花椒毒酚對重癥急性胰腺炎大鼠腦損傷保護(hù)作用及NF-κB/iNOS通路的影響

湯建軍，李恒平，韓小樂，林晶晶

0 引言

重癥急性胰腺炎(Severe acute pancreatitis,SAP)是臨床常見的急性病癥，是由多種病因所致的胰腺局部炎癥反應(yīng)，且多伴有其他器官的功能改變，其發(fā)病急且病情較為兇險(xiǎn)，對患者生命健康造成嚴(yán)重威脅[1]。胰性腦病是SAP常見的并發(fā)癥，患者主要表現(xiàn)為意識模糊、出現(xiàn)幻覺等精神異常癥狀，并發(fā)胰性腦病的SAP患者其病死率可達(dá)67%～100%，成為目前SAP臨床研究關(guān)注的重點(diǎn)方向[2-3]。核因子-KappaB(Nuclear factor-κB,NF-κB)是目前已知的與SAP密切相關(guān)的細(xì)胞因子，且參與腦損傷的病理進(jìn)程，在機(jī)體炎癥相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控中發(fā)揮重要作用[4]。本研究采用5%牛黃膽酸鈉(2 mL/kg)逆行注入大鼠胰膽管建立SAP模型，擬通過觀察花椒毒酚腹腔給藥后大鼠腦組織損傷程度、NF-κB及其下游因子一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)的表達(dá)情況，探討花椒毒酚對SAP大鼠腦損傷的保護(hù)作用及其作用機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 雄性Wistar大鼠64只，SPF級，體重(270±20)g，鼠齡6～7周，購自河南省實(shí)驗(yàn)動物中心[合格證號：SCXK(豫)2013-0001]，所有大鼠購回后均在本項(xiàng)目組動物飼養(yǎng)室進(jìn)行3 d適應(yīng)性喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑 牛黃膽酸鈉購自美國Sigma公司；戊巴比妥鈉購自上海生化試劑公司；血漿淀粉酶檢測試劑盒購自北京雷根生物技術(shù)有限公司；大鼠血清NO、NF-κB p65 ELISA檢測試劑盒購自上海生工生物工程有限公司；兔抗鼠NF-κB p65、iNOS、GADPH一抗及兔抗鼠IgM二抗均購自美國Abcam公司。

1.3 主要儀器 普通天平購自上海醫(yī)療儀器總廠；TE214S型分析天平購自德國Sartorius公司；Microfuge R型離心機(jī)購自美國Beckman公司；CARY 60紫外分光光度計(jì)購自美國Agilent公司；Multiskan FC型酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific公司；雙垂直電泳儀和電轉(zhuǎn)膜儀購自北京六一儀器廠；全自動凝膠成像分析系統(tǒng)購自美國Bio-Rad公司。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動物模型建立及分組 采用隨機(jī)Z字形分組法將大鼠隨機(jī)分為正常對照組(假手術(shù)組)、模型組、花椒毒酚低劑量組(5 mg/kg)、花椒毒酚高劑量組(10 mg/kg)，每組又分為3 h組和12 h組2個(gè)亞組，共8組，每組8只大鼠。造模前禁食12 h，禁水4 h，采用25 g/L戊巴比妥鈉(1.2 mg/kg)腹腔注射進(jìn)行麻醉，將大鼠固定于手術(shù)臺上，對腹部進(jìn)行常規(guī)消毒后進(jìn)行開腹，找出胰腺和膽胰管，從膽胰管十二指腸的開口處進(jìn)4號針并逆行穿刺至胰腺，在胰腺被膜下以0.1 mL/min的速度均勻注入5%牛黃膽酸鈉(2 mL/kg)，注射完成后采用夾子夾住胰管30 min后去除，一次縫合腹壁。假手術(shù)組開腹后僅做翻動胰腺操作，不進(jìn)行任何注射。

2.2 給藥 所有大鼠進(jìn)行腹壁縫合關(guān)腹后立即置入籠子中進(jìn)行保暖(將白熾燈懸掛于籠子上進(jìn)行加溫)等待麻醉蘇醒，正常對照組和模型組均在造模完成后立即給予25% DMSO的生理鹽水腹腔注射(10 mL/kg)，花椒毒酚低、高劑量組分別給予預(yù)先采用DMSO溶解并用生理鹽水稀釋至濃度為0.50、1.00 mg/mL(DMSO終濃度為25%)的花椒毒酚腹腔注射(10 mL/kg)。

