三陰型、Luminal型、HER2陽性型乳腺癌瘤組織中FA/BRCA通路基因表達對比觀察

馬蕓，段文晶，李姝墨，董堅，楊瑩

(1昆明醫(yī)科大學(xué)，昆明650500；2昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院；3昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院)

乳腺癌是20～59歲婦女常見的腫瘤相關(guān)死亡原因[1,2]。目前臨床上參考分子亞型和免疫組化檢查結(jié)果將乳腺癌劃分為Luminal型、HER2陽性型(后簡稱HER2型)及三陰型三種亞型，而不同亞型乳腺癌的分子病理機制、臨床特點、治療方法及預(yù)后各不相同。研究發(fā)現(xiàn)有多個范科尼貧血(FA)基因(FA-A、B、C、D1、I、E、F、G、I、J、L、M、N)與乳腺腫瘤易感基因(BRCA)1、BRCA2組成一個復(fù)雜的FA/BRCA信號通路，該通路主要調(diào)控DNA雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)，在細胞周期調(diào)控、細胞凋亡、基因轉(zhuǎn)錄與維持基因穩(wěn)定性等過程中也發(fā)揮重要作用[3]。FA/BRCA通路相關(guān)蛋白被認(rèn)為與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切關(guān)系，如乳腺癌、卵巢癌、胰腺癌等[4]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)FA/BRCA通路的過度激活與腫瘤耐藥發(fā)生有關(guān)，F(xiàn)A基因表達與惡性腫瘤發(fā)病及放療治療效果關(guān)系密切等[5～8]。雖然FA基因在乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用已有報道，但關(guān)于FA/BRCA通路相關(guān)基因在不同亞型乳腺癌中表達情況的研究較少。本研究觀察了不同亞型乳腺癌組織中FA/BRCA通路基因的表達差異，以期了解FA/BRCA通路基因表達與乳腺癌分子亞型的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 乳腺癌組織標(biāo)本來源 昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院乳腺外科2013年5月～2017年9月手術(shù)切除的女性患者乳腺癌組織標(biāo)本共93例份，均為浸潤性導(dǎo)管癌，其中直接手術(shù)的三陰型乳腺癌、Luminal型乳腺癌、HER2型乳腺癌各20例，行新輔助化療后的三型乳腺癌分別為11、13、9例。除不同分型的新輔助化療患者在生育次數(shù)方面有統(tǒng)計學(xué)差異外，其余各組數(shù)據(jù)差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(詳見表1)。而生育次數(shù)與乳腺癌的相關(guān)性報道較少，因此我們認(rèn)為各組患者資料具有一定可比性。乳腺癌組織和正常組織(距離腫瘤灶>5 cm)手術(shù)取材后立即保存于-80 ℃超低溫冰箱，隨后轉(zhuǎn)入液氮中凍存，用于后續(xù)檢測。

表1 乳腺癌組織來源患者基本資料比較(M)

1.2 三種亞型乳腺癌組織中FA/BRCA通路基因檢測 以GAPDH為內(nèi)參。采用real-time PCR法檢測不同分型乳腺癌組織中的FA/BRCA通路基因(FANCA、FANCD2、FANCF、FANCI、BRCA1、BRCA2)。相關(guān)引物序列見表2。總RNA提取按照TRIzol試劑說明書進行。逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照All-in-OneTMFirst-Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒說明書操作。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 10 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，40個循環(huán)，72 ℃ 10 min。以2-ΔΔCt表示目的基因相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Gaphpad Prism6.0進行統(tǒng)計分析。計量資料多組間比較采用LSD法，兩兩比較采用非配對t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 直接手術(shù)的三種亞型乳腺癌患者腫瘤組織中FA/BRCA通路基因表達情況 對于直接手術(shù)的患者，HER2型乳腺癌組織中BRCA1、FANCI、FANCD2基因相對表達量高于對應(yīng)正常組織，三陰型乳腺癌組織中FANCD2、FANCI基因相對表達量高于相應(yīng)的正常組織，三陰型、Luminal型、HER2型乳腺癌組織中FANCF基因相對表達量均低于相應(yīng)正常組織(P均<0.01)；HER2型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI基因表達量均高于三陰型和Luminal型，Luminal型乳腺癌組織中FANCA基因表達量高于HER2型和三陰型(P均<0.05)。詳見表3。

