NRG-1對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡及氧化損傷的影響*

王 軍 范粉靈 張松林 王星燁 薛建穎

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院結(jié)構(gòu)性心臟病科，西安 710061)

急性心肌梗死是一種嚴(yán)重危害人類健康的常見(jiàn)心血管疾病，且近年在我國(guó)有增加趨勢(shì)。盡早恢復(fù)冠脈血流是急性心肌梗死救治的關(guān)鍵，目前靜脈溶栓術(shù)、冠狀動(dòng)脈介入治療是急性心肌梗死早期再灌注治療的有效手段[1]。但在心肌缺血后恢復(fù)血液流通也會(huì)導(dǎo)致心肌出現(xiàn)不可逆的損傷，稱為心肌缺血再灌注損傷[2]。心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生與氧化應(yīng)激、鈣超載、心肌細(xì)胞凋亡等有關(guān)，尋找有效的方法降低心肌缺血再灌注損傷是目前研究的重點(diǎn)[3]。神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(Neuregulin-1，NRG-1)屬于表皮生長(zhǎng)因子，在心臟發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮促進(jìn)作用[4]。NRG-1基因突變的小鼠心臟發(fā)育緩慢，并且在胚胎發(fā)育的第10天死亡[5]。有研究報(bào)道NRG-1在小鼠心力衰竭、心肌肥厚、糖尿病心肌病、心肌缺血再灌注等發(fā)病過(guò)程中均發(fā)揮調(diào)控作用[6-8]。本研究以缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞為研究對(duì)象，在體外用NRG-1蛋白處理細(xì)胞，探討NRG-1對(duì)缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡及氧化損傷的作用，以期為治療心肌缺血再灌注損傷提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 人心肌細(xì)胞系HCM購(gòu)自上海博谷生物細(xì)胞庫(kù)；NRG-1為西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院心內(nèi)實(shí)驗(yàn)室合成并保存；DMEM-F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶均為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；胎牛血清為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；黃嘌呤氧化法超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)活性檢測(cè)試劑盒為上海索萊寶生物科技有限公司產(chǎn)品；硫代巴比妥酸比色法丙二醛(Malonaldehyde，MDA)含量檢測(cè)試劑盒為北京百奧萊博公司產(chǎn)品；二硝基苯肼顯色法乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase，LDH)含量試劑盒為上海紀(jì)寧實(shí)業(yè)公司產(chǎn)品；活性氧簇(Reactive oxygen species，ROS)含量檢測(cè)試劑盒為上海翊圣公司產(chǎn)品；抗蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)多克隆抗體、抗磷酸化Akt(p-AktThr308)多克隆抗體、抗cleaved caspase-3多克隆抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗均為美國(guó)Abcam公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) HCM細(xì)胞用含有10%胎牛血清的DMEM-F12細(xì)胞培養(yǎng)液，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞融合度達(dá)到90%時(shí)，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，用0.125%的胰蛋白酶消化細(xì)胞后，1 000 r/min離心10 min，用細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)，根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求確定接種比例。

1.2.2細(xì)胞分組及處理 心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧模型的構(gòu)建參照文獻(xiàn)[9]。HCM細(xì)胞融合度超過(guò)60%時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為不含有胎牛血清的DMEM-F12培養(yǎng)液，放在95%N2、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h。將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為完全細(xì)胞培養(yǎng)液(含有胎牛血清)，放在95%空氣、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育6 h，即為缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞模型。HCM細(xì)胞分為Control組、H/R組、NRG-1組，H/R組、NRG-1組進(jìn)行缺氧復(fù)氧處理，NRG-1組細(xì)胞在缺氧處理前加入0.8 mg/L的NRG-1。Control組細(xì)胞不做處理。

1.2.3細(xì)胞活力檢測(cè) HCM細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期后，細(xì)胞接種到96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)液中含有的細(xì)胞個(gè)數(shù)為1×106個(gè)/ml，每孔接種100 μl細(xì)胞。分別按照1.2.2中處理Control組、H/R組、NRG-1組的細(xì)胞，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。缺氧處理后，在每孔中加入噻唑藍(lán)(Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT)溶液20 μl(5 g/L)。在37℃孵育反應(yīng)4 h。棄上清液，加入100 μl的二甲基亞砜溶液，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm每孔的吸光度(A)值。

