L-賴氨酸對鰱肌球蛋白熱聚集行為的影響

石 彤，袁 麗，王艷敏，高瑞昌*

肌球蛋白是魚肌肉蛋白的主要成分，約占魚肌原纖維蛋白的55%～60%[1]。肌球蛋白分子是長型不對稱結(jié)構(gòu)，含有兩個球狀頭部和一個棒狀尾部，在體外高鹽（如0.6 mol/L KCl）溶液中，分子以單體或可溶性寡聚體形式存在[2-3]。溫度會影響肌球蛋白單體或低聚物的自組裝，加熱時，肌球蛋白單體和低聚物會發(fā)生變性、聚集，最終形成彈性凝膠[4-5]。

Guo等[6]研究表明L-賴氨酸（L-Lys）和L-組氨酸能夠促進肌球蛋白展開，導(dǎo)致α-螺旋含量下降，從而暴露更多的疏水基團和巰基基團，最終增加肌球蛋白的溶解度。Chen Xing等[7]研究表明5 mmol/L的L-組氨酸對高鹽下蛋白的凝膠強度和熱凝膠形成能力均無顯著影響。Takai等[8]研究表明精氨酸能夠增加肌球蛋白在生理鹽濃度下的溶解度而不改變其二級結(jié)構(gòu)。精氨酸能夠在不改變蛋白三級結(jié)構(gòu)的情況下抑制蛋白聚集[9]，但抑制聚集的機制尚不明確，而L-Lys多被用來研究其對蛋白溶解度及構(gòu)象的影響[6,8]。但是，關(guān)于氨基酸對肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠形成的影響鮮見報道。因此，本研究的目的是探究L-Lys對鰱肌球蛋白的熱聚集行為有何影響，并嘗試分析其具體的影響機制，從而通過控制L-Lys的添加量獲得不同凝膠強度的魚糜制品，以適應(yīng)更多人群的飲食需求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮花鰱為市購，置于冰塊上30 min內(nèi)帶至實驗室，選取背部魚肉，去皮、去刺，剁成肉糜備用。

牛血清白蛋、L-Lys、三（羥甲基）氨基甲烷（Tris） 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；腺苷-5’-三磷酸二鈉鹽水合物（adenosine triphosphate，ATP） 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

試劑A：0.1 mmol/L氯化鉀，20 mmol/L Tris，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 7.5；試劑B：0.45 mmol/L氯化鉀，0.2 mol/L乙酸鎂，1 mmol/L乙二醇雙（2-氨基乙基醚）四乙酸，20 mmol/L Tris，5 mmol/L β-巰基乙醇，用馬來酸調(diào)節(jié)pH 6.8；試劑C：0.5 mmol/L氯化鉀，20 mmol/L Tris，5 mmol/L β-巰基乙醇，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 7.5。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-26XP超高速冷凍離心機 德國貝克曼庫爾特有限公司；T18分散儀 德國IKA公司；UV1600紫外-可見分光光度計 北京瑞利分析儀器有限公司；TE-124S電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；HH-S2數(shù)顯恒溫水浴鍋 金壇市醫(yī)療儀器廠；TA-XT Plus食品物性儀 英國Stable Micro Systems公司；FE 20 pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；DISCOVERY HR-1流變儀 美國TA儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 肌球蛋白的提取

肌球蛋白的制備是根據(jù)Park等[10]的方法并進行一定調(diào)整。將新鮮鳙魚去頭、去內(nèi)臟、去皮，取其背部白肉、去骨、清洗，切成肉糜狀，加入10 倍體積的試劑A，用均質(zhì)機在11 000 r/min均質(zhì)3～5 min，4 ℃反應(yīng)15 min，離心（3 000×g、5 min、4 ℃），取沉淀物，加入5 倍體積的試劑B，向懸浮液中加入ATP，使之終濃度為10 mmol/L，混合均勻后，在4 ℃靜置90 min，然后進行離心（11 000×g、13 min、4 ℃），取上清液，加入5倍體積的1 mmol/L碳酸氫鉀溶液，4 ℃放置20 min，離心（11 000×g、13 min、4 ℃），取沉淀物，加入2.5 倍體積的試劑C，4 ℃反應(yīng)10 min，然后再加入5 倍體積的1 mmol/L碳酸氫鉀溶液，往混合物中加入氯化鎂，使混合液的終濃度為10 mmol/L，4 ℃條件下進行過夜反應(yīng)。第2天進行離心（11 000×g、25 min、4 ℃），得到肌球蛋白顆粒，加入到0.5 mol/L NaCl-20 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液中，離心（5 000×g、10 min、4 ℃），取上清液備用。

