蘋果轉(zhuǎn)錄因子MdHB1的原核表達(dá)與多克隆抗體制備

戴杰雨，姜永華，張玉潔，王豪杰，劉瀟然，劉翠華，任小林*

HD-Zip家族是植物特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，因其含有同源異型盒（homeobox domain，HD）與亮氨酸拉鏈結(jié)構(gòu)（leucine zipper，Zip）而得名。其結(jié)構(gòu)與動(dòng)物中的HDZip蛋白有所不同，表明很可能在高等植物的生長(zhǎng)發(fā)育過程中具有不同尋常的意義[1]。HD-ZipI亞家族的成員可能是整個(gè)家族中被研究最多的，從植物種子的發(fā)育[2]、花的開放與衰老[3-4]到果實(shí)的發(fā)育至衰老[3,5]等一系列生長(zhǎng)發(fā)育事件都有研究報(bào)道[6-7]。眾多研究表明，HD-ZipI通過植物激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，參與植物逆境脅迫的響應(yīng)；并且被發(fā)現(xiàn)既有正調(diào)控也有負(fù)調(diào)控，是植物蛋白高級(jí)結(jié)構(gòu)的一部分[7-9]。因此，HD-ZipI亞家族在植物的生命周期中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

模式植物番茄中，LeHB-1作為L(zhǎng)eACO1的轉(zhuǎn)錄因子，通過與其互作調(diào)控乙烯的合成，進(jìn)而影響番茄果實(shí)成熟衰老的進(jìn)程[3]。于巧平等[10]通過BLAST蘋果EST庫獲得了目標(biāo)EST序列，從澳洲青萍花器總cDNA中克隆到了MdHB1全長(zhǎng)序列；蘋果MdHB1屬于HD-ZipI亞家族，被認(rèn)為是MdACO1的轉(zhuǎn)錄因子。李興亮[11]發(fā)現(xiàn)，MdHB1與MdSnRK2.4功能域STKC（Ser/Thr protein kinasec）發(fā)生物理互作，使自身功能域HD被蛋白磷酸化修飾，引起MdACO1啟動(dòng)子活性的改變而影響乙烯的合成；這與以前的研究者推測(cè)其參與蘋果果實(shí)的成熟與衰老進(jìn)程相吻合，病毒誘導(dǎo)沉默實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持這一結(jié)論[12]。本實(shí)驗(yàn)室前期探索了該基因在蘋果的不同器官、不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)模式，結(jié)果表明在嘎啦的花瓣和花后40 d表達(dá)水平較高[13]；通過構(gòu)建酵母雙雜交cDNA文庫，篩選了與MdHB1互作的多個(gè)蛋白，涉及植物的脅迫響應(yīng)、能量代謝、光合作用等，表明MdHB1在蘋果生長(zhǎng)發(fā)育過程中功能廣泛[14]；通過β-葡萄糖醛酸酶（β-glucuronidase，GUS）基因瞬時(shí)表達(dá)實(shí)驗(yàn)等分析了MdHB1基因啟動(dòng)子中乙烯響應(yīng)元件，表明乙烯可以誘導(dǎo)MdHB1的表達(dá)[15]。綜上，MdHB1很可能與其他家族成員類似，廣泛參與蘋果生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控與環(huán)境脅迫的響應(yīng)。目前關(guān)于功能的研究主要是通過轉(zhuǎn)錄水平的變化來揭示，而轉(zhuǎn)錄因子最終是以蛋白的形式執(zhí)行功能的，因此蛋白方面的研究對(duì)于揭示MdHB1的功能十分必要。本研究利用大腸桿菌得到原核表達(dá)的MdHB1融合蛋白，Ni-NTA親和柱純化后作為抗原制備多克隆抗體；通過Western Blot實(shí)驗(yàn)和間接酶聯(lián)免疫（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明所得多克隆抗體效價(jià)較高，特異性良好，不僅能從菌體總蛋白中特異性識(shí)別MdHB1，也能從蘋果幼葉總蛋白中成功檢測(cè)MdHB1蛋白，為進(jìn)一步研究MdHB1提供了有力工具。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蘋果葉片采集于西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝場(chǎng)，品種為“澳洲青萍”。選取幼嫩新生葉，采集后隨即帶回實(shí)驗(yàn)室，液氮速凍，－80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

