麥苗酵素發(fā)酵工藝的優(yōu)化及其抗氧化功能

馮彥君，　張　慜*，　韓宇斌

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.海通食品集團(tuán)有限公司，浙江 慈溪 315300）

大麥苗是禾本科越年生草本植物大麥的幼苗，其營養(yǎng)豐富，所含維生素、礦物質(zhì)及蛋白質(zhì)是人類與動物的必需營養(yǎng)，還含有葉綠素、黃酮類物質(zhì)、活性酶、維生素等生物活性物質(zhì)[1]。大麥苗有著悠久的食用藥用歷史，我國明代醫(yī)藥學(xué)家李時珍就在《本草綱目》中寫到：“麥苗，氣味辛、寒、無毒。主治消酒毒、暴熱，酒疽、目黃，并搗爛絞碎濾服之，又解蠱毒；煮汁濾服，除煩悶。除時疾狂熱，退胸隔熱，利小腸。作苗，甚益顏色[2]”。近年來，大麥苗制作的保健食品以其獨特營養(yǎng)價值及保健作用，在日本、美國等發(fā)達(dá)國家也倍受關(guān)注。而在我國，現(xiàn)在大麥苗保健食品及其相關(guān)研究還很少。

“酵素”本是酶（enzyme）的舊譯，后來也被用來稱呼一些發(fā)酵產(chǎn)品，如植物酵素、環(huán)保酵素、酵素菌肥等；而植物酵素指以新鮮蔬菜、水果等植物為原料，經(jīng)多種益生菌發(fā)酵而產(chǎn)生的，含有豐富的酶、維生素、礦物質(zhì)和次生代謝產(chǎn)物的微生物制劑[3-4]。按照生產(chǎn)過程中是否人為接種菌種，酵素可以分為天然酵素和人工酵素2類。天然酵素生產(chǎn)工藝簡單，但生產(chǎn)周期較長；人工酵素生產(chǎn)工藝復(fù)雜，但生產(chǎn)周期短，且產(chǎn)品質(zhì)量較穩(wěn)定。本文中的麥苗酵素屬于人工酵素。研究表明植物酵素具有消炎、抗菌、抗氧化、凈化血液、促進(jìn)細(xì)胞新生、增強(qiáng)免疫力等作用[4]，有些還表現(xiàn)出了一定的抗腫瘤作用[5-6]。因其較好的保健功能，植物酵素在日本以及我國臺灣地區(qū)大受歡迎。盡管國內(nèi)市場上也出現(xiàn)了一些植物酵素產(chǎn)品，但數(shù)量仍然很少，還有廣闊的發(fā)展空間。

本文作者以大麥幼苗為原料，通過勻漿、滅菌、發(fā)酵等步驟，制成麥苗酵素產(chǎn)品。酵母菌通過本身的代謝過程，使底物產(chǎn)生一系列的生物化學(xué)變化，實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)之間的相互轉(zhuǎn)化，為產(chǎn)生新的生理物質(zhì)如各種酶、維生素及次級代謝產(chǎn)物等提供前體物。因此發(fā)酵后的產(chǎn)品，其營養(yǎng)價值遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了麥苗本身。對于麥苗酵素，超氧化物歧化酶（SOD）是其主要的功效酶之一。SOD是一類重要的抗氧化的酶，廣泛存在與人類和各種生物中，具有很強(qiáng)的抗氧化的作用，清除體內(nèi)的超氧離子自由基，保護(hù)機(jī)體免受自由基的傷害，所以在抗癌、抗衰老、抗炎癥、抗輻射等疾病中具有不可忽視的作用[7]。盡管外源性酶的攝入與人體內(nèi)源酶含量的關(guān)系比較復(fù)雜，但已有一些研究證明，雖然其機(jī)理尚不清楚，口服外源性SOD酶確實可使人體內(nèi)SOD酶活性升高[8-9]，且有利于治療一些疾病[10]。

本文中以SOD酶活力為指標(biāo)，對麥苗酵素的發(fā)酵工藝進(jìn)行了優(yōu)化，以期為麥苗酵素發(fā)酵的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)；同時研究了其抗氧化能力，測定了包括過氧化氫酶（CAT）活力、總酚質(zhì)量濃度以及羥基自由基清除率在內(nèi)的抗氧化指標(biāo)，為進(jìn)一步探明麥苗酵素中的活性物質(zhì)提供一定的數(shù)據(jù)資料，為大麥苗的多功能開發(fā)提供一個新的思路。

