響應(yīng)面試驗優(yōu)化產(chǎn)琥珀酸放線桿菌GXAS137發(fā)酵粗甘油產(chǎn)丁二酸工藝

張紅巖，朱 婧，馮 英,3，李 億，秦 艷，王青艷，梁 戈，申乃坤,4,*

丁二酸（又名琥珀酸），是一種重要的四碳平臺化合物，可以取代苯合成包括四氫呋喃、N-甲基吡咯烷酮、γ-丁內(nèi)酯、1,4-丁二醇、己二酸等在內(nèi)的250 種以上專用化學(xué)品或大宗化學(xué)品，可廣泛應(yīng)用于食品、塑料、醫(yī)藥、香料等工業(yè)[1]。此外，丁二酸還是合成可降解塑料的主要原料，它可以與丁二醇、乙二醇、丙二醇等縮合聚合生產(chǎn)聚丁二酸丁二醇酯、聚乙二醇丁二酸酯、聚丙二醇丁二酸酯等具有優(yōu)良特性且可完全被生物降解的高分子材料，是丁二酸潛在的最具發(fā)展前景的領(lǐng)域[2]。美國能源部2004年公布的12 種最有潛力大宗產(chǎn)品中，丁二酸排在第一位[3]。目前商品化的丁二酸的主要是以順丁烯二酸、順丁烯二酸酐等石油基材料為原料通過催化加氫或電化學(xué)合成，其過程中伴隨大量溫室氣體及有毒廢棄物的排放，對環(huán)境污染嚴(yán)重。隨著石油資源供應(yīng)日益緊張以及環(huán)境意識的日益增強，化學(xué)法合成逐漸受到限制，不利于丁二酸相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。而微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸具有以可再生的生物質(zhì)資源為原料、發(fā)酵條件溫和、可固定CO2等一系列優(yōu)點，成為近年來國內(nèi)外的研究熱點之一[4-5]。在眾多產(chǎn)丁二酸的微生物中，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌（Actinobacillus succinogenes）以其產(chǎn)量高（最高可達110 g/L）、耐受性強（最高可耐160 g/L葡萄糖）等優(yōu)點，是目前最具發(fā)展前景的生產(chǎn)菌種之一[6]。但目前微生物發(fā)酵法生產(chǎn)丁二酸的生產(chǎn)成本偏高，影響了其產(chǎn)業(yè)化的進程。采用廉價或廢棄的非糧生物質(zhì)資源替代葡萄糖進行丁二酸生產(chǎn)，不僅是對廢棄的生物質(zhì)資源再利用，而且可以有效降低丁二酸生產(chǎn)原料成本，對促進丁二酸生物發(fā)酵法生產(chǎn)具有重要的意義[7]。國內(nèi)外學(xué)者對乳清[8]、甘蔗汁[9]、糖蜜[10]、面包加工廢料[11]及農(nóng)業(yè)廢棄物[12-13]等原料發(fā)酵生產(chǎn)丁二酸進行了研究，取得了較好的效果，丁二酸生產(chǎn)成本明顯下降。但與化學(xué)合成法相比，生產(chǎn)成本仍然偏高，需要進一步探索更為低廉的原料進行丁二酸生產(chǎn)。

