瑞舒伐他汀對動脈硬化中巨噬細胞極化的影響

王海良，王守濤

0 引言

動脈粥樣硬化(Arteriosclerosis，AS)發(fā)病初期是泡沫細胞形成。巨噬細胞形成泡沫細胞的過程與巨噬細胞亞型改變相關[1-2]。正常情況下，M2型巨噬細胞能吞噬脂質，被攝取的脂質激活肝X受體(Liver X receptors，LXRs)，增加ATP結合盒轉運體(ATP binding cassette transporter，ABC)A1，ABCG1表達及其介導的脂質轉運，將胞內(nèi)的脂質運出[3-4]。當以上過程出現(xiàn)障礙，脂質在胞內(nèi)堆積，刺激M2型巨噬細胞轉化為M1型巨噬細胞，M1型巨噬細胞產(chǎn)生大量促炎因子，并造成脂質堆積，導致粥樣斑塊形成。瑞舒伐他汀是臨床常用的降脂藥，通過抑制HMG-CoA還原酶來抑制低密度脂蛋白和極低密度脂蛋白的合成[5]。研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀除了能抑制脂質產(chǎn)生，還能抑制巨噬細胞免疫相關因子的表達，但機制不明確。本研究通過探討瑞舒伐他汀對AS中巨噬細胞亞型的影響，探討瑞舒伐他汀對巨噬細胞功能影響的機制，為臨床治療AS提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 選擇7周齡雄性SPF級SD大鼠36只，體重(180±20)g。每日定時喂水喂食，室溫控制在(23±2)℃，按晝夜12 h節(jié)律活動。

1.1.2 主要試劑 瑞舒伐他汀(阿斯利康，英國)，一抗抗體來自Cell signaling technology(美國)，二抗來自Invitrogen(美國)。

1.2 研究方法

1.2.1 分組和大鼠動脈粥樣硬化模型的構建 將SD大鼠隨機分為對照組(CON組)12只和模型組24只，模型組再分為動脈硬化組(AS組)12只和藥物組(R組)12只。CON組在實驗第1天右側后肢股部肌注生理鹽水，花生油灌胃2次，普通飼料喂養(yǎng)4周，再開始生理鹽水灌胃加普通飼料喂養(yǎng)4周。AS組在實驗第1天右側后肢股部肌注維生素D3300 kU/kg，含尼古丁25 mg/kg花生油灌胃2次，高脂飲食喂養(yǎng)4周，再開始生理鹽水灌胃加高脂飼料喂養(yǎng)4周。R組在AS組基礎上，在高脂飲食4周后，用瑞舒伐他汀[5 mg/(kg·d)]灌胃4周，同時進行高脂飲食。大鼠動脈粥樣硬化模型參照趙娟等[6]的AS大鼠模型構建,構建完成后，超聲及病理可以檢測到動脈粥樣硬化斑塊。

1.2.2 取材 模型構建8周后，用水合氯醛將大鼠處死，切取大鼠胸主動脈組織10 mm，去除血管外膜上的組織，其中5 mm用4%多聚甲醛固定，進行主動脈病理形態(tài)學檢測，5 mm剪碎，加入Lysis buffer處理，進行免疫印跡檢測。

1.2.3 主動脈病理形態(tài)學檢測 取胸主動脈橫斷進行連續(xù)取材，將樣品放入4%多聚甲醛中固定24 h，行石蠟包被，切片，通過脫蠟，染色，脫水，透明，固封等步驟進行HE染色，光學顯微鏡觀察動脈內(nèi)膜形態(tài)。

1.2.4 巨噬細胞極化情況 使用免疫印跡法檢測巨噬細胞極化情況,將Lysis buffer處理的樣片離心，13 000 r/min，4 ℃，15 min，取上清置于新的EP管中。取2 μL樣品，使用BCA法測定蛋白濃度。加緩沖液將樣品蛋白濃度調(diào)至一致，加熱至95 ℃變性5 min。將樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳分離，通過轉膜，封閉，一抗二抗孵育，掃膜，分析條帶灰度。M1的表面標記物為CD86，M2的表面標記物為CD168，內(nèi)參為β-actin，標記物與β-actin比值代表巨噬細胞極化情況。

1.2.5 炎癥因子在血管組織中的表達 使用免疫印跡方法檢測干擾素(IFN)-γ、白介素(IL)-4在血管組織中的表達情況。

2 結果

2.1 瑞舒伐他汀對主動脈形態(tài)的影響 結果顯示，CON組的胸主動脈內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細胞排列整齊密集，內(nèi)彈力層完整，中層平滑肌細胞排列整齊，無斑塊形成。AS組內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)膜下有平滑肌細胞增生，斑塊形成，泡沫細胞聚集。R組內(nèi)膜增厚，有平滑肌增生和脂質沉積，但比AS組減輕。見圖1。