用雙縮脲法[11]檢測上清液蛋白含量，并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用Gel-Pro analyzer軟件采用光密度法，對肌球蛋白的純度進行定量分析。

1.3.2 肌球蛋白-L-Lys熱誘導(dǎo)凝膠的制備

參考葉蕾蕾等[12]的方法并加以調(diào)整：將肌球蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)至20 mg/mL，同時加入L-Lys，使L-Lys最終濃度分別為0、1、5、10 mmol/L和20 mmol/L。將上述制備的各樣品進行二段式加熱，即先在40 ℃加熱60 min，再在90 ℃加熱30 min，然后放入冰水中迅速冷卻，在4 ℃冰箱中放置12 h。

1.3.3 L-Lys對肌球蛋白溶液pH值的影響

將肌球蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)為1.0 mg/mL，同時加入L-Lys，使L-Lys的終濃度分別為0、1、5、10 mmol/L和20 mmol/L。參考Techaratanakrai等[13]的方法，用pH計測定各樣品的pH值，每個樣品設(shè)3 個平行。

1.3.4 L-Lys對肌球蛋白溶液濁度的影響

將肌球蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)為1.0 mg/mL，同時加入L-Lys，使L-Lys的終濃度分別為0、1、5、 10 mmol/L和20 mmol/L。將各樣品溶液分別進行未加熱（25 ℃穩(wěn)定30 min）、預(yù)加熱（40 ℃加熱60 min）和二段式加熱（40 ℃加熱60 min的基礎(chǔ)上90 ℃加熱30 min），形成不同加熱條件下的肌球蛋白-L-Lys混合溶液。參考文獻[11]方法，使用紫外-可見分光光度計，在340 nm波長處，測定樣品的吸光度即為蛋白樣品的濁度，每個樣品設(shè)3 個平行。

1.3.5 L-Lys對肌球蛋白流變特性的影響

參考Verbeken等[14]的方法并加以調(diào)整。將肌球蛋白溶液的質(zhì)量濃度調(diào)至15 mg/mL，同時加入L-Lys，使L-Lys的終濃度分別為0、1、5、10 mmol/L和20 mmol/L。選用流變儀的振蕩模式，夾具型號為40 mmol/L平行板，間距為1 000 μm，將樣品置于圓臺上，修邊后在周圍滴上標準黏度液，防止樣品蒸發(fā)。溫度掃描時，振蕩頻率設(shè)置為0.1 Hz，應(yīng)變?yōu)?%，以2 ℃/min的速率從25 ℃程序升溫至90 ℃，再以4 ℃/min的速率從90 ℃程序降溫至25 ℃，記錄整個程序升溫和程序降溫過程中的儲能模量（G’）、損耗模量（G”）和相位角（δ）。每個樣品設(shè)3 個平行。

1.3.6 L-Lys對肌球蛋白凝膠強度的影響

參考Zhou Yanzi等[15]的方法并稍加改動。采用TA-XT Plus食品物性儀，測定肌球蛋白-L-Lys混合凝膠的破斷力，以破斷力的大小表征凝膠的強度。參數(shù)設(shè)定：探頭選擇P/0.5，測前速率1.5 mm/s，測試速率1.0 mm/s，測后速率1.0 mm/s，穿刺距離4 mm，觸發(fā)力4 g。每個樣品設(shè)3 個平行。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的處理與分析采用Origin 8.0、SPSS Statistics 17.0和Microsoft Excel軟件進行。

2 結(jié)果與分析

2.1 L-Lys對肌球蛋白溶液pH值的影響

圖1 肌球蛋白溶液pH值隨L-Lys濃度的變化Fig. 1 Changes in pH of myosin solutions with increasing concentration of L-Lys