甘油是作為酒精發(fā)酵和油脂皂化反應(yīng)中的副產(chǎn)物被發(fā)現(xiàn)的，在生物柴油的制備過程中，每生產(chǎn)9 t生物柴油就會副產(chǎn)約1 t粗甘油[14]。伴隨生物柴油規(guī)模的不斷增大，粗甘油產(chǎn)量也會相應(yīng)提高。粗甘油在制備過程中帶入了鹽類、甲醇、皂等雜質(zhì)，只有經(jīng)過進一步的純化和精制后才能在醫(yī)藥、化妝品和食品等領(lǐng)域使用，但粗甘油純化精制成本較高，在經(jīng)濟上不可行，導(dǎo)致目前粗甘油價格急劇下跌，幾乎成了工業(yè)的廢棄物，若不及時處理，有可能會成為一種新的污染源[15]，進而增加了生物柴油生產(chǎn)企業(yè)的處理成本，降低了經(jīng)濟效益。利用生物技術(shù)將粗甘油作為底物轉(zhuǎn)化為高價格的產(chǎn)品引起了越來越多研究者的關(guān)注[16]。當(dāng)前甘油利用的有效途徑包括：發(fā)酵生產(chǎn)1,3-丙二醇、乙醇、3-羥基丙酸等；制備環(huán)氧氯丙烷、乙二醇二羥基丙酮等[17]。但利用微生物將甘油轉(zhuǎn)化為丁二酸的研究較少，尚處于起步階段[18-19]。與葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)丁二酸相比，粗甘油不僅價格低廉，而且還原性更強，發(fā)酵過程中產(chǎn)生的還原力是葡萄糖的兩倍[20]。但目前甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的產(chǎn)量較低，批次發(fā)酵最高只有29.3 g/L[18]，遠低于葡萄糖發(fā)酵水平（110 g/L[6]），需要對發(fā)酵工藝進一步優(yōu)化。而國內(nèi)有關(guān)粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的研究目前還鮮見報道。

本研究對實驗室前期篩選到的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌GXAS137發(fā)酵粗甘油產(chǎn)丁二酸的培養(yǎng)基進行了優(yōu)化，先利用單因素試驗對影響發(fā)酵的主要因素進行優(yōu)化，再利用響應(yīng)面試驗對篩選出的關(guān)鍵因素的濃度進行進一步優(yōu)化，提高丁二酸產(chǎn)量，降低生產(chǎn)成本。與葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)丁二酸相比，粗甘油不僅能夠降低生產(chǎn)成本，而且還實現(xiàn)了廢物資源的有效利用，提高其經(jīng)濟附加值，在資源的有效利用及環(huán)境保護方面均具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

粗甘油購自南京長江江宇油脂有限公司，其甘油質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為85%，其他雜質(zhì)（水、部分聚甘油等）質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為15%。

1.1.2 菌種與培養(yǎng)基

產(chǎn)琥珀酸放線桿菌GXAS137[9]為本實驗室選育獲得，保藏號為：CCTCCM 2011399。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物10 g/L，玉米漿5 g/L，NaCl 2 g/L，NaH2PO4·2H2O 8.5 g/L，K2HPO415.5 g/L，NaHCO32 g/L，半胱氨酸鹽酸鹽1 g/L，pH值自然，115 ℃滅菌20 min。

原始甘油發(fā)酵培養(yǎng)基：粗甘油30 g/L，酵母提取物10 g/L，NaCl 5 g/L，(NH4)2SO41 g/L，MgCl2·6H2O 0.5 g/L，CaCl20.5 g/L，MgCO330 g/L，115 ℃條件下滅菌20 min。

1.1.3 試劑

酵母提取物、蛋白胨 英國Oxoid公司；葡萄糖、碳酸氫鈉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀 生物工程（上海）股份有限公司；其他均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DG250小型厭氧工作站 英國Don Whitley Scientific公司；U-3000高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）儀 美國戴安公司；色譜柱Rezex ROA-Organic Acid H＋（8%）（300 mm×7.8 mm） 美國菲羅門公司。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)與發(fā)酵條件

種子培養(yǎng)：將甘油保藏的菌種接種到液體種子培養(yǎng)基進行活化，37 ℃培養(yǎng)15 h后，按照5%接種量（體積分?jǐn)?shù)，下同）接種于裝有95 mL種子三角搖瓶（容積為250 mL）中，37 ℃培養(yǎng)8 h，可得到成熟種子。

發(fā)酵過程：按8%接種量接種于裝有92 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的三角搖瓶中進行發(fā)酵，置37 ℃發(fā)酵72 h進行產(chǎn)物分析。