2.3 血清學(xué)指標(biāo)檢測 于術(shù)后3、12 h，采用1.5%戊巴比妥鈉對大鼠進(jìn)行麻醉后，抽取腹主動脈血2 mL置于EDTA抗凝管中，3 000 r/min離心15 min，取上清進(jìn)行分裝后，置于-80 ℃冰箱中待測。血漿淀粉酶的檢測采用碘-淀粉比色法；血漿NO、NF-κB p65 ELISA的檢測采用雙抗夾心ELISA法。

2.4 胰腺組織HE染色 大鼠麻醉處死后，取胰腺組織，切取部分組織快速置于10%多聚甲醛中固定24 h，進(jìn)行常規(guī)制片、HE染色，并在顯微鏡下觀察采用Schmidt評分法對胰腺組織進(jìn)行評分，根據(jù)水腫、炎癥、壞死程度各分為5級,得分為0～4分，出血得分為0～1分，總分為13分，得分越高說明胰腺組織損傷越嚴(yán)重。

2.5 腦組織相關(guān)指標(biāo)檢測 ①HE染色：腦組織HE病理檢查方法參考胰腺組織，評分方法參考文獻(xiàn)[5]，根據(jù)神經(jīng)元細(xì)胞、腦血管、膠質(zhì)細(xì)胞及髓鞘4項(xiàng)進(jìn)行評分，每項(xiàng)0～4分，共12分，得分越高說明腦組織損傷越嚴(yán)重。②神經(jīng)功能評分：采用Longa評分法對大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評分[6]，0分：正常，1分：提尾巴時(shí)，右前肢無法正常伸展，2分：向右側(cè)輕度旋轉(zhuǎn)，3分：向右顛倒，4分：昏迷或不能自發(fā)行走，5分：因腦損傷造成的死亡。③腦組織含水量測定：采用干-濕重法在分析天平上對原始重量進(jìn)行稱量即為濕重，在80 ℃條件下干燥24 h后對其進(jìn)行再次稱量即為干重，組織含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。④腦組織NF-κB、iNOS蛋白水平檢測：采用Western blot法進(jìn)行檢測，首先采用RIPA蛋白裂解法提取腦組織中的總蛋白，采用BCA法檢測蛋白濃度，并調(diào)至一致后，上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳，將蛋白電轉(zhuǎn)移至NC膜上，采用脫脂奶粉封閉2 h，加入預(yù)先按一定比例稀釋好的一抗(NF-κB p65、iNOS、GADPH)，4 ℃孵育過夜，采用TBST洗膜3次后，加入按一定比例稀釋的IgG兔抗鼠二抗，室溫孵育2 h，ECL顯色，采用全自動凝膠成像儀進(jìn)行圖像采集，并使用Image J軟件對條帶進(jìn)行灰度分析，各組均以目的蛋白表達(dá)量與GADPH的比值作為目的蛋白相對表達(dá)量進(jìn)行比較。

3 結(jié)果

3.1 花椒毒酚對胰腺組織病理變化的影響 模型組大鼠術(shù)后3、12 h胰腺組織病理評分明顯高于對照組(P<0.05)；花椒毒酚低高劑量組胰腺組織病理評分較模型組明顯降低(P<0.05)，其中高劑量組明顯低于低劑量組(P<0.05)，但仍明顯高于對照組(P<0.05)。見表1、圖1。

3.2 花椒毒酚對腦組織病理變化的影響 模型組大鼠術(shù)后3、12 h腦組織病理評分明顯高于對照組(P<0.05)；花椒毒酚低、高劑量組腦組織病理評分較模型組明顯降低(P<0.05)，其中高劑量組明顯低于低劑量組(P<0.05)，但仍明顯高于對照組(P<0.05)。見表2、圖2。

表1 各組大鼠胰腺組織評分比較(分)

