洋甘菊抑制酪氨酸酶活性成分研究

王國林，　達熱卓瑪， 徐德平*

（江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫214122）

羅馬洋甘菊（Anthemis nobilis L.），菊科黃春菊屬一年生或多年生草本植物，廣布于南歐和西歐，目前在我國新疆也有種植。羅馬洋甘菊（以下簡稱洋甘菊）有極強的香味，在醫(yī)藥、香料和化妝品的生產(chǎn)中有廣泛的應(yīng)用。洋甘菊水提物在降低STZ糖尿病大鼠的血糖含量中有顯著效果[1]，洋甘菊精油能減緩經(jīng)期綜合癥[2]，幫助肝臟再生和解痙等。另外，洋甘菊精油還可以作為香薰按摩和護發(fā)產(chǎn)品中的成分[3-4]。在化妝品中添加洋甘菊可以使皮膚更加舒緩和柔滑[5-6]，但對其在美白方面的研究還未見報道。

為此，本文對洋甘菊提取物對酪氨酸酶活性的抑制作用進行了研究，旨在明確洋甘菊乙醇提取物中的起美白作用的物質(zhì)，為洋甘菊在美白方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料與試劑

羅馬洋甘菊，購于新疆伊犁；L-酪氨酸 （生化級），國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉皆為分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；酪氨酸酶（生化級），上海寶曼生物科技有限公司產(chǎn)品。 MCI CHP20P（75～150 μm）柱填料，Mitsubishi Kasei Co. 產(chǎn)品；ODS 柱填料，Nacalai Tosoh Inc產(chǎn)品。

1.2　儀器與設(shè)備

RAT-100型萃取罐，無錫申科儀器有限公司產(chǎn)品；R-1002型旋轉(zhuǎn)儀，上海申順生物科技有限公司產(chǎn)品；ZF-90型暗箱式紫外透射儀，上海顧村電光儀器廠制造；WFJ 2000型可見分光光度計，優(yōu)尼柯（上海）儀器有限公司產(chǎn)品；核磁共振儀Avance 500 MHz，Bruer公司產(chǎn)品。

1.3　實驗方法

1.3.1洋甘菊醇提物的制備洋甘菊經(jīng)水蒸汽蒸餾法去除揮發(fā)性成分后得到的殘渣，按料液質(zhì)量比1∶5加入體積分數(shù)95%的乙醇，于50℃條件下攪拌提取3 h，過濾取上清液，如此重復(fù)2次。將3次所得上清液減壓濃縮去乙醇后即得洋甘菊醇提物濃縮液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2洋甘菊醇提物的粗分離將2.1所得洋甘菊提取物解凍后，用去離子水作適當稀釋，過慮后將濾液上MCI柱（5 cm×100 cm），依次用去離子水和不同體積分數(shù)乙醇以15 mL/min流速進行梯度洗脫。TCL檢測，茴香醛-硫酸顯色，將洗脫液分成A（水洗脫）、B（15%洗脫）、C（30%洗脫）、D（70%洗脫）4 個部分所得洗脫物分別為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ。分別減壓濃縮并真空干燥后，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3洋甘菊醇提物對酪氨酸酶抑制作用的研究

1）試劑的配制

①緩沖溶液 （PBS）的配制準確稱取Na2HPO43.55 g，NaH2PO4·2H2O 3.9 g， 分別用去離子水溶解后混合，定容至1 000 mL，調(diào)pH至6.8，配成25 mmol/L的緩沖溶液，置于4℃冰箱中待用。

②1 mmol/L酪氨酸溶液的配制準確稱取L-酪氨酸181 mg，加入數(shù)滴0.1 mol/L鹽酸溶解后，加約95 mL磷酸緩沖溶液，調(diào)節(jié)其pH至6.8，然后定容至100 mL。置于4℃冰箱中待用。