2.2 新輔助化療的不同分型乳腺癌患者腫瘤組織中FA/BRCA通路基因表達情況 新輔助化療后的三陰型乳腺癌組織中除FANCF外其余5個基因表達量均非常低，F(xiàn)ANCD2在乳腺癌組織中的表達水平低于正常組織，Luminal型和HER2型乳腺癌組織中BRCA1表達水平高于正常組織(P均<0.05)；新輔助化療后的Luminal型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCA、FANCI基因表達均高于三陰型和HER2型(P均<0.05)。詳見表4。

表2 待測基因引物序列

2.3 直接手術(shù)組與新輔助化療組乳腺癌患者腫瘤組織中FA/BRCA通路基因表達比較 新輔助化療的三陰型和HER2型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI基因表達量低于直接手術(shù)者(P均<0.05)。新輔助化療后的三個亞型乳腺癌組織中FANCF的表達水平高于直接手術(shù)者(P均<0.05)。詳見表5。

3 討論

大量研究報道FA/BRCA通路蛋白與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展、治療反應(yīng)、耐藥性產(chǎn)生等有關(guān)。Dai等[9]的研究提示FANCL在順鉑誘導(dǎo)的DNA損傷修復(fù)過程中扮演了重要角色。BRCA1和BRCA2(FANCD1)已被證實是乳腺癌遺傳易感基因，能夠調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄和細胞周期，誘導(dǎo)細胞凋亡，修復(fù)DNA損傷并維護基因組的完整性。BRCA1的突變與乳腺癌、卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)[10]。體外實驗發(fā)現(xiàn)上調(diào)BRCA1表達可提高卵巢癌SKOV-3細胞的順鉑抗性[11]，在乳腺癌HBL100細胞中下調(diào)BRCA1表達可增加細胞對順鉑的敏感性[12]。有學(xué)者[13]認(rèn)為RRM1和BRCA1可作為評估肺癌患者預(yù)后的指標(biāo)。

表3 直接手術(shù)的不同分型乳腺癌患者腫瘤組織中FA/BRCA通路基因表達比較

表4 新輔助化療的不同分型乳腺癌患者腫瘤組織中FA/BRCA通路基因表達比較

表5 直接手術(shù)與新輔助化療的不同分型乳腺癌患者腫瘤組織中FA/BRCA通路基因表達比較

FANCD2和FANCI在DNA修復(fù)途徑中處于重要地位，F(xiàn)A/BRCA途徑的核心事件是FANCI-FANCD2(ID)蛋白復(fù)合物的單泛素化。研究[14]發(fā)現(xiàn)FANCI蛋白與FANCD2蛋白可形成復(fù)合體，該復(fù)合體經(jīng)過泛素化修飾后，被招募到發(fā)生DNA鏈交聯(lián)的位點，與其他分子共同完成修復(fù)過程。有學(xué)者[15]成功解析了FANCI-FANCD2復(fù)合體的晶體結(jié)構(gòu)。我國研究者[16]發(fā)現(xiàn)FANCD2表達與乳腺癌TNM分期呈負相關(guān)，認(rèn)為FANCD2可能參與了乳腺癌的發(fā)生。Komatsu等[17]發(fā)現(xiàn)肝癌組織中FANCD2表達上調(diào)，且FANCD2表達水平較高的患者其腫瘤直徑大，侵襲性強、預(yù)后差，F(xiàn)ANCD2表達水平可作為預(yù)測治療效果的指標(biāo)。