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05

3.3 花椒毒酚對腦損傷相關(guān)指標(biāo)(含水量、神經(jīng)功能評分)的影響 模型組大鼠術(shù)后3、12 h腦組織含水量和神經(jīng)功能評分明顯高于對照組(P<0.05)；花椒毒酚低、高劑量組腦組織含水量和神經(jīng)功能較模型組明顯降低(P<0.05)，其中高劑量組腦組織含水量和神經(jīng)功能評分明顯低于低劑量組(P<0.05)。見表3。

3.4 花椒毒酚對血漿淀粉酶、NO、NF-κB p65的影響 模型組大鼠術(shù)后3、12 h血漿淀粉酶、NO、NF-κB p65均較對照組明顯升高(P<0.05)；花椒毒酚低、高劑量組血漿淀粉酶、NO、NF-κB p65水平均較模型組明顯下降(P<0.05)，且高劑量組各指標(biāo)下降幅度均高于低劑量組(P<0.05)。見圖3。

圖1 術(shù)后12 h各組胰腺組織病理改變(200×)

圖2 術(shù)后12 h各組腦組織病理改變(200×)

組別劑量只數(shù)腦組織含水量(%)3h12h神經(jīng)功能評分(分)3h12h正常對照組—870.21±0.3870.32±0.560.34±0.050.32±0.06模型組—875.23±1.02*77.96±1.19*2.21±0.32*2.63±0.31*花椒毒酚低劑量組5mg/kg873.81±0.55*#75.47±0.57*#1.62±0.21*#1.77±0.27*#花椒毒酚高劑量組10mg/kg872.30±0.61*#△73.63±0.52*#△1.13±0.17*#△1.28±0.20*#△

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；與低劑量組比較，△P<0.05

圖3 各組大鼠血漿淀粉酶、NO、NF-κB p65水平比較

3.5 花椒毒酚對腦組織NF-κB、iNOS蛋白水平的影響 各組模型組大鼠術(shù)后3、12 h腦組織NF-κB、iNOS相對表達(dá)量均明顯高于對照組(P<0.05)；花椒毒酚低、高劑量組大鼠腦組織NF-κB、iNOS相對表達(dá)量均較模型組明顯下降(P<0.05)，其中高劑量組大鼠腦組織NF-κB、iNOS相對表達(dá)量明顯低于低劑量組(P<0.05)。見圖4。

4 討論

目前，有關(guān)SAP所致腦損傷的具體機(jī)制尚未闡明，初步研究認(rèn)為胰腺損傷后會導(dǎo)致機(jī)體淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等活化，合成釋放一系列炎性因子和細(xì)胞因子,進(jìn)而對其他臟器造成繼發(fā)損傷[7]。NF-κB是一種在真核細(xì)胞中廣泛存在的核轉(zhuǎn)錄因子，屬于早期轉(zhuǎn)錄因子，在機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時(shí)無需新的蛋白翻譯即可進(jìn)行調(diào)控，其在正常生理狀態(tài)下以二聚體的形式與抑制因子IκB結(jié)合處于靜息狀態(tài)，激活后IκB磷酸化降解，NF-κB可進(jìn)入核內(nèi)與DNA上啟動子區(qū)域?qū)?yīng)位點(diǎn)結(jié)合，調(diào)控下游相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[8]。近年來大量研究表明，NF-κB在SAP疾病進(jìn)展中發(fā)揮重要作用，能夠誘導(dǎo)TNF-α、IL-6、IL-1β等炎性因子的高度表達(dá)，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的放大，進(jìn)而使SAP從局部炎性病變發(fā)展為全身多器官炎癥反應(yīng)，加重胰腺組織及胰腺外臟器的病理損傷[9]。袁偉燕等[10]研究顯示，NF-κB在SAP大鼠腦組織中的活性較其他組織高，除調(diào)控炎癥反應(yīng)外，與神經(jīng)元細(xì)胞的增殖凋亡亦具有密切關(guān)系，能夠通過刺激IL-1β、TNF-α等的表達(dá)促進(jìn)神經(jīng)元凋亡，加重腦損傷。黃良珍等[11]研究顯示，NF-κB在顱腦損傷大鼠腦組織中的含量明顯高于對照組，在損傷1 h后即開始升高，且其變化趨勢與顱腦損傷的臨床表現(xiàn)具有較強(qiáng)的一致性。本研究結(jié)果顯示，SAP大鼠血清及腦組織中NF-κB的表達(dá)量明顯高于正常對照組，且隨著時(shí)間延長，損傷程度逐漸加重，與上述結(jié)果一致，證明NF-κB參與SAP惡性循環(huán)且與腦損傷存在密切聯(lián)系。