③酪氨酸酶溶液的配制將酪氨酸酶用已配好的磷酸緩沖液溶解分裝于PE管，置于-20℃冰箱中保存。

④樣品的配制準確稱取120 mg 1.3.1所得樣品和1.3.2所得的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個樣品，2.1所得樣品用含體積分數(shù)10%DMSO、pH為6.8的PBS溶解，2.2所得4個樣品用PBS溶解，均配制成8 mg/mL的溶液備用。

2）洋甘菊乙醇粗提物對酪氨酸酶活性的測定酪氨酸酶抑制率的測定參考任紅榮[7]的方法并稍加改動。 按表 1 準確吸取 T1、T2、C1、C24 組反應(yīng)液，在37℃的水浴中恒溫20 min后，各加入240 μL酪氨酸酶溶液，充分混勻，反應(yīng)30 min后，迅速冷卻以減慢反應(yīng)，然后移入比色皿中，于475 nm處測吸光度AT1、AT2、AC1、AC2，按公式 1 求抑制率。

表1　反應(yīng)液組成與體積Table 1　Composition and volume of the reaction solution

3）不同體積分數(shù)乙醇洗脫物對酪氨酸酶抑制率的測定根據(jù)1.3.3中2）的方法，在反應(yīng)體系中分別加不同質(zhì)量濃度的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ 4個樣品，測定各部分對酪氨酸酶的抑制率。

1.3.4洋甘菊醇提物MCI 30%（體積分數(shù)）乙醇洗脫物的分離純化將30%（體積分數(shù)）乙醇洗脫物用適量的去離子水溶解后，過MCI柱（5 cm×100 cm），用30%（體積分數(shù)）的乙醇洗脫，將洗脫液分成A、B、C 3個部分。分別將各部分依次過MCI（3 cm×100 cm）柱和ODS-A柱（3 cm×100 cm），經(jīng)TCL鑒定純度，共得 3個純化合物 1、2、3。

2　結(jié)果與分析

表2　不同體積分數(shù)乙醇洗脫物對酪氨酸酶活性的抑制作用Table 2　Inhibition of tyrosinase activity by different ethanol concentration elution

2.1　洋甘菊乙醇粗提物對酪氨酸酶活性的測定

對洋甘菊體積分數(shù)95%乙醇提物對酪氨酸酶活性的抑制率如圖1。

圖1　乙醇粗提物對酪氨酸酶活性的抑制Fig.1　Inhibition of tyrosinase by crude ethanol extract

從圖可知，洋甘菊體積分數(shù)95%乙醇提物對酪氨酸酶的活性有抑制作用，并且在提取物質(zhì)量濃度小于200 μg/mL時，抑制率隨著質(zhì)量濃度的增加而增加較快；當提取物質(zhì)量濃度大于200 μg/mL時，抑制率隨著質(zhì)量濃度的增加而較慢。

2.2　不同體積分數(shù)乙醇洗脫物對酪氨酸酶活性的抑制作用

對洋甘菊醇提物經(jīng)MCI柱后不同體積分數(shù)乙醇洗脫物對酪氨酸酶活性的抑制率如表2所示。

由表2的實驗結(jié)果可知，在不同體積分數(shù)乙醇洗脫中，30%（體積分數(shù)）乙醇濃度洗脫物對酪氨酸酶活性的抑制率最靈敏，并且隨著樣品質(zhì)量濃度的增加，抑制率趨于平衡。而水洗物和體積分數(shù)70%乙醇洗脫物對酪氨酸酶活性的抑制率都較低。因此，本文針對洋甘菊乙醇粗提物的30%（體積分數(shù)）乙醇洗脫物部位進行進一步的分離純化研究。

2.3　30%體積分數(shù)乙醇洗脫物的分離

對30%體積分數(shù)乙醇洗脫物經(jīng)反復(fù)上MCI柱和ODS-A柱后，TCL檢測，茴香醛-硫酸顯色，得到3個單體化合物。

2.4　活性物質(zhì)的確定

以二甲亞砜為溶劑，四甲基硅烷（TMS）為內(nèi)標物，將上述3個化合物經(jīng)氫譜和碳譜等光譜數(shù)據(jù)分析，確定其結(jié)構(gòu)。