1.3.2 樣品分析測定[9]

1.3.2.1 樣品預(yù)處理

樣品在轉(zhuǎn)速為12 000 r/min條件下離心10 min，取上清液進行適當(dāng)稀釋，然后用0.22 μm孔徑的無菌濾膜過濾后，HPLC檢測發(fā)酵液丁二酸、乙酸、甲酸及殘甘油質(zhì)量濃度。

1.3.2.2 有機酸含量測定

采用HPLC法，自動進樣器，流動相為2.5 mmol/L H2SO4溶液（pH 2.5），流速0.6 mL/min，柱溫45 ℃，自動進樣器進樣，進樣量10 μL，紫外檢測器的波長為210 nm。

1.3.2.3 甘油含量測定

采用HPLC法，紫外檢測器與示差檢測器聯(lián)用，示差檢測器的溫度為50 ℃。

1.3.3 粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸條件優(yōu)化

1.3.3.1 單因素試驗

在前期實驗的基礎(chǔ)上[9-10]，對粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸條件進行了預(yù)實驗，發(fā)現(xiàn)碳源、氮源及電子受體對丁二酸產(chǎn)量影響較大，需要進一步進行優(yōu)化。在粗甘油質(zhì)量濃度為30 g/L時，考察不同電子受體對甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響；在確定電子受體情況下，考察粗甘油質(zhì)量濃度對丁二酸發(fā)酵的影響；在確定電子受體及粗甘油質(zhì)量濃度時，考察不同種類的氮源對丁二酸產(chǎn)量的影響，以期篩選出合適廉價氮源，以替代價格昂貴的酵母提取物。

1.3.3.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，借助響應(yīng)面試驗設(shè)計Design-Expert 8.0軟件的Box-Behnken設(shè)計原理，以丁二酸產(chǎn)量考察指標(biāo)，對粗甘油、電子受體二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）及玉米漿質(zhì)量濃度這3 個顯著性影響因素各取低（－1）、原點（0）、高（1）三水平進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗，各個因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used in central composite design

1.4 數(shù)據(jù)處理

實驗數(shù)據(jù)取3 次平均值；圖表采用Origin 8.0及Excel 2007進行處理繪制，響應(yīng)面試驗設(shè)計與分析采用Design-Expert 8.0軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同電子受體對甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響

微生物代謝甘油過程中為了維持氧化還原電位平衡，一部分被還原成1,3-丙二醇排除細胞外，另一部分被氧化成磷酸二羥丙酮進入糖酵解途徑。但產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的代謝通路中缺少1,3-丙二醇代謝途徑，所以代謝過程中電子受體供應(yīng)不足，在以甘油為碳源培養(yǎng)基中生長較差，只有在外源添加電子受體的情況下才能實現(xiàn)FAD＋的再生[18]。所以本研究在初始發(fā)酵培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，分別添加10 g/L亞甲基藍、DMSO、乙偶姻、二羥基丙酮、亞硝酸鈉為電子受體進行丁二酸生產(chǎn)。37 ℃條件下發(fā)酵72 h，HPLC分析測定樣品，每組設(shè)3 個平行，結(jié)果取平均值（下同）。

圖1 不同電子受體對粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響Fig. 1 Effect of different electron acceptors on the production of succinic acid

從圖1可知，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌GXAS137可以利用粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸，丁二酸為主要產(chǎn)物，主要副產(chǎn)物為乙酸和甲酸。但不添加任何電子受體時，丁二酸產(chǎn)量較低，只有4.76 g/L，而且菌體生長較差，這與文獻報道的產(chǎn)琥珀酸放線桿菌CGMCC 1593[20]及NJ 113[21]不能利用甘油不同，這可能是不同菌株的代謝差異造成的。當(dāng)添加DMSO為電子受體時，丁二酸產(chǎn)量最高，可達16.88 g/L；而添加其他電子受體丁二酸產(chǎn)量高于對照組，但低于DMSO組。因此，DMSO為粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸合的最適電子受體。這可能是由于外源添加DMSO有利于維持細胞的氧化還原平衡（FAD＋/FADH2），實現(xiàn)細胞體內(nèi)輔酶的再生，從而增加了丁二酸產(chǎn)量[19]。

