膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠18F-NaF micro-PET/CT和μCT評分與組織病理學(xué)的相關(guān)性分析

黃　禾，盧　葦，劉　勤，曾一飛，鄒同恩，陳　躍

(1.瀘州市人民醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州　646000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，四川 瀘州　646000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種以炎性細(xì)胞浸潤、滑膜增生、軟骨侵蝕及骨丟失為特征的慢性炎癥性疾病，患病率約0.32%～0.36%，2年致殘率約50%[1]。RA不僅可引起局部骨質(zhì)破壞，還可導(dǎo)致全身骨質(zhì)丟失，是骨質(zhì)疏松性骨折的獨(dú)立危險因素。RA患者骨質(zhì)疏松發(fā)生率較高，為健康對照人群的2倍[2]。RA初期可因關(guān)節(jié)腫脹、游走性疼痛而影響患者生活及工作，治療效果不佳者病情逐漸進(jìn)展，可因關(guān)節(jié)畸形、僵硬而喪失功能[3]。18F-NaF經(jīng)靜脈注射后立即分解為Na+和18F-，18F-大部分在血液中直接被紅細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)，僅較少與血漿白蛋白結(jié)合，18F-與骨組織無機(jī)鹽中二磷酸鹽的羥基發(fā)生離子交換，羥基磷灰石晶體由Ca10(PO4)6(OH)2轉(zhuǎn)化為Ca10(PO4)6F2。因而18F-NaF PET/CT可用于診斷引起骨質(zhì)改變的自身免疫性疾病，如RA[4]及其他良性骨質(zhì)病變[5]。本研究探討18F-NaF micro-PET/CT的最小標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(minimum standardized uptake value, SUVmin)、最大標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(maximum standardized uptake value, SUVmax)及平均標(biāo)準(zhǔn)化攝取值(mean standardized uptake value, SUVmean)與膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎(collagen induced arthritis, CIA)大鼠模型組織病理學(xué)的相關(guān)性，并與μCT評分與組織病理學(xué)的相關(guān)性進(jìn)行比較。

1　材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組健康清潔級雌性SD大鼠70只，8周齡，體質(zhì)量160～200 g，隨機(jī)分為模型組(n=50)、對照組(n=20)。模型組：將牛Ⅱ型膠原30 mg溶于15 ml 0.1 mol/L醋酸中，使膠原濃度為2 mg/ml，4℃過夜后取20 ml膠原溶液與15 ml完全弗氏佐劑制備成膠原乳劑；在距大鼠尾根部2～3 cm處皮下注射膠原乳劑，0.1 ml/只，初次注射7天后再次皮下注射等量膠原乳劑。對照組：采用已氟烷氣體麻醉(2%濃度，氧流量0.6 L/min)，麻醉成功后分別稱重，與模型組相同時間點(diǎn)皮下注射等體積的生理鹽水。2組均于造模后10天行micro-PET/CT檢查。實(shí)驗(yàn)過程均按動物研究倫理學(xué)要求進(jìn)行。

1.2 儀器與方法采用Siemens InveonTMmicro-PET/CT機(jī)；18F-NaF注射液由Siemens Eclipse HP/RD加速器生產(chǎn)；采用LABORLUX 11光學(xué)顯微鏡(Leica公司)。對2組均采用異氟烷氣體維持麻醉，行俯臥位足先進(jìn)掃描。經(jīng)尾靜脈注射18F-NaF，劑量0.1 mCi/kg體質(zhì)量。PET模塊視野中心的橫向、縱向和軸向分辨力為1.5 mm，采集時間窗3.4 ns、能窗350～650 keV，采集時間10 min，在注射顯像劑后50 min開始采集，重建方法為FBP。PET/CT檢查后，處死實(shí)驗(yàn)鼠，對左、右踝關(guān)節(jié)行μCT掃描，電壓80 kV，電流500 μA，曝光時間1 000 ms，像素3 072×2 048。

1.3 圖像分析采用Siemens Inveon Acquisition Workplace圖像采集軟件和ASI Pro VM圖像分析軟件。PET值區(qū)間均為1.8～9.9，CT窗寬-500～1 900 HU。由2名住院醫(yī)師及1名主治醫(yī)師觀察踝關(guān)節(jié)放射性同位素的攝取情況(圖1)并勾畫ROI(體積2 mm3)，計算SUVmin、SUVmax及SUVmean。

μCT評分采用Pfeil等[6]評分標(biāo)準(zhǔn)：0分為正常；1分為輕度異常，1處或多處關(guān)節(jié)周圍軟組織腫脹，骨質(zhì)疏松和輕微關(guān)節(jié)間隙狹窄；2分為明確的早期異常，包括明顯骨質(zhì)侵蝕改變有或無關(guān)節(jié)間隙狹窄；3分為中度關(guān)節(jié)破壞，關(guān)節(jié)間隙狹窄≤正常50%；4分為重度關(guān)節(jié)破壞，關(guān)節(jié)間隙狹窄>正常50%，但未消失；5分為多個異常,關(guān)節(jié)間隙消失。由2名放射科主治醫(yī)師及1名主任醫(yī)師觀察圖像，軟組織窗寬-1 000～4.8 HU，骨窗窗寬2 000～12 000 HU(圖2、3)，進(jìn)行踝關(guān)節(jié)μCT評分，并取均值。