蛋白原核表達(dá)載體pGEX-6p-1和pET-28a（＋）本實(shí)驗(yàn)室保存；表達(dá)菌株BL2（DE3） 北京天根生化科技有限公司；限制性內(nèi)切酶（BamHI，EcoRI，SalI）、T4連接酶試劑盒（DNA Ligation Kit）、質(zhì)粒小提試劑盒、膠回收試劑盒、核酸Marker（DL2000）大連TaKaRa有限公司；植物膜蛋白提取試劑盒 上海貝博生物有限公司；蛋白分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔抗Anti-GST抗體 北京博奧森生物技術(shù)有限公司；辣根氧化酶標(biāo)記的二抗（羊抗兔IgGHRP） 西安沃爾森生物技術(shù)公司；辣根過氧化酶化學(xué)發(fā)光試劑盒 賽默飛世兒科技（中國）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

DYCZ-24DN迷你雙垂直電泳儀、DYCZ-40G型轉(zhuǎn)印電泳儀 北京六一儀器廠；JY88-IIN超聲破碎儀寧波新芝生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 MdHB1蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

在NCBI數(shù)據(jù)庫中搜索MdHB1基因獲得其cDNA序列（GenBank：JQ678788.1），在線軟件Conserved Domains Search Tool（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）用來預(yù)測(cè)基因的保守區(qū)域。利用DNASTAR對(duì)蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其柔韌性進(jìn)行預(yù)測(cè)。蛋白三維結(jié)構(gòu)同源建模在線軟件SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）用來構(gòu)建MdHB1蛋白的三維結(jié)構(gòu)。TRMHMM server v.2.0（http://www. cbs.dtu.d k/services/TMHMM-2.0/）預(yù)測(cè)蛋白的跨膜區(qū)域。

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)與基因片段克隆

根據(jù)得到的MdHB1序列，利用Primer 5.0設(shè)計(jì)所需要的引物。設(shè)計(jì)引物MdHB1-A1（5’-CGGGATCC ATGATGGAGCCGGGCCG-3’，下劃線處為BamHI酶切位點(diǎn)）和MdHB1-S1（5’-CGGAATTCTTATGACC ATCCCCACCAGTTCA-3’，下劃線處為EcoRI酶切位點(diǎn)），用于連接pGEX-6p1-1載體。設(shè)計(jì)引物MdHB1-A2（5’-CCGGAATTCATGGAGCCGGGCCGTT-3’,下劃線處為EcoRI酶切位點(diǎn)），與MdHB1-S2（5’-ACGC GTCGACTTATGACCATCCCCACCAGTT-3’，下劃線處為SalI酶切位點(diǎn)），用于連接pET-28a（＋）載體。此外，用于檢測(cè)MdHB1全長(zhǎng)的引物為MdHB1-F（5’-AGTTGTTTAGCTGGAAAAGAGATG-3’）和MdHB1-R（5’-CAATTTAGGGGATTTAGCCATTT AT-3’）。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司負(fù)責(zé)合成。

前期，于巧平等[10]以澳洲青萍的花器為材料，從其cDNA中克隆到了蘋果MdACO1的轉(zhuǎn)錄因子MdHB1基因。在此利用澳洲青萍的cDNA為模板，分別以MdHB1-（A1，S1）和MdHB1-（A2，S2）為引物進(jìn)行基因擴(kuò)增。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）體系（25 μL）為上下游引物（10 μmol/L）各1 μL，2×Es TaqMasterMix 25 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 20 μL。PCR程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸30 s，72 ℃終止延伸5 min；程序進(jìn)行擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離后，利用DNA回收試劑盒回收相應(yīng)大小產(chǎn)物。

1.3.3 原核表達(dá)載體構(gòu)建

MdHB1-（A1，S1）克隆回收的DNA產(chǎn)物經(jīng)過BamHI和EcoRI雙酶切后與經(jīng)過同樣酶切處理的pGEX-6p-1載體相連接，得到重組質(zhì)粒pGEX-6p-1-MdHB1（命名為6pHB）；同理，將MdHB1-（A2，S2）的基因克隆產(chǎn)物經(jīng)過EcoRI和SalI雙酶切后連入pET-28a（＋）載體,獲得重組質(zhì)粒pET-28a-MdHB1（命名為28aHB）。而后分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)DH5α，經(jīng)過菌液PCR和質(zhì)粒PCR檢測(cè)后，再通過測(cè)序驗(yàn)證重組載體中基因序列的正確性。