2.2 粗甘油質(zhì)量濃度對丁二酸產(chǎn)量的影響

碳源含量對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌生長和丁二酸合成影響極大，碳源含量較低時，不利于丁二酸高濃度生產(chǎn)[22]；但碳源含量過高時會抑制菌體生長及丁二酸合成。Urbance等[23]研究表明，當(dāng)葡萄糖為碳源時，70 g/L或者更高質(zhì)量濃度的葡萄糖會抑制產(chǎn)琥珀酸放線桿菌生長，這一結(jié)論得到大多數(shù)學(xué)者驗證[24-25]。為了研究粗甘油質(zhì)量濃度對丁二酸產(chǎn)量的影響，在初始發(fā)酵培養(yǎng)基（不含碳源）的基礎(chǔ)上，分別添加粗甘油質(zhì)量濃度為30、40、50、60、70 g/L，并添加10 g/L的DMSO作為電子受體，考察粗甘油質(zhì)量濃度對丁二酸產(chǎn)量的影響，結(jié)果見圖2。

圖2 粗甘油質(zhì)量濃度對粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響Fig. 2 Effect of crude glycerol concentration on the production of succinic acid

從圖2可以看出，當(dāng)粗甘油質(zhì)量濃度低于50 g/L時，丁二酸隨著粗甘油質(zhì)量濃度的增加而升高；而當(dāng)質(zhì)量濃度超過50 g/L時，丁二酸產(chǎn)量會隨粗甘油質(zhì)量濃度增加而降低；當(dāng)粗甘油質(zhì)量濃度為70 g/L，丁二酸的合成受到嚴(yán)重抑制，產(chǎn)量只有16.21 g/L。因此，粗甘油最適質(zhì)量濃度為50 g/L，此時丁二酸產(chǎn)量最高，達到32.06 g/L。粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的最適質(zhì)量濃度遠低于葡萄糖（70～75 g/L）[10,12]，這可能與粗甘油的滲透壓較高且含有甲醇、鹽類等有害成分有關(guān)。

2.3 氮源種類及質(zhì)量濃度對丁二酸產(chǎn)量的影響

氮源是構(gòu)成微生物菌體和一些代謝產(chǎn)物的必需營養(yǎng)元素，產(chǎn)琥珀酸放線桿菌本身不能合成生物素、煙酸、甲硫氨酸等生長因素[26]，需要添加合適的氮源來提供生長所需的氨基酸和維生素等生長因素，因此，對氮源的要求較高。前人研究表明酵母提取物為氮源時，丁二酸產(chǎn)量遠高于其他氮源[12,25]。但酵母提取物的價格較高，會顯著增加生產(chǎn)成本，嚴(yán)重阻礙丁二酸大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，需要積極探索其他價格低廉的替代氮源。因此，以50 g/L的粗甘油為碳源，分別添加酵母粉（總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.5%）8 g/L、蛋白胨（總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)12.7%）7.87 g/L、牛肉膏（總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)13.1%）7.63 g/L、玉米漿（總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)7.4%）13.51 g/L、硫酸銨（總氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)21%）4.76 g/L作為氮源，設(shè)定添加總氮終質(zhì)量濃度為1.0 g/L，對照組不加入任何氮源，考察不同種類的氮源對粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響。發(fā)酵72 h后，分析測定樣品，結(jié)果見圖3。

圖3 不同氮源對粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響Fig. 3 Effect of different nitrogen sources on the production of succinic acid

從圖3可以看出，酵母提取物為粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的最適氮源，此時，丁二酸產(chǎn)量為32.13 g/L，其次為玉米漿，丁二酸產(chǎn)量達到30.24 g/L；蛋白胨及牛肉膏為氮源時，丁二酸產(chǎn)量分別為22.35 g/L和24.61 g/L；而空白對照及硫酸銨為氮源時幾乎無丁二酸產(chǎn)生。

