(xué)參數(shù)的比較Table 1 Enzymatic characteristics of arginases derived from different Bacillus species

3 結(jié) 論

作為生物體內(nèi)氮素循環(huán)的關(guān)鍵酶，精氨酸酶是一類二價陽離子依賴的水解酶，能夠水解精氨酸形成鳥氨酸和尿素。精氨酸酶一般存在于產(chǎn)生尿素的動物體內(nèi)，隨著研究的深入，目前在一些不生成尿素的魚類、植物和微生物中也發(fā)現(xiàn)了該酶。精氨酸酶因其催化特性在生物技術(shù)領(lǐng)域發(fā)揮著重要作用。作為半必需氨基酸，腫瘤細(xì)胞對精氨酸的耐受力低于正常細(xì)胞，因此精氨酸酶能夠有效地抑制腫瘤的生長[26-28]；在黃酒酵母的改造選育過程中，通過降低精氨酸酶的表達(dá)量能夠降低發(fā)酵液中尿素的含量[29]。玉米精氨酸酶的深入研究也發(fā)現(xiàn)，精氨酸酶的過量表達(dá)能夠協(xié)調(diào)作物的氮素循環(huán)，提高作物產(chǎn)量[30]。而工業(yè)上L-鳥氨酸的生產(chǎn)也開始從起始的工業(yè)合成和發(fā)酵法向精氨酸酶法轉(zhuǎn)移。目前已有許多文獻(xiàn)報道了不同來源的精氨酸酶的分離和性質(zhì)研究，因?yàn)槊笇W(xué)性質(zhì)的限制，能夠應(yīng)用于工業(yè)用途的精氨酸酶相對較少。本研究室從前期分離到的1 株枯草芽孢桿菌的近緣菌株B. tequilensis PanD37菌株中克隆到一個精氨酸酶基因，該基因全長891 bp，編碼297 個氨基酸。酶活力分析顯示，該酶的最適催化溫度為45 ℃，最適pH值為10.0，而且該酶的穩(wěn)定性較好，大腸桿菌中表達(dá)量高，通過誘導(dǎo)溫度的調(diào)整能夠使重組酶可溶性表達(dá)，保持了酶活力，具有一定的應(yīng)用價值。通過反應(yīng)條件的優(yōu)化可以進(jìn)一步提高產(chǎn)酶及催化能力，適合用于L-鳥氨酸的工業(yè)化生產(chǎn)。

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