1　材料與方法

1.1　材料與儀器

大麥苗，海通食品集團(tuán)產(chǎn)品；活性干酵母，安琪酵母股份公司產(chǎn)品；硫酸鎂、氯化鋅、甲硫氨酸、十二水合磷酸氫二鈉、一水合磷酸二氫鈉、體積分?jǐn)?shù)30%過氧化氫、無水碳酸鈉、水楊酸鈉、硫酸亞鐵、沒食子酸（均為分析純），核黃素、福林酚、氯化硝基四氮唑藍(lán)、酵母膏（均為生化試劑），國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；JYL-C020九陽榨汁機(jī)，九陽股份有限公司產(chǎn)品；GM1010光照度測試儀，深圳聚茂源科技有限公司產(chǎn)品。

1.2　實驗方法

1.2.1工藝流程麥苗→勻漿→調(diào)配，滅菌→接種

菌→恒溫發(fā)酵→麥苗酵素

1.2.2操作要點

1）大麥苗勻漿液的制備：將大麥苗挑選去雜，用無菌水洗凈，稱取15 g，加100 mL無菌水，用打漿機(jī)打成勻漿。

2）發(fā)酵基質(zhì)的制備及滅菌：向大麥苗勻漿液中添加以下營養(yǎng)物質(zhì) （以大麥苗質(zhì)量為1）：酵母膏0.2%、硫酸鎂0.1%、氯化鋅0.1%，磷酸二氫鉀和磷酸氫二鉀各0.05%[11]。調(diào)節(jié)pH，使初始pH保持在6.0左右。蔗糖（碳源）質(zhì)量按每次實驗的需要（參見1.2.4，下同）添加。然后用紫外燈滅菌1 h，準(zhǔn)備接種。

3）酵母菌接種及發(fā)酵：將活性干酵母活化后按每次實驗的需要量接種到冷卻后的發(fā)酵基質(zhì)中，于恒溫培養(yǎng)箱中恒溫發(fā)酵一定時間，所需溫度及時間按每次實驗的需要設(shè)定。發(fā)酵后的上清液即為麥苗酵素產(chǎn)品，取樣進(jìn)行測定。1.2.3主要指標(biāo)檢測方法

1）SOD活力的測定：取干凈的具塞試管若干，編號，2支為對照管，其余為測定管，按要求加入酵素液，并做3次平行。混勻后將1支對照管置于暗處，其他各管于4000lx光照下反應(yīng)20 min（各管受光條件一致）。反應(yīng)結(jié)束后立刻避光，不照光的對照管做空白，在560 nm處測吸光值，以抑制NBT光還原的50%為一個酶活力單位，計算活力，公式如下式（1）：

式（1）中，SOD總活力以每克麥苗酵素質(zhì)量的酶單位表示 （U/g）；ACK為照光對照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度；Vt為測定時樣品用量（mL）[12]。

2）CAT活力的測定：取10 mL試管3支，其中2支為測定管，1支為空白對照管，按下表順序加入試劑。

S0號管在沸水浴中煮1 min以殺死酵素液中的酶液，冷卻。將所有試管在25℃下預(yù)熱后，逐管加入0.3 mL 0.1 mol/L的H2O2，每加完一管立即計時，并迅速導(dǎo)入石英比色皿中，在240 nm下測定吸光度，每間隔1 min讀數(shù)1次，共測4 min，待3支管全部測定完后，計算酶活力。做3次平行測定。

以每分鐘A240減少0.1的酶量為1個酶活力單位（U）：

式（2）、（3）中，AS0為加入煮死酶液的對照管的吸光度；AS1

、AS2

為樣品測定管的吸光度；VS為測定時所用酶液體積（mL）；t為從加H2O2開始到最后一次讀數(shù)的時間；0.1為A240下降0.1時的1個酶活力單位（U）[12]。