1.3.4 表達(dá)載體6pHB在大腸桿菌中的表達(dá)

提取質(zhì)粒6pHB和空載pGEX-6p-1，分別轉(zhuǎn)入大腸桿菌感受態(tài)BL21（DE3），挑取生長(zhǎng)健壯陽性菌株于LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)。37 ℃搖床200 r/min培養(yǎng)菌液OD600nm至0.7～0.8后，按照終質(zhì)量濃度50 mg/L的量加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside，IPTG）誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)8 h。離心收集菌體，移除上清液，按10 mL PBS/g菌體的量重懸菌體；利用超聲破碎儀進(jìn)行菌體細(xì)胞破碎，程序?yàn)椋?0%的能量，工作0.5 s，間歇2.5 s，破碎10 min；液氮速凍，存于－80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 MdHB1融合蛋白的可溶性分析與表達(dá)條件的優(yōu)化

取6pHB陽性菌株于37 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)OD600nm至0.7～0.8，加入終質(zhì)量濃度50 mg/L IPTG，混合均勻后分別取10 mL于18、28、37 ℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)8 h，收集，裂解菌體。再次離心，上清液存入新的離心管，沉淀中加入與上清液等體積的PBS重懸液并振蕩均勻。

在28 ℃條件下，終質(zhì)量濃度50 mg/L IPTG振蕩培養(yǎng)大腸桿菌0、2、4、6、8、10 h；終質(zhì)量濃度10 mg/L和100 mg/L的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白8 h；收集，裂解菌體。

以上樣品分別上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離檢測(cè)。

1.3.6 表達(dá)載體28aHB的誘導(dǎo)表達(dá)與蛋白純化

重組質(zhì)粒28aHB在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)過程如1.3.4節(jié)中的描述基本一致。誘導(dǎo)6 h的28aHB菌體，12 000×g、5 min離心收集，充分裂解后，按照Novagen公司的Ni-NTA His-bind resin親合柱的使用說明洗脫收集蛋白。并將純化前后的蛋白，Ni-NTA柱不吸附的穿柱蛋白液等用10% SDS-PAGE分離，SDS-PAGE檢測(cè)其純化效果。

1.3.7 多克隆抗體的制備

將純化后的蛋白樣品（MdHB1-His6）作為抗原，送往上海近岸蛋白科技有限公司進(jìn)行多克隆抗體制備。

1.3.8 間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)

抗原以50 mmol/L酸鹽包被緩沖液稀釋，每孔加入量為100 ng，4 ℃過夜；5%脫脂奶粉封閉液37 ℃封閉1 h；分別加入按照1 000、4 000、8 000 倍比例稀釋的抗體；37 ℃孵育1 h；洗滌，加入稀釋2 000 倍的IgGHRP二抗，37 ℃孵育1 h；最后加入以四甲基聯(lián)苯胺（tetramethyl benzidine，TMB）為底物的顯色液，室溫下暗室處理5 min，50 μL終止液（2 mol/L H2SO4溶液）終止顯色，酶標(biāo)儀測(cè)定酶標(biāo)板各孔的OD450nm。其中以包被液作為空白對(duì)照，以免疫前的陰性血作為陰性對(duì)照。

1.3.9 Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)抗體的特異性

經(jīng)10% SDS-PAGE分離6pHB菌株的總蛋白后，電壓100 V、1 h濕轉(zhuǎn)至0.45 μm的聚偏氟乙?。╬olyvinylidene fluoride，PVDF）膜上,在含有5%脫脂奶粉的鹽酸緩沖液（Tris-HCl-tween20，TBST）中4 ℃輕搖1 h封閉。用TBST稍加漂洗，分別以自制的Anti-MdHB1多克隆抗體和Anti-GST單克隆抗體為一抗，1∶2 000用TBST稀釋后，置于4 ℃靜止過夜。次日TBST洗滌3 次，每次10 min，再加入連有辣根氧化酶的羊抗兔IgG-HRP進(jìn)行二抗孵育45 min。再次以大量的TBST漂洗3 次后，加入化學(xué)發(fā)光底物進(jìn)行顯色拍照。澳洲青萍幼葉蛋白的提取利用植物膜蛋白提取試劑盒，Western Blot實(shí)驗(yàn)操作基本與上述相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 MdHB1的生物信息學(xué)分析