2.2 瑞舒伐他汀對巨噬細胞極化的影響 結果顯示，AS組CD86水平明顯高于CON組和R組，R組CD86明顯高于CON組，R組CD168水平明顯高于AS組和CON組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖2。

圖1 大鼠胸主動脈壁HE染色(400×)

圖2 瑞舒伐他汀對巨噬細胞極化的影響

2.3 瑞舒伐他汀對主動脈炎癥因子表達的影響 結果顯示，AS組IFN-γ水平明顯高于CON組和R組，R組IFN-γ明顯高于CON組，R組IL-4水平明顯高于AS組和CON組，且差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 瑞舒伐他汀對主動脈炎癥因子表達的影響

3 討論

巨噬細胞接受一定刺激分化為不同亞型的過程稱為巨噬細胞極化，其中Th1刺激形成M1型巨噬細胞，Th2刺激形成M2型巨噬細胞。巨噬細胞極化受不同因素調(diào)節(jié)，IFN-γ刺激產(chǎn)生M1型巨噬細胞，具有促炎作用，表面表達大量清潔受體(Scavenger receptor，SR)，介導細胞吞噬oxLDL[7]。IL-4、IL-10、糖皮質激素刺激產(chǎn)生M2型巨噬細胞，具有強抗炎作用，產(chǎn)生抗炎因子IL-10、IL-6，抑制M1型巨噬細胞產(chǎn)生等[8]。

瑞舒伐他汀是新型的HMG-CoA還原酶抑制劑，具有強效的降脂作用，是目前治療心腦血管疾病的常用藥物。本研究發(fā)現(xiàn)，瑞舒伐他汀能有效改善動脈粥樣硬化，增加M2巨噬細胞比例和IL-4表達。IL-4能促進巨噬細胞向M2型巨噬細胞分化，M2型巨噬細胞可以抑制膽固醇在細胞內(nèi)沉積。所以瑞舒伐他汀改善動脈粥樣硬化的原因可能是促進IL-4分泌，從而促進M2型巨噬細胞分化，減少膽固醇沉積和斑塊形成。研究顯示，他汀類藥物能直接參與免疫調(diào)節(jié)，增加IL-4、IL-10等抗炎癥因子的轉錄和表達，減少IFN-γ等促炎癥因子的轉錄和表達，從而促進M2型巨噬細胞分化[9]。本研究提示，瑞舒伐他汀除了有強效降脂作用，還能通過促進M2型巨噬細胞分化來抑制粥樣斑塊形成，防止AS發(fā)生。

參考文獻：

[1] Ferrante CJ,Pinhal-Enfield G,Elson G,et al.The adenosine-dependent angiogenic switch of macrophages to an M2-like phenotype is independent of interleukin-4 receptor alpha (IL-4Rα) signaling[J].Inflammation,2013,36(4):921-931.

[2] Boyle JJ,Johns M,Kampfer T,et al.Activating transcription factor 1 directs Mhem atheroprotective macrophages through coordinated iron handling and foam cell protection[J].Circ Res,2012,110(1):20-33.

[3] Bories G,Colin S,Vanhoutte J,et al.Liver X receptor activation stimulates iron export in human alternative macrophages[J].Circ Res,2013,113(11):1196-1205.

[4] Westerterp M,Bochem AE,Yvan-Charvet L,et al.ATP-binding cassette transporters,atherosclerosis,and inflammation[J].Circ Res,2014,114(1):157-170.

[5] Giunti S,Calkin AC,Forbes JM,et al.The pleiotropic actions of rosuvastatin confer renal benefits in the diabetic Apo-E knockout mouse[J].Am J Physiol Renal Physiol,2010,299(3):F528-F535.

[6] 趙娟,李相軍,孫波,等.維生素D3聯(lián)合高脂飼料建立大鼠動脈粥樣硬化模型[J].實用醫(yī)學雜志,2009,25(21):3569-3571.

[7] Marino F,Maresca AM,Cosentino M,et al.Angiotensin II type 1 and type 2 receptor expression in circulating monocytes of diabetic and hypercholesterolemic patients over 3-month rosuvastatin treatment[J].Cardiovasc Diabetol,2012,11:153.

[8] Hwang I,Yang J,Hong S,et al.Non-transcriptional regulation of NLRP3 inflammasome signaling by IL-4[J].Immunol Cell Biol,2015,93(6):591-599.

[9] Cho KY,Miyoshi H,Kuroda S,et al.The phenotype of infiltrating macrophages influences arteriosclerotic plaque vulnerability in the carotid artery[J].J Stroke Cerebrovasc Dis,2013,22(7):910-918.