4）總酚質(zhì)量濃度的測定：配制0.1 mg/mL沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取該標(biāo)準(zhǔn)溶液0、0.1、0.2、……、0.5 mL于10 mL刻度試管中，加入5 mL H2O、1 mL福林酚試劑和2 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%Na2CO3，加水定容到刻度，在760 nm下測吸光度A760，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以0.5 mL酵素液代替標(biāo)準(zhǔn)溶液重復(fù)上述步驟，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算總酚質(zhì)量濃度[13-14]。

5）羥基自由基清除率的測定：向2 mL 1.5 mmol/L FeSO4、1.4 mL 6 mmol/L H2O2、0.6 mL 20 mmol/L 水楊酸鈉的混合溶液中加入135 μL酵素樣品，37℃恒溫水浴1 h，在562 nm處測定吸光度A562（去離子水作參比溶液），以抗壞血酸為陽性對照。羥基自由基清除率的計算公式如式（4）：

羥基自由基清除率（%）=100×[A0-（A1-A2）]/A0（4）式（4）中：A0為空白對照液的吸光度；A1為樣品測定管的吸光度；A2為樣品本底管的吸光度[15]。

1.2.4麥苗酵素酵母發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化待優(yōu)化的工藝條件包括發(fā)酵溫度、酵母接種體積分?jǐn)?shù)、發(fā)酵時間、蔗糖（碳源）添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)等。

1）發(fā)酵溫度對麥苗酵素SOD及CAT活力的影響：發(fā)酵溫度影響酵母菌的生長情況，進(jìn)而影響其SOD等代謝產(chǎn)物的生成，因此對酵素液中的活力具有很大的影響；此外溫度本身對于酶活的影響也很大，故在此處除SOD外，還測定了CAT的活力，來研究溫度對于酵素中酶活的影響。將酵母接種體積分?jǐn)?shù)固定為0.67%，分別控制溫度為27、32、37℃進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時間為12 h，發(fā)酵后測定酵素液SOD及CAT活力，確定最適發(fā)酵溫度。

2）酵母接種體積分?jǐn)?shù)對麥苗酵素SOD活力的影響：酵母接種體積分?jǐn)?shù)直接影響著酵母產(chǎn)SOD的量及活力，需要通過實驗確定最佳接種體積分?jǐn)?shù)。將發(fā)酵溫度控制在32℃，蔗糖（碳源）添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為6.7%，分別接種體積分?jǐn)?shù)為0.33%、0.50%、0.67%、0.83%、1.0%的酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵時間分別為6、12 h和18h，發(fā)酵結(jié)束后測定其SOD的活力，確定最適酵母菌接種體積分?jǐn)?shù)。

3）發(fā)酵時間對麥苗酵素SOD活力的影響：發(fā)酵時間影響著酵母的生長量及SOD的活力，將發(fā)酵溫度固定為32℃，接種酵母0.67%（體積分?jǐn)?shù)），在蔗糖（碳源）添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為3.3%、5.3%和6.7%（以大麥苗質(zhì)量為1）時，將發(fā)酵時間設(shè)置為6、9、12、15 h，發(fā)酵結(jié)束后取樣測其SOD的活力，確定最適發(fā)酵時間。

4）蔗糖（碳源）添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)對麥苗酵素SOD活力的影響：本文以蔗糖為額外的碳源，其添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)將影響酵母的生長狀況，進(jìn)而影響其SOD活力。將發(fā)酵溫度固定為32℃，酵母接種體積分?jǐn)?shù)固定為0.67%，將蔗糖添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)（以大麥苗質(zhì)量為1）分別設(shè)置為 3.3%、5.3%、6.7%、8.0%、10.0%，分別發(fā)酵9、12 h和15 h，考察不同蔗糖添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)對麥苗酵素SOD活力的影響[16]。

2　結(jié)果與討論

2.1　酵母菌發(fā)酵工藝優(yōu)化

2.1.1發(fā)酵溫度的確定發(fā)酵溫度為27℃時，麥苗酵素SOD及CAT活力最低，隨著溫度升高，SOD及CAT活力隨之增高，但當(dāng)發(fā)酵溫度超過32℃時，麥苗酵素SOD及CAT活力反而隨之降低如圖1所示。分析得出32℃為酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)麥苗酵素的適宜溫度。故實驗發(fā)酵溫度確定為32℃。