1.2.4細(xì)胞凋亡檢測(cè) Control組、H/R組、NRG-1組的細(xì)胞按照1.2.2中方法處理后，收集各組細(xì)胞，加入磷酸鹽緩沖液(Phosphate buffered saline，PBS)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105個(gè)/ml。混合均勻后，取1 ml的細(xì)胞懸浮液，1 000 r/min離心10 min，去除上清，收集細(xì)胞，加入碘化丙啶(Propidium iodide，PI)和膜聯(lián)蛋白 V-FITC(Annexin V-FITC)各5 μl，充分混合，放在室溫環(huán)境下孵育反應(yīng)15 min。用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.2.5LDH水平檢測(cè)Control組、H/R組、NRG-1組細(xì)胞按照1.2.2中方法處理后，收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按照LDH含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)培養(yǎng)液上清中LDH水平，步驟參照LDH含量檢測(cè)試劑盒(二硝基苯肼顯色法)。

1.2.6ROS、MDA、SOD水平的檢測(cè)Control組、H/R組、NRG-1組的細(xì)胞按照1.2.2中方法處理后，收集各組細(xì)胞，按照ROS含量檢測(cè)試劑盒檢測(cè)ROS水平，步驟參照ROS含量檢測(cè)試劑盒(DCFH-DA法)。同時(shí)檢測(cè)MDA、SOD水平，步驟分別參照MDA含量檢測(cè)試劑盒(硫代巴比妥酸比色法)和SOD含量檢測(cè)試劑盒(黃嘌呤氧化法)。

1.2.7Western blot檢測(cè)Akt、p-Akt、cleaved caspa-se-3的蛋白水平Control組、H/R組、NRG-1組的細(xì)胞按照1.2.2中方法處理后，加入含有苯甲基磺酰氟(Phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)的裂解液，放在冰上裂解反應(yīng)30 min。12 000 r/min，4℃離心20 min，吸取蛋白上清液至EP管中。二喹啉甲酸(Bicinchoninic acid，BCA)蛋白定量試劑盒檢測(cè)提取的蛋白濃度。將蛋白樣品與2×loading buffer(2∶1)充分混合后，放在100 ℃煮沸5 min。蛋白凝膠上樣孔中每孔加入50 μl的變性蛋白樣品，80 V電壓電泳30 min 后，120 V電壓電泳至結(jié)束。蛋白凝膠在4℃，100 V電壓轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，用5%牛血清白蛋白封閉(37℃孵育90 min)后，依次與抗Akt、p-AktThr308、cleaved caspase-3的Ⅰ抗(800倍稀釋，4℃孵育過(guò)夜)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Ⅱ抗(1 000倍稀釋，37 ℃孵育90 min)結(jié)合后，轉(zhuǎn)移至暗室中，滴加顯色液，顯影，定影后，曝光，分析p-Akt/Akt水平和cleaved caspase-3/GAPDH水平。

2 結(jié)果

2.1NRG-1拮抗缺氧復(fù)氧對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用 結(jié)果見(jiàn)圖1和表1所示，Control組、H/R組、NRG-1組的細(xì)胞活力3組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，H/R組、NRG-1組細(xì)胞的A值均明顯低于Control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。NRG-1組細(xì)胞的A值明顯高于H/R組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2NRG-1抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡 結(jié)果見(jiàn)圖2和表2所示，Control組、H/R組、NRG-1組的細(xì)胞凋亡率經(jīng)單因素方差分析，3組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，H/R組、NRG-1組的細(xì)胞凋亡率均明顯高于Control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。NRG-1組的細(xì)胞凋亡率明顯低于H/R組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。Cleaved caspase-3/GAPDH的蛋白水平經(jīng)單因素方差分析，3組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，NRG-1組細(xì)胞cleaved caspase-3水平明顯高于Control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。NRG-1組細(xì)胞的cleaved caspase-3水平明顯低于H/R組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.3NRG-1降低缺氧復(fù)氧后的細(xì)胞培養(yǎng)液上清中LDH水平 結(jié)果見(jiàn)圖3和表3所示，Control組、H/R組、NRG-1組LDH水平經(jīng)單因素方差分析，3組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，H/R組、NRG-1組的LDH水平均明顯高于Control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。NRG-1組LDH水平明顯低于H/R組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

圖1 NRG-1對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響Fig.1 Effect of NRG-1 on viability of myocardial HCM cellsNote: Mean±SD.n=3.#.P<0.01 vs Control group;*.P<0.05 vs H/R group.