利用已經(jīng)公布的MdHB1蛋白推導(dǎo)序列，預(yù)測(cè)蛋白的結(jié)構(gòu)。保守區(qū)域預(yù)測(cè)在線軟件Conserved Domains Search的結(jié)果說明MdHB1屬于HD-ZipI亞家族。利用DNASTAR通過Garnier-Robson和Deleage-Roux兩種方法預(yù)測(cè)MdHB1的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其結(jié)果顯示各種結(jié)構(gòu)所占比例大約為：α-螺旋47%，β-折疊24%，無規(guī)則卷曲20%，β-轉(zhuǎn)角不超過10%；Karplus-Schulz方法預(yù)測(cè)的蛋白柔韌性區(qū)域約占整體的62.5%。利用在線三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)軟件SWISSMODEL形成的3D模型，其模板是人同源異形盒蛋白PRH（2m0c.1.A），兩者的相似性為47.37%（圖1）。此外，TRMHMM server v.2.0預(yù)測(cè)MdHB1無跨膜區(qū)域。

圖1 MdHB1蛋白的生物信息學(xué)分析Fig. 1 Predicted structure of MdHB1 protein

2.2 質(zhì)粒28aHB的構(gòu)建

在制備抗體時(shí)，較小的標(biāo)簽蛋白對(duì)于制備多克隆抗體的影響更小。選用了pET-28a（＋）表達(dá)載體，其中含有His基因，誘導(dǎo)表達(dá)后目的蛋白中帶有6×His標(biāo)簽蛋白（His6-tag）。純化融合蛋白，進(jìn)而作為抗原制備抗體。如圖2所示，重組質(zhì)粒28aHB的特異性條帶明顯高于空載；而在EcoRI和SalI雙酶切后，在4 000～7 000 bp之間兩者的特異性條帶位置一致，并且重組質(zhì)粒在1 000 bp左右有一條特異性條帶，這與MdHB1的理論值一致。通過膠回收1 000 bp左右的條帶，測(cè)序檢驗(yàn)，確定為MdHB1序列。至此，28aHB重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。

圖2 重組表達(dá)載體28aHB的雙酶切鑒定Fig. 2 Identification of the recombinant expression vector 28aHB by double enzyme digestion

2.3 重組質(zhì)粒28aHB的表達(dá)與蛋白純化

將28aHB載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21（DE3），37 ℃、200 r/min誘導(dǎo)培養(yǎng)轉(zhuǎn)菌株8 h后，離心收集，破碎菌體，SDS-PAGE上樣檢測(cè)。誘導(dǎo)后的28aHB在55 kDa處有明顯的特異性條帶，這比預(yù)測(cè)的融合蛋白MdHB1-His6分子質(zhì)量（44.4 kDa）略高，可能的原因是由于蛋白表達(dá)過程中自身的修飾，也有可能如唐威華等[16]的研究所述，由于His6-tag的存在，降低了融合蛋白的遷移速率。破碎后的菌體離心，分離上清液與沉淀；電泳顯示37 ℃誘導(dǎo)下，該融合蛋白絕大部分以包涵體的形式存在于沉淀中。通過Ni-NTA柱分離，洗脫，洗脫液中的融合蛋白條帶明顯，且只有一條明顯的特異性條帶，說明蛋白純化成功（圖3）。

圖3 重組質(zhì)粒28aHB的表達(dá)與蛋白純化Fig. 3 Expression of recombinant plasmid 28aHB and protein purification

2.4 間接ELISA法測(cè)定多克隆抗體的效價(jià)

由圖4可知，包被液（空白對(duì)照）和兩個(gè)陰性對(duì)照（未免疫血）與抗原均無明顯的陽性反應(yīng)；而分別稀釋1 000、4 000、8 000 倍的抗血清都產(chǎn)生了明顯的反應(yīng)，OD450nm都大于0.5，說明制備的多克隆抗體效果良好。