圖4 玉米漿質(zhì)量濃度對粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的影響Fig. 4 Effect of corn steep liquor concentration on the production of succinic acid

通過進一步對玉米漿質(zhì)量濃度進一步優(yōu)化（圖4），當(dāng)玉米漿質(zhì)量濃度為16 g/L時，丁二酸產(chǎn)量達到32.06 g/L，幾乎與酵母提取物為氮源時的丁二酸產(chǎn)量相當(dāng)，這可能與玉米漿中含有豐富的可溶性蛋白、生長素和一些前體物質(zhì)，能滿足產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的生長、發(fā)酵[10]。而玉米漿價格（國產(chǎn)約2 500 元/t）遠低于酵母提取物（國產(chǎn)約5 000 元/t），可顯著降低丁二酸生產(chǎn)成本。因此，選擇玉米漿作為粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的氮源。

2.4 響應(yīng)面試驗結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

根據(jù)單因素試驗確定的3 個因素，利用Box-Behnken試驗設(shè)計三因素三水平共15 個試驗點進行響應(yīng)面分析。析因點共12 個，用于考察3 個變量在3 個不同水平下對丁二酸產(chǎn)量的影響；零點為區(qū)域的中心點，重復(fù)3 次（試驗號1、4、15），用于估計試驗的誤差。結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Box-Behnken design with response variable

2.4.2 模型方程的建立與顯著性檢驗

根據(jù)表2的試驗結(jié)果，利用Design-Expert 8.0對丁二酸產(chǎn)量Y值與各因素進行多元回歸分析，同時擬合得二次回歸方程：

方程的決定系數(shù)R2為0.994 0，說明該回歸方程的擬合度很好，可以通過該回歸方程對實際試驗結(jié)果進行分析。進一步對響應(yīng)面試驗方差進行分析，結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken試驗方差分析結(jié)果Table 3 Analysis of variance of response surface regression model

由表3可知，模型P＜0.0001，達到極顯著水平，說明該試驗?zāi)Ｐ惋@著；決定系數(shù)R2等于0.994 0，說明建立的該模型能解釋99%響應(yīng)值的變化；復(fù)合相關(guān)系數(shù)R為0.983 2，說明該模型擬合程度良好，失擬項不顯著（P＞0.05）。以上分析表明模型擬合度較好，試驗誤差較小，模型的預(yù)測值能與實際試驗值間具有高度相關(guān)度[14]。

由表3回歸模型系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果可知：因素一次項X1、X3對丁二酸的產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01），X2影響顯著（P＜0.05）；交互項X1X3影響顯著（P＜0.05），X1X2、X2X3影響不顯著（P＞0.05)；二次項X12、X22、X32對丁二酸產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01）；這表明試驗各因素與響應(yīng)值之間不是簡單的線性關(guān)系[27]。各因素對丁二酸產(chǎn)量的影響程度為：X1＞X3＞X2，即粗甘油質(zhì)量濃度＞玉米漿質(zhì)量濃度＞DMSO質(zhì)量濃度。

2.4.3 響應(yīng)面分析

響應(yīng)面是各因素對響應(yīng)值影響對所構(gòu)成的三維空間曲面圖，它可以直觀反映出各個因素與響應(yīng)值的交互作用，提供一種形象的觀測響應(yīng)值和試驗參數(shù)水平關(guān)系的方法[28]。曲面越陡峭，說明因素對響應(yīng)值影響越大。響應(yīng)面中各因素的等高線形狀可以反映因素間交互作用的顯著程度。如等高線的性狀為橢圓形，表明兩因素交互作用顯著；但如果等高線性狀為圓形，則表明兩因素的交互作用不顯著[29]。通過對上述多元回歸方程作響應(yīng)面及等高線圖，結(jié)果見圖5。