2.4NRG-1降低缺氧復(fù)氧后細(xì)胞中ROS水平 結(jié)果如圖4和表4所示，細(xì)胞中熒光強(qiáng)度越高，ROS水平越高。Control組、H/R組、NRG-1組熒光強(qiáng)度經(jīng)單因素方差分析，3組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，H/R組、NRG-1組ROS水平均明顯高于Control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。NRG-1組ROS水平明顯低于H/R組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.5NRG-1降低缺氧復(fù)氧后細(xì)胞中MDA水平，增加細(xì)胞中SOD水平 結(jié)果見(jiàn)圖5和表5所示，Control組、 H/R組、 NRG-1組的MDA水平和SOD水平經(jīng)單因素方差分析，3組間差異的比較均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。H/R組、NRG-1組的MDA水平均明顯高于Control組，而SOD水平均明顯低于Control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。NRG-1組的MDA水平明顯低于H/R組，而SOD水平明顯高于H/R組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

GroupsSampleCellviabilityControl30.66±0.05H/R30.36±0.031)NRG-130.47±0.041)2)F41.460

Note：1)P<0.01 vs Control；2)P<0.01 vs H/R.

圖2 NRG-1對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的影響Fig.2 Effect of NRG-1 on cardiomyocyte apoptosisNote: A. The images of flow cytometry for analyzing the apoptosis of cardiomyocytes;B.The apoptotic rate was quantitatively analyzed;C.The quantitative analysis of the protein levels of cleaved caspase-3.Mean±SD.n=3.#.P<0.01 vs Control group;*.P<0.01 vs H/R group.

2.6NRG-1增加缺氧復(fù)氧后細(xì)胞中p-AktThr308/Akt水平 結(jié)果見(jiàn)圖6和表6所示，Control組、H/R組、NRG-1組的p-AktThr308/Akt水平經(jīng)單因素方差分析，3組間比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=30.179，P<0.01)。H/R組、NRG-1組的p-AktThr308/Akt水平均組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

GroupsnApoptosisrate(%)CleavedCaspase-3/GAPDHControl34.62±0.970.25±0.02H/R329.07±3.431)0.49±0.031)NRG-1319.76±3.411)2)0.35±0.011)2)F56.32393.429

Note：1)P<0.01 vs Control；2)P<0.01 vs H/R.

圖3 NRG-1對(duì)LDH水平的影響Fig.3 Effect of NRG-1 on LDH levels in cardiomyocytesNote: Mean±SD.n=3.#.P<0.01 vs Control group;*.P<0.01vs H/R group.

GroupsnLDH(U/L)Control320.63±4.05H/R395.47±6.091)NRG-1344.28±5.041)2)F166.951

Note：1)P<0.01 vs Control；2)P<0.01 vs H/R.

明顯低于Control組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。NRG-1組的p-Akt/Akt水平明顯高于H/R

圖4 NRG-1對(duì)心肌細(xì)胞ROS水平的影響Fig.4 Effect of NRG-1 on ROS levels in cardiomyocytesNote: Mean±SD.n=3.#.P<0.01 vs Control group;*.P<0.01 vs H/R group.

GroupsnROSControl369.29±7.96H/R3280.84±20.521)NRG-13128.23±12.321)2)F168.616

Note：1)P<0.01 vs Control；2)P<0.01 vs H/R.

圖5 NRG-1對(duì)心肌細(xì)胞MDA、SOD水平的影響Fig.5 Effect of NRG-1 on MDA and SOD levels in cardiomyocytesNote: A.MDA level;B.SOD level.Mean±SD.n=3.#.P<0.01 vs Control group;*.P<0.05 vs H/R group.

GroupsSampleMDA(nmol/mg)SOD(U/ml)Control30.97±0.08187.85±12.58H/R32.29±0.191)124.39±8.751)NRG-131.47±0.131)2) 160.31±11.011)2)F67.29325.598

Note：1)P<0.01 vs Control；2)P<0.01 vs H/R.

GroupsSamplep-AktThr308/AktControl30.54±0.09H/R30.12±0.021)NRG-130.28±0.071)2)F30.179

Note：1)P<0.01 vs Control；2)P<0.01 vs H/R.

圖6 NRG-1對(duì)心肌細(xì)胞Akt、p-AktThr308蛋白水平的影響Fig.6 Effect of NRG-1 on protein levels of Akt and p-AktThr308 in cardiomyocytesNote: Mean±SD.n=3.#.P<0.01 vs Control group;*.P<0.05 vs H/R group.