圖4 間接ELISA法測(cè)定多克隆抗體的效價(jià)結(jié)果Fig. 4 Titer of polyclonal antibody determined by indirect ELISA

2.5 原核表達(dá)載體6pHB的構(gòu)建

在進(jìn)行多克隆抗體的特異性檢測(cè)時(shí)，為了對(duì)其進(jìn)行交叉檢測(cè)，將MdHB1連接入另一個(gè)表達(dá)載體pGEX-6p-1（其中帶有GST基因），構(gòu)建6pHB載體，在大腸桿菌中誘導(dǎo)表達(dá)得到了MdHB1-GST融合蛋白，并優(yōu)化了其的表達(dá)條件。提取重組質(zhì)粒6pHB，用本實(shí)驗(yàn)所設(shè)計(jì)的引物MdHB1-（F，R）進(jìn)行PCR驗(yàn)證，如圖5所示，在構(gòu)建好的6pHB重組質(zhì)粒中克隆出了1 000 bp左右的特異性條帶。BamHI和EcoRI雙酶切重組質(zhì)粒得到兩條特異性條帶，其中一條1 000 bp左右，這與驗(yàn)證引物克隆出的特異性條帶的大小基本一致，并符合對(duì)MdHB1大小的預(yù)期；另外一條特異性條帶的大小位于4 000～7 000 bp之間，這個(gè)大小與BamHI和EcoRI雙酶切pGEX-6p-1空載得到的特異性條帶大小基本一致。未進(jìn)行雙酶切的6pHB和pGEX-6p-1載體作為對(duì)照，與其雙酶切結(jié)果相比，條帶顯示的位置都要分別低于酶切后的特異性條帶，驗(yàn)證了環(huán)狀DNA的電泳速度要快于開環(huán)DNA的結(jié)論；并且重組質(zhì)粒6pHB的分子質(zhì)量明顯大于空載。綜合以上結(jié)果，原核表達(dá)質(zhì)粒6pHB構(gòu)建成功。

圖5 重組表達(dá)載體6pHB酶切鑒定Fig. 5 Identification of the recombinant expression vector 6pHB by double enzyme digestion

2.6 重組質(zhì)粒6pHB的原核表達(dá)

重組質(zhì)粒6pHB轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)BL21（DE3），終質(zhì)量濃度50 mg/L的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h，離心收集菌體，裂解后上樣進(jìn)行SDS-PAGE。其中轉(zhuǎn)入空載pGEX-6p-1的大腸桿菌作為對(duì)照，進(jìn)行同樣的操作。結(jié)果顯示，重組質(zhì)粒在66.2 kDa處有一處明顯的蛋白聚集，這與預(yù)測(cè)的重組蛋白的分子大?。?4.4 kDa）基本符合；空載的蛋白在25～35 kDa之間有一條明顯的特異性條帶，這與標(biāo)簽蛋白GST的蛋白分子大?。?6 kDa）基本一致（圖6）。這些表明，通過誘導(dǎo)大腸桿菌，得到了6pHB表達(dá)后帶有GST-tag的融合蛋白（MdHB1-GST）。

圖6 6pHB誘導(dǎo)表達(dá)的SDS-PAGE分析Fig. 6 SDS-PAGE analysis showing the induced expression of 6pHB in E. coli

2.7 融合蛋白MdHB1-GST的可溶性分析

相同質(zhì)量濃度誘導(dǎo)劑（50 mg/L）的條件下，不同溫度誘導(dǎo)培養(yǎng)轉(zhuǎn)化6pHB的大腸桿菌，經(jīng)過菌體破碎，離心，分離上清液，重懸沉淀，分別得到了18、28 ℃和37 ℃誘導(dǎo)8 h菌體總蛋白的沉淀和上清液。如圖7所示，18 ℃和28 ℃的上清液中，70 kDa附近明顯的特異條帶明顯亮于37 ℃的上清液；而三者的沉淀中所含的融合蛋白MdHB1-GST都比上清液中的量要多，37 ℃誘導(dǎo)下差異最為明顯。這些說明該融合蛋白更多以包涵體的形式存在于沉淀中，并且較低的誘導(dǎo)溫度（18 ℃和28 ℃）更有利于MdHB1-GST可溶性形式的表達(dá)。

