黃酒麥曲微生物總DNA提取方法比較

薛景波 ，　毛　健 *，　劉雙平

(1.糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室，江南大學(xué)，江蘇 無錫214122；2.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

“以麥制曲，用曲釀酒”是中國黃酒的特色，黃酒麥曲是以軋碎的小麥為原料，經(jīng)過加水拌曲、壓塊成型并堆放在一定的溫度和濕度條件下，富集培養(yǎng)釀酒有益微生物制得的糖化發(fā)酵劑[1]。麥曲在黃酒制作中不僅提供各種酶系，同時還是黃酒釀制的主要微生物來源，這些微生物在黃酒制作過程中共同作用，最終形成了黃酒獨特的風(fēng)格，因此黃酒麥曲有著“酒之骨”的美譽[2-4]。

黃酒麥曲中微生物的研究一直是麥曲的研究重點，傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)不僅工作量大，耗時耗力，而且無法全面的了解微生物的組成，利用分子手段研究麥曲則能夠避免傳統(tǒng)方法的不便。利用分子手段分析一定環(huán)境下微生物群落結(jié)構(gòu)時，基因組DNA提取的質(zhì)量對后續(xù)的分析有著很大的影響[5]，高質(zhì)量的提取麥曲中的總DNA對全面的剖析麥曲微生物群落結(jié)構(gòu)有著重要作用。

麥曲的制作在自然開放的環(huán)境中完成，且制曲時間較長（3個月左右），微生物來源廣泛（制曲用水、小麥、空氣微生物等）[6]，造就了麥曲復(fù)雜的微生物體系。汪建國[7]在相關(guān)研究中將麥曲制作過程中微生物的生長變化分為孢子發(fā)芽期、生長繁殖期和產(chǎn)酶成熟期3個階段，之后麥曲還要經(jīng)過長時間的放置過程，隨著水分含量的降低，麥曲中的大量霉菌、細菌產(chǎn)生成孢子、芽孢，而且小麥中豐富的蛋白質(zhì)、淀粉等雜質(zhì)易混入提取過程，這些都為基因組的提取帶來困難。所以麥曲是一種含有真菌、細菌的營養(yǎng)體、孢子和芽孢的復(fù)雜體系，在進行群落結(jié)構(gòu)解析時需要同時獲得他們的基因組，然而目前少有專門針對黃酒麥曲中宏基因組提取法方法的報道，為此本研究通過綜合比較現(xiàn)有方法優(yōu)化出一種高質(zhì)量提取麥曲中總DNA方法。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1麥曲樣品麥曲樣品取自浙江古越龍山紹

興酒股份有限公司，取樣后分裝于7℃保存。

1.2　麥曲總DNA提取及純化方法

1.2.1麥曲樣品預(yù)處理取5 g麥曲樣品加15 mL ddH2O置于50 mL的離心管中，加入適量玻璃珠，充分振蕩5 min；4℃條件于KQ700E超聲波清洗器中超聲振蕩5 min；200g離心5 min，取上清液10000 g離心10 min；收集沉淀，加2 mL ddH2O混懸均勻轉(zhuǎn)移至2 mL EP管；10 000 g離心10 min，得菌沉淀。1.2.2麥曲總DNA提取方法方法一：SDS法，參考Zhou等[8]報道方法，具體步驟如下：

菌沉淀加入0.5 mL DNA抽提液 （100 mmol/L Tris-HCl，pH 8.0，100 mmol/L EDTA，pH 8.0，100 mmol/L Na3PO4，1.5 mol/L NaCl）混懸，液氮條件下充分研磨菌體，之后加入 10 μL 溶菌酶（50 mg/mL），37℃條件下放置30 min；加入125 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)10%SDS，立即加入 5 μL 蛋白酶 K（20 mg/mL），混均后65℃水浴2 h（每隔10 min上下顛倒混均樣品）；6 000 g離心 10 min，取上清液。

方法二：氯化芐法，參照文獻[9]進行操作。

方法三：CTAB法，參考文獻[10]略有改動，具體具體方法如下：

菌沉淀加入0.5 mL DNA抽提液混懸，液氮條件下充分研磨菌體，之后加入700 μL CTAB提取緩沖液 （質(zhì)量分?jǐn)?shù) 2%CTAB，1.4 mol/L NaCl，1 mol/L Tris-HCl，0.5 mol/L EDTA），其余操作與方法一同。

方法四：超聲波法，參考文獻[11]進行操作。

方法五：Soil DNA kit提取法，菌體加入0.5 mL ddH2O混懸后，后續(xù)提取操作參照E.Z.N.A.Soil DNA Kit（美國OMEGA公司）說明書。