圖5 各因素交互作用對丁二酸產(chǎn)量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig. 5 Response surface and contour pots showing the interactive effects of variables on succinic acid yield

由圖5可知，各因素對響應(yīng)面的陡峭程度的影響為：粗甘油質(zhì)量濃度＞玉米漿質(zhì)量濃度＞DMSO質(zhì)量濃度，這說明粗甘油對丁二酸產(chǎn)量影響最大，其次為玉米漿，DMSO影響最小，這與方差分析結(jié)果一致。從等高線圖可知，因素粗甘油與DMSO質(zhì)量濃度及DMSO與玉米漿質(zhì)量濃度間的等高線為圓形，因素的交互影響不顯著；而粗甘油與玉米漿質(zhì)量濃度的等高線為橢圓形，沿粗甘油方向峰值移動的等高線密度明顯大于玉米漿方向，這說明粗甘油與玉米漿見有交互影響，且粗甘油對丁二酸產(chǎn)量影響較大。

2.4.4 模型最高點預(yù)測及驗證實驗結(jié)果

對獲得的模型中影響不顯著的因素X1X2、X2X3去除，運用軟件Design-Expert 8.0重新構(gòu)建模型，并對方程的最大值進行求解，得到響應(yīng)面的最高點。最佳點時X1、X2、X3的值分別為0.543、0.176、0.689，對應(yīng)各因素的實際值分別為粗甘油55.43 g/L、DMSO 10.35 g/L、玉米漿17.69 g/L，此點丁二酸產(chǎn)量為37.11 g/L。

為了檢驗?zāi)Ｐ皖A(yù)測的準(zhǔn)確性，在最優(yōu)條件下設(shè)置3 個平行實驗進行驗證，37 ℃發(fā)酵72 h，HPLC分析測定結(jié)果。獲得丁二酸產(chǎn)量的平均值為（37.02±0.41）g/L，與預(yù)測值基本一致（P＞0.05），這說明建立的模型具有很好的可靠性和重復(fù)性。此時，丁二酸得率為66.79%，生產(chǎn)強度為0.51 g/（L·h），與優(yōu)化前丁二酸產(chǎn)量16.88 g/L相比，提高了1.19 倍。從而也證明了響應(yīng)面法優(yōu)化培養(yǎng)基配方的有效性，對于其他發(fā)酵條件優(yōu)化也具有一定的參考價值。

3 結(jié) 論

本研究對產(chǎn)琥珀酸放線桿菌GXAS137發(fā)酵粗甘油產(chǎn)丁二酸的條件進行優(yōu)化，提高了丁二酸產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本。先通過單因素試驗對粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的電子受體、粗甘油質(zhì)量濃度及氮源進行了優(yōu)化，又通過響應(yīng)面試驗確定重要參數(shù)的最佳水平。結(jié)果表明：DMSO是粗甘油發(fā)酵產(chǎn)丁二酸的最適電子受體，玉米漿可替換價格昂貴的酵母粉作為發(fā)酵的氮源，各因素的最佳條件為粗甘油55.43 g/L、DMSO 10.35 g/L、玉米漿17.69 g/L，此條件下丁二酸產(chǎn)量達到37.02 g/L，丁二酸得率為66.79%，生產(chǎn)強度為0.51 g/（L·h）。與優(yōu)化前的丁二酸產(chǎn)量16.88 g/L相比，丁二酸產(chǎn)量提高1.19 倍，說明模型準(zhǔn)確有效。研究結(jié)果表明產(chǎn)琥珀酸放線桿菌GXAS137可以高效率轉(zhuǎn)化粗甘油生產(chǎn)丁二酸，不僅可為丁二酸的生物煉制提供廉價的可再生原料，而且還可以廢棄甘油排放帶來的環(huán)境問題，實現(xiàn)廢物的資源化，在資源的有效利用及環(huán)境保護方面均具有重要意義。

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