圖7 不同溫度誘導(dǎo)下融合蛋白MdHB1-GST可溶性分析Fig. 7 Analysis of soluble MdHB1-GST fusion protein at different temperatures

2.8 誘導(dǎo)時(shí)間和誘導(dǎo)物質(zhì)量濃度對(duì)融合蛋白MdHB1-GST表達(dá)的影響

28 ℃條件下，終質(zhì)量濃度50 mg/L的IPTG誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化6pHB的大腸桿菌表達(dá)用以探索表達(dá)時(shí)間對(duì)蛋白表達(dá)量的影響，不同質(zhì)量濃度的IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)8 h探索誘導(dǎo)物質(zhì)量濃度對(duì)融合蛋白表達(dá)量的影響。經(jīng)過SDS-PAGE分析，融合蛋白的表達(dá)量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有所增加，培養(yǎng)至8 h表達(dá)量基本達(dá)到了最大；而終質(zhì)量濃度10、50、100 mg/L的誘導(dǎo)劑對(duì)于融合蛋白最終表達(dá)量影響不大（圖8）。

圖8 不同誘導(dǎo)培養(yǎng)時(shí)間和IPTG質(zhì)量濃度對(duì)融合蛋白MdHB1-GST表達(dá)的影響Fig. 8 Effects of culture time and IPTG concentration on expression of recombinant MdHB1-GST

2.9 多克隆抗體特異性檢測(cè)結(jié)果

2.9.1 菌體總蛋白的Western Blot實(shí)驗(yàn)

圖9 菌體總蛋白的Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 9 Western Blot analysis of total bacterial protein

轉(zhuǎn)化6pHB的大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)后破碎獲得其菌體總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE，電濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上進(jìn)行Western Blot雜交實(shí)驗(yàn)。1、2兩條帶顯示，以自制的Anti-MdHB1為一抗時(shí)，在50～70 kDa之間有一條明顯的特異條帶，其分子質(zhì)量大小符合對(duì)融合蛋白MdHB1-GST預(yù)期；3、4泳道是以兔抗Anti-GST單克隆抗體為一抗進(jìn)行的雜交實(shí)驗(yàn)，其條帶位置與多克隆抗體雜交條帶是一致的（圖9）。這說明多克隆抗體能夠特異性的檢測(cè)到融合蛋白MdHB1-GST，并且也證明了6pHB表達(dá)的融合蛋白的正確性。

2.9.2 蘋果幼葉蛋白Western Blot實(shí)驗(yàn)

利用植物蛋白提取試劑盒提取澳洲青萍幼葉蛋白，取30 μL蛋白樣品SDS-PAGE分離，轉(zhuǎn)膜進(jìn)行Western Blot實(shí)驗(yàn)。如圖10所示，在70～100 kDa之間檢測(cè)出一條明顯的特異性條帶，這與MdHB1蛋白二聚體的分子質(zhì)量基本相符（38.4 kDa×2）。由此證明，自制Anti-MdHB1多克隆抗體能夠從植物組織中特異性的檢測(cè)到目的蛋白，且效果良好。

圖10 蘋果幼葉蛋白的Western Blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig. 10 Western Blot analysis of proteins in young apple levels

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)利用實(shí)驗(yàn)室前期克隆的MdHB1序列，首先利用一系列生物信息學(xué)軟件對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)，結(jié)果表明，蘋果轉(zhuǎn)錄因子MdHB1含有其特有的HD結(jié)構(gòu)和Zip結(jié)構(gòu)，是HD-ZipI亞家族的成員；兩種二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法得到的各結(jié)構(gòu)所占比例基本一致，并且發(fā)現(xiàn)目的蛋白的柔韌性區(qū)域所占比例很高。蛋白的柔韌區(qū)域?qū)τ谄涔δ苡兄苤匾淖饔茫绱呋?、結(jié)合、變構(gòu)效應(yīng)等[17]。當(dāng)前研究表明，該家族成員多通過參與植物激素的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，響應(yīng)外界各種環(huán)境因素的刺激，影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)程，例如水稻中，HD-ZipI亞家族成員Oshox22影響了ABA的合成，并通過ABA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與水分和鹽脅迫[7-9,18-22]；其較多的柔韌區(qū)域可能與這些響應(yīng)有關(guān)，是各種生理響應(yīng)的分子基礎(chǔ)，正如一些研究者所認(rèn)為，HD-ZipI是植物高級(jí)蛋白結(jié)構(gòu)的一部分[7]。此外，預(yù)測(cè)并沒有發(fā)現(xiàn)目的蛋白有跨膜區(qū)域；作為植物轉(zhuǎn)錄因子，大部分研究認(rèn)為其HD-Zip家族的亞細(xì)胞定位在細(xì)胞核[6,23-24]，然而筆者最近研究發(fā)現(xiàn)，MdHB1的亞細(xì)胞定位不僅在細(xì)胞核，也存在于細(xì)胞膜，這可能和其自身的蛋白功能有關(guān)。