方法六：SDS高鹽法，DNA抽提液中NaCl濃度提高為2.5 mol/L，其余操作與方法一同。

方法七：SDS-CTAB法，SDS法65℃水浴處理樣品1 h后加入700 μL CTAB緩沖液，混均后再進行65℃水浴1 h，其余操作與方法一同。

1.2.3DNA純化方法提取的DNA除了方法5以外，其他方法參考文獻[12]對DNA進行純化操作。

1.3　麥曲總DNA質(zhì)量檢測

1.3.1電泳檢測用0.8 g/dL瓊脂糖對所得麥曲總DNA進行電泳實驗，跑膠完成后用伯樂DC XR+凝膠成像儀進行拍照觀察。

1.3.2純度檢測不同方法處理得到的樣品用紫外分光光度計于波長260、280 nm及230 nm處測定吸光值 A260、A280及 A230，計算比值 A260/A280及 A260/A230檢測樣品純度。

1.3.3PCR檢測將得到的麥曲總DNA進行TouchPCR擴增，對其中真菌的18S rDNA區(qū)進行擴增，對細菌的16S rDNA區(qū)進行擴增。真菌采用張霞等[13]在相關(guān)研究中所用通用引物，上游引物序列為NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’， 下游引物序 列 為 NS8：5’-TCCGCAGGTTCACCTACGCGA-3’，擴增片段大小為1 700 bp左右；細菌采用Delong[14]在相關(guān)研究中所用通用引物，上游引物序列 為 27f：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAC-3’，下游 引 物 序 列 為 1492r：5’-TACGGCTACCTTGTTAC GACTT-3’，擴增片段大小為1 500 bp左右。

真菌 PCR 反應(yīng)體系如下 （20 μL）：Taq PCR master mix 10 μL，上下引物各 0.2 μL，模板 1 μL，補無菌水至20 μL。相應(yīng)PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性 5 min；94℃變性 30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸 2 min（Touch down PCR，10個循環(huán)，每個循環(huán)降低 1℃）；94℃變性 30 s，58℃退火 30 s，72℃延伸2 min（20個循環(huán)）；72℃終延伸7 min。細菌PCR反應(yīng)體系如下（20 μL）：Taq PCR master mix 10 μL，上下引物各 0.4 μL，模板 1 μL，補無菌水至 20 μL。相應(yīng)PCR反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，57 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min （Touch down PCR，10個循環(huán)，每個循環(huán)降低1℃）；94℃變性30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 2 min （20個循環(huán)）；72℃終延伸7 min。PCR產(chǎn)物用0.8 g/dL瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.4Real-time PCR檢測采用伯樂CFX Connect實時定量PCR儀對總DNA進行Real-time PCR擴增。為比較不同處理方法得到的總DNA樣品中真菌和細菌相對模板數(shù)的大小，本實驗以SDS法提取得到的總DNA樣品作為參考制作稀釋曲線，稀釋倍數(shù)分別為 10、50、100、200、500、1 000，細菌Real-time PCR采 用 引 物 Eub338F：5’ -ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’ 及 Eub518R：5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’進行擴增[15]，反應(yīng)體系參考文獻[15]進行操作；真菌Real-time PCR采用引物 ITS1F：5’ -CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3’及 ITS2：5’-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3’進行擴增[16]，參反應(yīng)體系考文獻[16]進行操作。

2　結(jié)果與分析

2.1　不同提取方法電泳結(jié)果比較

7種不同方法提取麥曲總DNA樣品以0.8 g/dL瓊脂糖進行電泳得到的圖譜如圖1所示。不同方法得到的DNA片段唯一，片段較為完整，沒有雜帶，大小15 Kbp左右，但不同方法得到的條帶在上樣量相同的條件下亮度不同，其中SDS法、CTAB法、SDS高鹽法及SDS-CTAB法得到的條帶較亮且清晰。

2.2　不同提取方法純度比較

DNA樣品的純凈程度影響著后續(xù)PCR的結(jié)果，由表1可以看出，不同處理方法得到的DNA樣品在純度的得率上面有著較大的差別。Soil DNA kit提取法得到的總DNA樣品的A260/A280及A260/A230值都偏小，DNA質(zhì)量濃度較低，說明此種方法提取的總DNA有著蛋白、多糖及各種鹽離子的污染，并且提取效果不佳[17]；SDS法提取得到的總DNA樣品質(zhì)量濃度較高，但 A260/A280＜1.7，A260/A230＜2.0，說明存在著蛋白、多糖、鹽離子等的污染；氯化芐法、超聲波法及SDS高鹽法提取得到的總DNA樣品A260/A280值在1.8左右，A260/A230＜2.0，說明樣品中蛋白去除較為徹底，但存在著多糖等的污染；CTAB法及SDSCTAB法提取得到的總DNA樣品A260/A280及A260/A230值相對較為合適，得到的DNA質(zhì)量濃度較高。

圖1　7種不同方法提取麥曲的總DNA凝膠電泳分析Fig.1　Electrophoresis analysis of total DNA isolated from Wheat Qu samples using 7 different methods