2.1.2酵母接種體積分?jǐn)?shù)的確定在3個發(fā)酵時長的條件下，當(dāng)酵母接種體積分?jǐn)?shù)小于0.67%時，麥苗酵素活力都隨接種體積分?jǐn)?shù)增加而增高；當(dāng)酵母接種體積分?jǐn)?shù)大于0.67%時，麥苗酵素SOD活力隨接種體積分?jǐn)?shù)增加而降低；而麥苗酵素SOD活力均在酵母接種體積分?jǐn)?shù)為0.67%時達(dá)到最高；3個發(fā)酵時長相比，12 h時SOD活力最高如圖2所示。分析認(rèn)為當(dāng)酵母接種體積分?jǐn)?shù)超過0.67%時，種內(nèi)斗爭加劇而導(dǎo)致酵母菌代謝減弱，從而導(dǎo)致SOD酶活力下降。

圖1　發(fā)酵溫度對麥苗酵素SOD及CAT活力的影響Fig.1　Effect of fermentation temperature on the activityof SOD and CAT in Barley ferment

圖2　酵母接種體積分?jǐn)?shù)對麥苗酵素SOD活力的影響Fig.2　Effect of yeast inoculation quantity on the activity of SOD in Barley ferment

2.1.3發(fā)酵時間的確定在3種蔗糖（碳源）添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的條件下，隨著發(fā)酵時間的增加，麥苗酵素SOD活力均逐漸增加，在12 h之后略有下降，而在12 h時活力達(dá)到最大；蔗糖添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5.3%時麥苗酵素SOD活力最高。根據(jù)圖3所示，可以將最佳發(fā)酵時間設(shè)定為12 h。

2.1.4蔗糖添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的確定在3個發(fā)酵時長的條件下，當(dāng)蔗糖添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于5.3%時，隨著蔗糖添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，麥苗酵素SOD活力均逐漸增加，在5.3%～6.7%之間保持相對穩(wěn)定，之后隨蔗糖添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而下降。分析認(rèn)為當(dāng)蔗糖添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過6.7%時，酵素液的滲透壓超過了酵母菌的滲透壓，細(xì)胞失水導(dǎo)致酶活下降。根據(jù)圖4所示，綜合成本考慮，將蔗糖添加體積分?jǐn)?shù)設(shè)為5.3%。

圖3　發(fā)酵時間對麥苗酵素SOD活力的影響Fig.3　Effect of fermentation time on the activity of SOD in Barley ferment

圖4　蔗糖添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)對麥苗酵素SOD活力的影響Fig.4　Effect of sucrose added on the activity of SOD in Barley ferment

2.1.5最終發(fā)酵工藝的確定根據(jù)以上實驗數(shù)據(jù)及分析，確定酵母菌發(fā)酵生產(chǎn)麥苗酵素的最佳工藝條件為：發(fā)酵溫度32℃，酵母接種體積分?jǐn)?shù)0.67%，發(fā)酵時間12 h以及蔗糖添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.3%。在此工藝條件下，測得麥苗酵素的SOD活力為（34.05±0.41）U/mL，實驗所用大麥苗勻漿液的SOD活力為（13.16±0.51）U/mL，向其中加入滅活酵母后其活力為（19.76±0.76） U/mL，相對于原料，酵母菌發(fā)酵麥苗酵素的活力分別提高了158.74%和72.32%，這意味著其營養(yǎng)價值得到了很大提升。

2.2　麥苗酵素抗氧化性能的初步研究

為了研究制得的麥苗酵素的抗氧化功能，除活力外，還對其CAT活力、總酚質(zhì)量濃度以及羥基自由基清除率等抗氧化指標(biāo)做了測定。

2.2.1麥苗酵素CAT活力CAT可促使H2O2分解，使細(xì)胞免受H2O2的毒害，是生物防御體系的關(guān)鍵酶之一，也是麥苗酵素中一種重要的功效酶。對制得的麥苗酵素的CAT活力進(jìn)行了測定，同時測定了實驗所用大麥苗勻漿液和添加了滅活酵母菌的大麥苗勻漿液作為對照。結(jié)果如表1。