1）化合物1,淡黃色粉狀物，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，可溶于水。

表3　化合物1、2、3的13C-NMR數(shù)據(jù)Table 3　Signals of carbon in the13C-NMR 0f 1，2 and 3

由化合物1的1H-NMR譜圖可知，δ 8.06處有2個質(zhì)子信號，J=8.9 Hz，δ 6.88有2個質(zhì)子信號，J=8.9 Hz，說明該化合物中含有1個對位取代苯環(huán)，這4 個氫均為苯環(huán)上的氫。δ 6.44（1H，d，J=2.0），δ 6.21（1H，d，J=2.0）為苯環(huán)上的間位質(zhì)子信號，是連有羥基的碳鄰位碳上的氫。δ 5.46處的質(zhì)子信號為糖的端基質(zhì)子，J=7.1，可知該糖為β構(gòu)型。δ 3.33～δ 4.95處的質(zhì)子信號為糖上的其他氫。化合物1的13CNMR數(shù)據(jù)如表3所示，經(jīng)與文獻[9]相比較，可判斷該化合物為山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。其結(jié)構(gòu)見圖2左上。

2）化合物2，淡黃色粉狀物，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，可溶于水。

從化合物2的1H-NMR譜可見，δ 6.20，δ 6.40（1H，d，J=2.0）處各有 1個質(zhì)子，為苯環(huán)上的間位氫。δ 6.86，δ 7.57，δ 7.59 處各有 1 個質(zhì)子信號，從偶合常來看是同一個苯環(huán)的3個氫。δ 5.47（H，d，J=7.0 Hz）處為葡萄糖端基質(zhì)子信號，δ 3.45～δ 3.59為糖上的其他質(zhì)子信號。化合物2的13C-NMR數(shù)據(jù)表如表3所示，化合物2中有21個碳，其中6個碳為糖中的碳，一個為甲氧基。將其余15個碳的碳信號與文獻[10]參比，可知化合物2為應(yīng)為異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷。其結(jié)構(gòu)見圖2右上。

3）化合物3，淡黃色粉狀物，易溶于甲醇、乙醇等有機溶劑，可溶于水。從1H-NMR、13C-NMR譜中可見，化合物3與化合物1的母環(huán)結(jié)構(gòu)一樣，2、但不同之處為化合物3糖C6位連有一個3-羥基-3-甲基-戊二酰基團。黃酮上連有3-羥基-3-甲基-戊二?；鶊F可能是乙酰輔酶A或L-亮氨酸在洋甘菊代謝合成異戊烯二磷酸過程中的中間產(chǎn)物。GABRIELA M.等人[10]在1996年就從洋甘菊水提物中分離并解出該化合物。該化合物在洋甘菊中含量較少。其結(jié)構(gòu)見圖2下。

3　結(jié)　語

研究發(fā)現(xiàn)，洋甘菊體積分數(shù)95%乙醇提取物對酪氨酸酶的活性有抑制作用，并且經(jīng)MCI柱后30%（體積分數(shù)）乙醇洗脫物對酪氨酸酶的抑制最靈敏。從30%（體積分數(shù)）乙醇洗脫物中分離得到3個化合物，經(jīng)NMR鑒定為山奈酚-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、異鼠李素-3-O-β-D-吡喃葡萄糖苷、山奈酚-3-O-（6"-3-羥基-3-甲基-戊二?；?β-D-吡喃葡萄糖苷，都是黃酮類化合物。由此可以推測對酪氨酸酶的活性有抑制作用的成分應(yīng)是黃酮類，這與文獻[11]中報道甘草中胱甘草腚（黃酮類物質(zhì)）對酪氨酸酶有強抑制作用的報道相類似。因此，本研究確定了洋甘菊美白作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，為洋甘菊美白護膚品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

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