FANCF作為FA核心復(fù)合體的銜接蛋白，對復(fù)合體的正確組裝和穩(wěn)定起重要作用[18]，同時FANCF作為關(guān)鍵因子參與FANCD2泛素化激活過程，其功能破壞可引起多種實體腫瘤的發(fā)生。Yao等[19]研究發(fā)現(xiàn)在阿霉素耐藥的白血病細胞中FANCF和泛素化的FANCD2蛋白表達上調(diào)，同時耐藥細胞株與敏感細胞相比，其DNA損傷程度降低，結(jié)果提示FA通路蛋白可通過提高DNA損傷修復(fù)水平來增加細胞對阿霉素的耐藥性。也有學(xué)者[20]認(rèn)為FANCF是卵巢癌治療中的一個潛在靶點。乳腺癌相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌細胞株MCF-7、MDA-MB-435S中敲低FANCF表達可導(dǎo)致細胞增殖速率減慢，細胞周期紊亂并誘導(dǎo)細胞凋亡，細胞遷移和侵襲能力減弱；此外，F(xiàn)ANCF敲低導(dǎo)致乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性升高，F(xiàn)ANCF可能是乳腺癌治療的潛在靶點[21]。

乳腺癌的分型與腫瘤致病危險因素、疾病進程、預(yù)后和治療方案的選擇密切相關(guān)。目前普遍認(rèn)為Luminal型乳腺癌所占比例最高，其次是三陰型，HER2型最少?；颊叩念A(yù)后以三陰型最差，其次為HER2型，Luminal型預(yù)后最好。研究表明FA/BRCA通路蛋白可能參與了乳腺癌的發(fā)生和耐藥形成，但該通路相關(guān)蛋白在不同亞型乳腺癌組織及治療后組織中的表達情況尚不清楚。因此，本研究通過對比觀察3種亞型乳腺癌組織中FA/BRCA通路基因的表達情況，探討FA/BRCA通路基因在三種乳腺癌發(fā)生發(fā)展中的可能作用。本研究發(fā)現(xiàn)，對于直接手術(shù)的患者，HER2型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI基因相對表達量高于三陰型和Luminal型，提示FA/BRCA通路基因在HER2型乳腺癌與其他兩亞型乳腺癌中作用差異較大。結(jié)合臨床上HER2型乳腺癌病例數(shù)最少，我們推測FA/BRCA通路基因可能在HER2型乳腺癌的發(fā)生中有一定作用。新輔助化療后的三陰型乳腺癌組織與正常組織中除FANCF外其余5個基因表達量均非常低，新輔助化療后的Luminal型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCA、FANCI基因表達均高于三陰型和HER2型。鑒于Luminal型乳腺癌是三種亞型患者中預(yù)后效果最好的，提示我們FA/BRCA通路中的BRCA1、BRCA2、FANCA、FANCI基因高表達可能與Luminal型乳腺癌患者新輔助化療預(yù)后有關(guān)。新輔助化療后的三陰型和HER2型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI基因表達量低于直接手術(shù)者，表明新輔助化療在一定程度上影響B(tài)RCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI的表達。新輔助化療后的3種亞型乳腺癌組織中FANCF的表達水平高于直接手術(shù)者，提示FANCF在新輔助化療過程中表達上調(diào)，這種改變可能與患者對藥物的敏感性變化有關(guān)。

綜上所述，三種亞型乳腺癌組織中FA/BRCA通路基因表達差異性較大；對于直接手術(shù)的患者，HER2型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI基因相對表達量高于三陰型和Luminal型，提示FA/BRCA通路基因在HER2型乳腺癌與其他兩亞型乳腺癌中作用差異較大。新輔助化療后的Luminal型乳腺癌組織中BRCA1、BRCA2、FANCA、FANCI基因表達均高于三陰型和HER2型，提示BRCA1、BRCA2、FANCA、FANCI基因高表達可能與Luminal型乳腺癌患者新輔助化療預(yù)后有關(guān)。新輔助化療可在一定程度上影響B(tài)RCA1、BRCA2、FANCD2、FANCI的表達。FANCF表達改變可能與乳腺癌細胞對化療藥物的敏感性有關(guān)。

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