要制備高質(zhì)量的抗體，理想的免疫原是前提。通過大腸桿菌原核表達(dá)目的蛋白，不僅操作簡(jiǎn)單，并且有成本低、周期短的優(yōu)點(diǎn)。本研究構(gòu)建了兩種原核表達(dá)載體：6pHB和28aHB；前者帶有分子質(zhì)量較大的GST-tag，后者為較小的His6-tag。通過一系列的SDS-PAGE分析，探索了溫度、誘導(dǎo)時(shí)間、誘導(dǎo)物質(zhì)量濃度對(duì)融合蛋白MdHB1-GST誘導(dǎo)表達(dá)的影響。在進(jìn)行兔的免疫制備抗體時(shí)，選用pET-28a（＋）載體，His6-tag分子質(zhì)量小，免疫影響弱，不影響蛋白的自身活性，并且后期的純化和鑒定也較為方便[25]。通過SDS-PAGE分析原核表達(dá)菌體總蛋白的上清液和沉淀，發(fā)現(xiàn)在37 ℃下，兩種形式的融合蛋白大部分以包涵體的形式存在；即使在較低溫度下誘導(dǎo)表達(dá)，MdHB1-GST可溶性融合蛋白的量有所上升，但仍然不及沉淀中包涵體的量大。一些蛋白在較低的溫度下原核表達(dá)的可溶性大大增加，遠(yuǎn)超以包涵體形式存在的融合蛋白[26]，而MdHB1卻達(dá)不到這樣的效果，可能與其蛋白本身的結(jié)構(gòu)有關(guān)。

Western Blot實(shí)驗(yàn)是驗(yàn)證特異抗體與相應(yīng)蛋白互作的一種常用方法，具有反應(yīng)靈敏、所需試材少等優(yōu)點(diǎn)。通過該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，自制的Anti-MdHB1多克隆抗體與菌體總蛋白雜交后，背景較低，條帶清晰；也能夠成功地從植物組織中成功檢測(cè)到目的蛋白，且背景較低。間接ELISA表明，在抗體稀釋8 000 倍的情況下，抗體OD460nm仍然較高，即所制多克隆抗體的效價(jià)較高。綜上，自制得到的Anti-MdHB1多克隆抗體特異性良好，能夠用于后續(xù)蛋白相關(guān)的研究。

在蘋果葉片蛋白的Western Blot實(shí)驗(yàn)中，所得條帶在70～100 kDa之間，這與預(yù)測(cè)的MdHB1的分子質(zhì)量大小（38.4 kDa）相差較大，基本接近其二倍的分子質(zhì)量大小。在以前的研究中，從植物體得到的成熟蛋白與預(yù)測(cè)蛋白分子質(zhì)量存在差異的情況并不少[26-28]，并且從理論上講也是極有可能的。一種可能是植物中蛋白質(zhì)的修飾作用，植物體存在的蛋白不同與原核表達(dá)系統(tǒng)較為簡(jiǎn)單的環(huán)境，成熟的蛋白經(jīng)過一系列修飾才能起作用，例如糖基化[27]；另一種是蛋白以二聚體或者多聚體的形式存在于植物組織中，多個(gè)研究表明，HD-Zip通過Zip結(jié)構(gòu)域形成二聚體，然后HD結(jié)構(gòu)域與特定DNA序列結(jié)合發(fā)揮轉(zhuǎn)錄因子的作用[29-31]，而在原核表達(dá)系統(tǒng)無法表現(xiàn)出來；故MdHB1在植物中所存在的功能形式還需要進(jìn)一步的研究確定。

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