從表1可以看出，制得的麥苗酵素的CAT活力比對照組A的CAT活力提高了98.71%，比對照組B的提高了67.75%。這表明通過酵母菌發(fā)酵，實驗制得的麥苗酵素的CAT活力既超過了實驗所用大麥苗勻漿液的CAT活力，也超過了實驗所用酵母菌（發(fā)酵前）與大麥苗勻漿液的CAT活力之和，發(fā)酵對于CAT酶活提高顯著。

表1　麥苗酵素CAT活力對比Table 1　Comparation of CAT Activity in barley ferment

2.2.2麥苗酵素總酚質(zhì)量濃度多酚是在植物性食物中發(fā)現(xiàn)的具有潛在促進(jìn)健康作用的化合物，其抗氧化功能可以對氧化損傷造成的慢性病起到預(yù)防作用，是麥苗酵素中的一種生物活性物質(zhì)。對制得的麥苗酵素的總酚質(zhì)量濃度進(jìn)行了測定，同時測定了實驗所用大麥苗勻漿液和添加了滅活酵母菌的大麥苗勻漿液作為對照。結(jié)果如表2。

表2　麥苗酵素總酚質(zhì)量濃度對比Table 2　Comparation of Total Phenol Content in barley ferment

從表2可以看出，制得的麥苗酵素的總酚質(zhì)量濃度比對照組A的總酚質(zhì)量濃度提高了82.57%，比對照組B的提高了16.88%。這表明通過酵母菌發(fā)酵，實驗制得的麥苗酵素的總酚質(zhì)量濃度既超過了實驗所用大麥苗勻漿液的總酚質(zhì)量濃度，也超過了實驗所用酵母菌（發(fā)酵前）與大麥苗勻漿液的總酚質(zhì)量濃度之和，發(fā)酵對于總酚質(zhì)量濃度提高顯著。

2.2.3麥苗酵素羥基自由基清除率羥基自由基（·OH）是一種重要的活性氧，從分子式上看是由氫氧根（OH-）失去一個電子形成，具有極強(qiáng)的氧化能力，是自然界中僅次于氟的氧化劑。羥基自由基清除率是反映物質(zhì)抗氧化性能的一個重要指標(biāo)。為研究麥苗酵素的抗氧化性能，對麥苗酵素的這項指標(biāo)進(jìn)行了測定，同時還測定了未加酵母菌且未滅菌的大麥苗勻漿液和添加了滅活酵母菌的大麥苗勻漿液作為對照。結(jié)果如表3。

表3　麥苗酵素羥基自由基清除率對比Table 3　Comparation of Hydroxyl radical scavenged of barley ferment

從上表可以看出，制得的麥苗酵素的羥基自由基清除率比對照組A的羥基自由基清除率提高了101.95%，比對照組B的提高了52.88%；且這一清除率水平達(dá)到了天然大麥酵素羥基自由基清除率的最高水平[17]；陽性對照的結(jié)果表明，該麥苗酵素的羥基自由基清楚能力介于8.0～9.0 mg/mL的抗壞血酸之間（分別為（48.27±0.35）%和（58.56±0.82）%）。這表明通過酵母菌發(fā)酵，實驗制得的麥苗酵素的羥基自由基清除率既超過了實驗所用大麥苗勻漿液的清除率，也超過了實驗所用酵母菌（發(fā)酵前）與大麥苗勻漿液的清除率，發(fā)酵后的麥苗酵素羥基自由基清除率提高顯著。

3　結(jié)　語

本文作者以大麥幼苗為原料，采用酵母菌進(jìn)行發(fā)酵，得到了麥苗酵素產(chǎn)品。通過實驗研究得到一條大麥苗發(fā)酵生產(chǎn)麥苗酵素的工藝，確定了發(fā)酵工藝參數(shù)為：發(fā)酵溫度32℃，酵母接種體積分?jǐn)?shù)0.67%，蔗糖添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)5.3%，發(fā)酵12 h。此外，還對該產(chǎn)品的抗氧化功能進(jìn)行了初步研究，其結(jié)果表明該產(chǎn)品的抗氧化功能較好，且較原料有了很大提升。本研究結(jié)果可為大麥的多功能開發(fā)利用以及酵素產(chǎn)品的研發(fā)和生產(chǎn)工藝的改進(jìn)提供一定的支持。

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