3 討論

研究表明，心肌缺血后恢復(fù)血流通不僅不能及時(shí)恢復(fù)心臟正常功能，而且會(huì)加重心肌組織的損傷，引起心肌細(xì)胞凋亡，擴(kuò)大心肌梗死面積[10]。對(duì)于心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制研究較多，大致可以總結(jié)為：氧自由基生成過(guò)多、心肌細(xì)胞大量凋亡、鈣超載等，但是其具體的發(fā)病機(jī)制目前尚不十分清楚[11-15]。NRGs蛋白家族含有4個(gè)成員，這4個(gè)成員都含有表皮生長(zhǎng)因子結(jié)構(gòu)域、免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域，能夠特異性地激活酪氨酸激酶受體[16]。NRG-1是目前已經(jīng)證實(shí)的與心臟發(fā)育有關(guān)的NRGs蛋白家族成員，在胎兒心臟發(fā)育過(guò)程中由心內(nèi)膜內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生[17]。NRG-1能夠影響心肌細(xì)胞生長(zhǎng)和存活，調(diào)節(jié)肌節(jié)組織結(jié)構(gòu)發(fā)育[18]。Lemmens等[19]的研究表明，在心肌缺血再灌注后，冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠大量產(chǎn)生NRG-1從而減輕心肌缺血再灌注損傷。

心肌缺血再灌注損傷與心肌細(xì)胞凋亡發(fā)生有關(guān)。心肌組織缺血后，細(xì)胞內(nèi)的鈣離子大量聚集，同時(shí)缺血再灌注期間細(xì)胞內(nèi)會(huì)有ROS大量產(chǎn)生，這會(huì)引起細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生[20-24]。LDH是一種存在于細(xì)胞漿內(nèi)的蛋白酶，心肌缺血再灌注發(fā)生后，細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)過(guò)氧化生成MDA，而細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化后，細(xì)胞膜通透性發(fā)生改變，細(xì)胞內(nèi)LDH大量外泄，檢測(cè)細(xì)胞外LDH水平可以間接反映細(xì)胞膜的完整性及細(xì)胞氧化損傷程度[25]。SOD是細(xì)胞內(nèi)氧自由基的清除劑，具有維持細(xì)胞內(nèi)氧化平衡狀態(tài)的功能[26]。有研究表明，NRG-1重組蛋白可以減少心肌細(xì)胞凋亡[27]。本研究結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞活力下降，而NRG-1處理后心肌細(xì)胞凋亡率有所下降，細(xì)胞活力部分恢復(fù)。這提示，NRG-1能夠抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡。

Akt信號(hào)通路在心臟組織中廣泛表達(dá)，是NRG-1調(diào)控的下游信號(hào)通路之一，具有廣泛的生物學(xué)功能，與組織生長(zhǎng)、疾病發(fā)生等有關(guān)，棄激活后能夠抑制心肌細(xì)胞凋亡的發(fā)生，促進(jìn)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)[28]。有研究表明，Akt信號(hào)通路與細(xì)胞內(nèi)線粒體呼吸有關(guān)，參與細(xì)胞攝取葡萄糖過(guò)程，在NRG-1調(diào)控心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用[29]。之前的研究報(bào)道顯示，NRG-1可以通過(guò)調(diào)控Akt信號(hào)通路在體外降低衣霉素和二硫蘇糖醇作用后的心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白的表達(dá)水平，降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減少心肌細(xì)胞損傷，還可以在體內(nèi)減輕心肌缺血再灌注損傷，降低心臟的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[30]。本研究結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞缺氧復(fù)氧后細(xì)胞中p-AktThr308/Akt水平降低，而NRG-1處理后心肌細(xì)胞p-AktThr308/Akt水平升高，NRG-1通過(guò)影響Akt信號(hào)通路抑制缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果與之前的報(bào)道同時(shí)說(shuō)明了NRG-1在心肌缺血再灌注損傷中具有保護(hù)作用，并且NRG-1對(duì)心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用可能是多方面的，除了與心肌細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有關(guān)，還與心肌細(xì)胞凋亡和氧化損傷有關(guān)。綜上所述，NRG-1能夠部分逆轉(zhuǎn)缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡及氧化損傷，升高p-AktThr308/Akt表達(dá)水平。本研究為NRG-1治療心肌缺血再灌注損傷提供了理論基礎(chǔ)，為后續(xù)探討心肌缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。本研究存在一定的局限性，在以后的實(shí)驗(yàn)中會(huì)對(duì)NRG-1在心肌缺血再灌注損傷心肌細(xì)胞凋亡與Akt信號(hào)通路的相互作用進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證，同時(shí)會(huì)繼續(xù)探討心肌缺血再灌注損傷中NRG-1與其他相關(guān)信號(hào)通路的關(guān)系。

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