由圖1可知，L-Lys能夠提高肌球蛋白溶液的pH值（P＜0.05），且隨著L-Lys濃度的增加，溶液pH值也越來越大。氨基酸的堿性不是—NH2表現(xiàn)的結(jié)合質(zhì)子能力，而是—COO－表現(xiàn)的接受質(zhì)子的能力，堿性氨基酸含有第2個堿性官能團（氨基、胍基、咪唑基），可以接受更多的H＋而呈現(xiàn)較強堿性[16]。L-Lys為堿性氨基酸[17]，添加的L-Lys濃度越大，則可接受的H＋越多，溶液的堿性越強，pH值越大。

2.2 L-Lys對肌球蛋白溶液濁度的影響

表1 L-Lys濃度對肌球蛋白溶液濁度的影響Table 1 Effect of L-Lys concentration on the turbidity of myosin solutions

隨著加熱溫度的升高和時間的延長，樣品濁度顯著增加，這是因為溫度升高肌球蛋白會聚集，使光發(fā)生散射，所以濁度升高[18]。由表1可以看出，未加熱時，添加1、5 mmol/L和10 mmol/L的L-Lys對溶液的濁度無顯著影響，但添加20 mmol/L的L-Lys能夠使溶液的濁度顯著降低；經(jīng)預(yù)加熱后，溶液的濁度會隨L-Lys濃度變化（1～20 mmol/L）而發(fā)生不同程度的降低，但降低的幅度與L-Lys的濃度未呈線性關(guān)系，這可能與40 ℃條件下蛋白容易復(fù)性導(dǎo)致溶液體系不穩(wěn)定有關(guān)；二段式加熱后，1～20 mmol/L的L-Lys均能使肌球蛋白溶液的濁度顯著降低。結(jié)果顯示，在同一加熱方式下，L-Lys能夠使溶液的濁度降低，一方面，這可能是因為帶正電的L-Lys能夠與帶負電的肌球蛋白結(jié)合，從而降低了肌球蛋白之間在加熱條件下相互結(jié)合的機會，抑制了蛋白的聚集；另一方面，可能是因為L-Lys的添加增加了溶液的pH值（圖1），pH值的升高會增強肌球蛋白間的靜電斥力，從而抑制蛋白的聚集，導(dǎo)致溶液的濁度降低。此外，Guo等[6]研究表明L-Lys能使肌球蛋白纖絲聚集作用減弱，溶解度增加，這可能也是濁度下降的原因之一。

2.3 L-Lys對肌球蛋白流變特性的影響

圖2 L-Lys對肌球蛋白流變行為的影響Fig. 2 Dynamic rheological properties of myosin solutions with various concentrations of L-Lys

流變學(xué)參數(shù)包括G’、G”和δ，分別表征凝膠體的彈性特征、黏性特征以及凝膠體是類似固體特征行為還是液體特征行為，tanδ的大小用黏性值與彈性值的比值來表示[19]。高的G’值代表蛋白質(zhì)具有更好的凝膠化能力[20]，由圖2a、b可以看出，在程序升溫和程序降溫的過程中，添加L-Lys組的G’值均低于空白組，說明L-Lys降低了肌球蛋白的凝膠化能力，原因可能是L-Lys在加熱的過程中增加了蛋白的流動性，抑制了熱聚集[21]。此外，由圖2c可知，在程序升溫的過程中，添加L-Lys組的tanδ值先低于對照組后高于對照組，說明在加熱結(jié)束后，添加L-Lys的樣品更偏向于黏性流體。

表2 L-Lys對肌球蛋白溶液G’關(guān)鍵變化點的影響Table 2 Key points of G’ of myosin solutions containing different concentrations of L-Lys