表1　7種不同方法提取的總DNA產(chǎn)量及純度Table 1　Yield and purity of total DNA extracted by 7different methods

2.3　不同提取方法PCR結(jié)果比較

分別利用細菌引物 27f、1492r及真菌引物NS1、NS8對細菌16S全序列及真菌的18S全序列進行PCR擴增，擴增結(jié)果進行0.8%瓊脂糖凝膠電泳得到譜圖如圖2、圖3所示。

圖2　7種不同方法提取的麥曲總DNA進行細菌PCR擴增電泳圖Fig.2　Agarose gel ectrophoresis of PCR products of bacteria　in　samplesextracted　by　7　different methods

圖3　7種不同方法提取的麥曲總DNA進行真菌PCR擴增電泳圖Fig.3　Agarose gel ectrophoresis of PCR products of fungi in samples extracted by 7 different methods

從圖中可以看出，細菌和真菌相應(yīng)片段擴增后電泳得到的條帶單一，無雜帶，說明各自所選通用引物合適，同時細菌擴增條帶大小為1 500 bp左右，真菌擴增條帶大小為1 700 bp左右，與相關(guān)文獻相符[13-14]。7種方法得到的產(chǎn)物進行細菌PCR擴增后都能得到清晰明亮的條帶，但進行真菌PCR得到的結(jié)果有著較大的差別，其中超聲波法提取得到的樣品在真菌PCR時沒有得到相應(yīng)條帶，同時氯化芐法及Soil DNA kit法提取得到的樣品進行真菌PCR得到的條帶較弱。SDS法、CTAB法、SDS高鹽法及SDS-CTAB法在細菌和真菌PCR結(jié)果中都有著亮而清晰的條帶，說明這4種方法對真菌和細菌的提取效果相對于其他3中方法較好。

2.4　不同提取方法Real-time PCR結(jié)果比較

對SDS法提取的總DNA進行梯度稀釋，稀釋倍數(shù)分別為 10、50、100、200、500、1 000， 進行細菌和真菌Real-time PCR繪制熔解曲線和稀釋曲線如圖4、圖5所示。

由圖4、圖5可知，以SDS提取的總DNA進行細菌和真菌Real-time PCR所用引物特異性較好，細菌Real-time PCR稀釋曲線為Y=-3.337 9X+27.835，R2=0.999，擴增效率為99.3%；真菌Realtime PCR稀釋曲線為 Y=-3.172 3X+30.804，R2=0.998，擴增效率為106.6%，均符合后續(xù)分析需求。

將不同提取方法所得樣品稀釋10倍后進行細菌和真菌Real-time PCR測定Ct值比較相對模板量如表2和表3所示。

圖4　SDS法提取總DNA進行細菌Real-time PCR得到的熔解曲線和稀釋曲線Fig.4　Melting curveanddilution curve constructed by bacteria Real-time PCR using DNA templates obtained by SDS method

圖5　SDS法提取總DNA進行真菌Real-time PCR得到的熔解曲線Fig.5　Melting curve and dilution constructed by fungi Real-time PCR using DNA templates obtained by SDS method

表2　不同提取方法所得樣品中細菌相對模板量Table 2　Relative bacteria template amount in the samples extracted by 7 different methods

表3　不同提取方法所得樣品中真菌相對模板量Table 3　Relative fungi template amount in the samples extracted by 7 different methods

從表2和表3可以看出，SDS法、CTAB法、SDS高鹽法及SDS-CTAB法提取得到的總DNA中在細菌和真菌模板量上都處于較高水平，雖然超聲波法提取的總DAN在細菌PCR時條帶較亮且清晰，但進行實時定量PCR時得到細菌模板量最少，可能是PCR條件的不同及引物不同的原因，其中Soil DNA kit法提取得到的真菌模板量相對最少，這與真菌PCR的結(jié)果相符，綜合不同樣品真菌及細菌Realtime PCR結(jié)果，SDS-CTAB法提取得到的樣品不論在真菌和細菌的模板數(shù)都相對最多，說明兩種方法聯(lián)用更能有效的提取麥曲中的總DNA。

3　討　論

黃酒麥曲的制作在開放的自然環(huán)境中完成，微生物種類多且體系雜，作為黃酒制作的主要微生物來源，高質(zhì)量的提取麥曲中微生物的總DNA對于分析麥曲微生物組成從而為提高黃酒品質(zhì)奠定基礎(chǔ)有著重要作用。