圖4 各組大鼠腦組織NF-κB p65、iNOS水平比較

NO是一種存在于中樞神經(jīng)細(xì)胞的神經(jīng)遞質(zhì)，具有維持長時(shí)程增強(qiáng)腦部記憶功能的作用，但其過表達(dá)時(shí)會介導(dǎo)毒性機(jī)制，通過炎癥級聯(lián)反應(yīng)、氧化應(yīng)激等促進(jìn)神經(jīng)元凋亡壞死[12]。iNOS是NO合成的限速酶，正常狀態(tài)下，iNOS無表達(dá)或低表達(dá)，但在病理狀態(tài)下，iNOS作為NF-κB的下游靶基因，可被激活，進(jìn)而在機(jī)體內(nèi)大量合成，導(dǎo)致胞漿中NO含量升高，進(jìn)而產(chǎn)生大量自由基，對細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用[13]。目前，在腦損傷中針對NF-κB/iNOS通路的研究較多，但多集中于腦缺血再灌注所致腦損傷，而對SAP繼發(fā)腦損傷的研究較少[14]。方曉艷等[15]研究表明，腦缺血再灌注損傷大鼠神經(jīng)元胞漿、胞核中均存在NF-κB的陽性表達(dá)，且iNOS活力和NO水平均明顯升高，介導(dǎo)腦組織神經(jīng)損傷和神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。洪煥茂等[16]研究表明，高壓氧預(yù)處理能夠通過抑制NF-κB的活化，降低iNOS的基因轉(zhuǎn)錄，減少局灶性腦缺血的炎癥反應(yīng)，誘發(fā)相關(guān)保護(hù)機(jī)制。本研究初次對SAP大鼠腦損傷模型進(jìn)行探討，結(jié)果顯示，大鼠血漿NF-κB和NO水平均明顯升高，腦組織中NF-κB、iNOS的蛋白表達(dá)亦明顯升高，證明SAP能夠以腦組織中NF-κB的活化參與腦損傷病理過程。

花椒毒酚是一種從傘形科植物蛇床子及白芷中提取出的線型呋喃香豆素，相關(guān)藥理學(xué)研究表明，花椒毒酚具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗心律失常等多種生物學(xué)活性[17]。但目前針對花椒毒酚的藥理研究相對薄弱，且其發(fā)揮活性的具體機(jī)制尚待闡明，何蔚等[18]研究表明，花椒毒酚能夠通過抑制腦血管內(nèi)皮細(xì)胞中黏附因子(ICAM-1)的表達(dá)，減弱中性粒細(xì)胞黏附穿透血管內(nèi)皮，抑制腦組織炎癥反應(yīng)，進(jìn)而改善大鼠腦缺血后再灌注的神經(jīng)功能評分，減小梗死面積，初步提出花椒毒酚對腦損傷具有一定保護(hù)作用。本研究對SAP大鼠術(shù)后急性花椒毒酚腹腔給藥，結(jié)果顯示，花椒毒酚干預(yù)組大鼠胰腺組織和腦組織病變程度均較模型組有不同程度減輕，腦組織水腫程度和神經(jīng)功能評分亦有明顯改善，與何蔚等[19]研究觀點(diǎn)一致；同時(shí)觀察到花椒毒酚能夠下調(diào)大鼠腦組織中NF-κB、iNOS的表達(dá)，血清中NF-κB、NO水平亦明顯降低，其中高劑量組對各指標(biāo)的下調(diào)作用較低劑量組明顯，說明花椒毒素對SAP大鼠所致腦損傷亦具有保護(hù)作用。

綜上所述，花椒毒酚能夠減緩SAP大鼠胰腺組織和腦組織病理進(jìn)程，明顯改善腦組織水腫及神經(jīng)功能評分，其機(jī)制可能是通過抑制NF-κB的活化，進(jìn)而減少iNOS的合成，降低NO對神經(jīng)元細(xì)胞的毒性損傷，具體調(diào)控機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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