肌肉蛋白質(zhì)的凝膠過程是一個多步驟的熱力動力學(xué)過程，包括變性、凝集和三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的形成[22]。表2列出了L-Lys對肌球蛋白溶液G’關(guān)鍵變化點的影響結(jié)果，其中，G’的第1個峰值和第2個峰值對應(yīng)的溫度分別是蛋白變性和凝集的溫度[23]，對于空白組而言，在經(jīng)歷第3個轉(zhuǎn)折點后G’處于持續(xù)增加的狀態(tài)（圖2a），表征的是肌球蛋白三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)在該轉(zhuǎn)折點處開始形成。加入L-Lys后，G’的第1個峰值和第2個峰值對應(yīng)的溫度均有所提前，表征蛋白變性和凝集的過程提前，說明L-Lys的添加使體系變得更不穩(wěn)定，這與付淵等[24]研究發(fā)現(xiàn)的L-精氨酸可使肌球蛋白熱穩(wěn)定性下降的結(jié)論一致。另外，添加L-Lys后G’的峰值降低，且沒有出現(xiàn)第3個轉(zhuǎn)折點，說明L-精氨酸能夠降低肌球蛋白的凝膠形成能力，且形成的凝膠網(wǎng)絡(luò)強度較弱。此外，由圖1可知，添加L-Lys后，溶液的pH值增加，Liu Ru等[25]曾報道：在一定范圍內(nèi)，G′值隨pH值的增加而降低，所以L-Lys導(dǎo)致pH值的增加可能也是G’值降低的一個原因。

2.4 L-Lys對肌球蛋白凝膠強度的影響

為了直觀地觀察L-Lys對肌球蛋白凝膠強度的影響，本研究對制備好的肌球蛋白-L-Lys混合凝膠進行質(zhì)構(gòu)性能的檢測，用破斷力表征其凝膠強度。由圖3可知，相對于空白組，添加了L-Lys的高濃度肌球蛋白熱誘導(dǎo)凝膠強度顯著降低（P＜0.05），這與前面提到的L-Lys對肌球蛋白流變特性的影響所得出的結(jié)論一致。Ma Fei等[26]研究表明，在超高壓的條件下向鹽溶蛋白體系添加卡拉膠和CaCl2后，其凝膠強度顯著降低（P＜0.05），劉海梅等[27]發(fā)現(xiàn)較高濃度的CaCl2會使肌球蛋白重鏈交聯(lián)受阻，凝膠強度降低，李睿智等[28]的實驗表明鰱魚魚糜在凝膠過程中水分和凝膠特性會發(fā)生顯著變化，許艷順等[29]發(fā)現(xiàn)葡萄糖酸內(nèi)酯能夠誘導(dǎo)鰱魚糜形成凝膠，且食鹽添加量對內(nèi)酯魚糜凝膠的持水性和質(zhì)構(gòu)特性具有顯著影響，劉茹等[30]認為魚肉/豬肉復(fù)合肉糜凝膠的破斷強度、凝膠強度和保水性均隨著谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶添加量的增加而增大。付淵等[24]推測精氨酸的添加能夠顯著改變肌球蛋白體系的pH值，導(dǎo)致凝膠強度降低，但Qin Hao等[21]發(fā)現(xiàn)添加精氨酸能夠增加雞胸肌肉鹽溶蛋白的凝膠強度，這與本研究結(jié)果相反，可能與蛋白來源及氨基酸種類有關(guān)。L-Lys在凝膠形成過程中能夠通過增加肌球蛋白的靜電荷增強蛋白分子間的相互排斥作用，從而阻止肌球蛋白的相互聚集，最終導(dǎo)致凝膠強度下降。

圖3 L-Lys對肌球蛋白凝膠強度的影響Fig. 3 Effects of L-Lys concentration on the gel strength of myosin gels

3 結(jié) 論

L-Lys隨著其添加量的不同，可對鰱肌球蛋白的熱聚集行為產(chǎn)生不同的影響。隨著L-Lys濃度從1 mmol/L增加到20 mmol/L，肌球蛋白體系的pH值越來越高；在加熱的條件下，L-Lys能夠顯著降低肌球蛋白溶液的濁度；L-Lys能夠降低肌球蛋白的成膠能力和凝膠強度。

在肌球蛋白-L-Lys混合溶液中，帶正電的L-Lys能夠與帶負電的肌球蛋白結(jié)合，從而減少了加熱過程中肌球蛋白相互結(jié)合，抑制了肌球蛋白的熱聚集；此外，L-Lys的添加顯著提高了肌球蛋白體系的pH值，pH值的增大會使肌球蛋白間的靜電斥力增強，從而抑制肌球蛋白在加熱條件下的聚集。

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