在提取DNA時，菌體細胞的裂解是提取的關(guān)鍵步驟，菌體裂解方法一般有以下3種：物理法、化學(xué)法、酶解法[18]。本文研究比較的7種方法對3種裂解方法都有涉及，其中溶菌酶是專門作用于微生物細胞壁的水解酶，對于破壞革蘭氏陽性菌的細胞壁有著重要作用。SDS是一種親水性的表面活性劑，能夠溶解細胞膜上面的脂類和蛋白質(zhì)，從而破壞細胞膜，并且能夠解離細胞中的核蛋白，與其結(jié)合形成沉淀。蛋白酶K能夠很好的水解與DNA結(jié)合的蛋白，在SDS的溶液里面更能夠很好的發(fā)揮作用。CTAB是一種陽離子表面活性劑，在高離子強度的溶液中（＞0.7 mol/L NaCl），CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸，通過有機溶劑抽提，去除蛋白質(zhì)、多糖、酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來[19]。

本文中研究了SDS法和超聲波法比較了超聲波破碎和液氮研磨對菌體細胞壁及真菌孢子壁的破碎效果，通過提取率、PCR驗證及Real-time PCR分析說明超聲波法對于細菌具有一定的提取效果，但對于真菌的提取效果并不顯著，可能實驗所用的超聲波強度不能產(chǎn)生對真菌尤其是以孢子形式存在的真菌細胞壁很好的破壁效果，從而阻礙了后續(xù)總DNA的提取，且提取得到的樣品有較為嚴(yán)重的多糖及其他小分子的污染。土壤與麥曲都是真菌、細菌混雜的微生物體系，有相關(guān)文獻以Soil DNA kit對麥曲中總DNA進行提取[20]，本實驗對其提取效果進行比較發(fā)現(xiàn)Soil DNA kit對麥曲總DNA的提取效率較低，其提取純度只有11.5 ng/μL，在7種提取方法中顯著偏低，相對于超聲波法，Soil DNA kit法提取對真菌和細菌都有一定的效果，但真菌的提取效率也處于較低水平。張中華等[21]以氯化芐法對麥曲進行了總DNA的提取，本實驗參考其做法并對提取產(chǎn)物進行檢測，純度檢測表明氯化芐法能夠很好的除去提取中的蛋白質(zhì)，但對多糖的清除效果一般，通過提取率檢測、PCR驗證及Real-time PCR分析表明氯化芐法對麥曲中真菌和細菌都有一定提取效果，這與文獻報道相一致。SDS法對麥曲總DNA的提取有著較好的效果，說明SDS適用于各種較為復(fù)雜的體系，這與Zhou[8]的研究相符，但由于麥曲以軋碎的小麥為原料，小麥中的淀粉進入提取體系，在DNA提取過程中經(jīng)過65℃水浴操作，淀粉糊化產(chǎn)生大量多糖干擾提取效果，使得SDS法提取的樣品有著較多的多糖污染，說明SDS法對含有多糖的體系除去多糖效果較差。CTAB法對于含有多糖等雜質(zhì)的提取環(huán)境有著很好的提取效果，本文中對CTAB法提取麥曲總DNA效果進行考察表明，相對于SDS法，CTAB法得到的樣品澄清透亮，從純度分析可知，CTAB法大幅度的減少了多糖對樣品的污染，且蛋白質(zhì)污染也較少，提取率較高，對于麥曲是一種較好的總DNA提取方法。相關(guān)文獻指出高鹽條件下提高了多糖在乙醇溶液中的溶解度，從而達到除去多糖的效果[22]，本實驗中比較了SDS法以及SDS高鹽法提取效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)提高了提取體系的鹽濃度后多糖的污染并沒有減少，反而更加嚴(yán)重，這與文獻結(jié)果不相同，但該方法總DNA提取率依然處于較高水平。SDS-CTAB法結(jié)合了SDS法和CTAB法的優(yōu)勢，結(jié)果表明，SDS-CTAB不僅增強了對樣品的處理程度，使得到的總DNA在質(zhì)量濃度和模板數(shù)都有顯著提高，同時很大程度上減少了多糖對樣品的污染，但是2種方法聯(lián)合并沒有單獨用CTAB法更具去除多糖的效果，可能是由于65℃水浴1 h時更多的淀粉糊化溶解在體系形成更大量的多糖。通過對純度檢測、PCR驗證以及Real-time PCR分析都表明，SDS-CTAB法對于麥曲體系的提取綜合效果最好，是最為合適的提取方法。

4　結(jié)　語

本研究中通過對7種不同提取方法作用于麥曲效果進行比較表明，SDS-CTAB法聯(lián)用能夠?qū)溓鸬阶罴训奶崛⌒Ч罱K得到總DNA樣品中DNA質(zhì)量濃度達到149.6 ng/μL，蛋白質(zhì)、多糖等污染較少，PCR擴增后電泳得到條帶單一明亮，Realtime PCR結(jié)果表明相對于SDS法，細菌和真菌模板數(shù)分別達到其2.343倍和1.753倍，是一種適合于黃酒麥曲總DNA提取的優(yōu)良方法。

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