1.4 病理學(xué)分析μCT掃描后，分離左、右踝關(guān)節(jié)表皮，固定、脫鈣、沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、HE染色。對每個踝關(guān)節(jié)獲取3張組織切片，每張切片由3名病理學(xué)醫(yī)師評分(表1)，取平均值。根據(jù)踝關(guān)節(jié)組織病理形態(tài)學(xué)，評價踝關(guān)節(jié)細(xì)胞滲出、軟骨破壞及骨侵蝕程度[7]。

表1　CIA大鼠踝關(guān)節(jié)炎細(xì)胞滲出、軟骨破壞及骨侵蝕程度評分標(biāo)準(zhǔn)

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析軟件，計量資料以±s表示，2組實(shí)驗(yàn)鼠體質(zhì)量、SUVmin、SUVmax及SUVmean、μCT評分均符合正態(tài)分布，采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)比較。采用Pearson相關(guān)性分析評價模型組μCT評分和各SUV值與組織病理學(xué)評分的相關(guān)性，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

造模前2組大鼠體質(zhì)量增長速度正常，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(t=0.90，P=0.37)，造模成功后部分出現(xiàn)不同程度攝食及活動減少、體質(zhì)量減輕、毛發(fā)枯燥、反應(yīng)遲鈍，2組大鼠體質(zhì)量差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=12.44，P<0.01)。

2.118F-NaF PET/CT各指標(biāo)、μCT評分及病理評分比較模型組SUVmin、SUVmean、SUVmax、μCT評分及病理評分均高于對照組(P均<0.01)，見表2。

2.2 病理學(xué)表現(xiàn)對照組踝關(guān)節(jié)面完整，無水腫及充血，滑膜無增生，踝關(guān)節(jié)表面被覆薄層透明軟骨，排列整齊、表面光滑，關(guān)節(jié)囊由結(jié)締組織組成，表面有完整的滑膜細(xì)胞，骨組織無破壞，結(jié)構(gòu)完整(圖4A、4B)；模型組病理示46只大鼠出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎改變，發(fā)病率為92.00%(46/50)；發(fā)病踝關(guān)節(jié)區(qū)滑膜細(xì)胞有輕、中至重度增生、變性或壞死；滑膜組織內(nèi)有輕、中至重度的纖維組織增生和炎細(xì)胞滲出，踝關(guān)節(jié)軟骨面塌陷、髓腔消失，代以大量的纖維結(jié)締組織及肉芽組織，骨和軟骨受到不同程度破壞(圖4C、4D)。

表2　2組大鼠SUVmin、SUVmean、SUVmax和μCT評分比較(±s)

表2　2組大鼠SUVmin、SUVmean、SUVmax和μCT評分比較(±s)

組別SUVminSUVmaxSUVmeanμCT評分組織病理學(xué)評分模型組(n=50)4．53±0．166．13±0．285．15±0．170．50±0．051．18±0．07對照組(n=20)2．81±0．273．54±0．233．21±0．1300t值9．8311．7210．145．3710．34P值<0．001<0．001<0．001<0．001<0．001

圖1　注射18F-NaF 50 min后行大鼠micro-PET/CT顯像　A.對照組正常圖像； B.模型組踝關(guān)節(jié)骨代謝增高； C.模型組踝關(guān)節(jié)及跗骨骨代謝增高； D、E.模型組踝關(guān)節(jié)、跗骨及跖趾關(guān)節(jié)骨代謝不同程度增高

圖2　大鼠μCT圖像，軟組織窗　A.對照組正常圖像； B～D.模型組軸位、冠狀位及矢狀位圖像，表現(xiàn)為左后肢明顯軟組織腫脹　　圖3　大鼠 μCT 骨窗　A～C.分別為對照組軸位、冠狀位及矢狀位的正常圖像； D～F.分別為模型組軸位、冠狀位及矢狀位圖像，表現(xiàn)為骨密度稍降低，骨關(guān)節(jié)面毛糙

圖4　病理圖　A、B.對照組(A.HE，×100；B.HE，×400)； C、D.模型組(C.HE，×100；D.HE，×400)

圖5　SUVmin(A)、SUVmean(B)、SUVmax(C)值及μCT評分(D)與組織病理學(xué)評分相關(guān)性分析散點(diǎn)圖

2.3 相關(guān)性分析18F-NaF PET/CT的SUVmin、SUVmax、SUVmean、μCT評分與組織病理學(xué)評分均呈正相關(guān)(r=0.920、0.943、0.923、0.768，P均<0.001)，見圖5。

3　討論

已有大量研究[8-10]采用18F-NaF作為放射性示蹤劑檢測原發(fā)性骨腫瘤及成骨性、溶骨性或混合性骨骼轉(zhuǎn)移，將18F-NaF用于骨良性疾病如隱匿性骨折、骶髂關(guān)節(jié)炎、青少年退變等的報道[11]也日漸增多。因PET/CT高空間分辨率、高靈敏度及三維層析圖像重建技術(shù)，被廣泛應(yīng)用于臨床。本研究采用18F-NaF PET/CT評估膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎大鼠關(guān)節(jié)的病理骨代謝征象。

放射性同位素顯像是評估局部骨代謝和全身半定量、定量分析最適用的成像模式之一。與用于骨成像的其他放射性藥物(如99Tcm)相比，18F-NaF對骨具有高親和力并有良好的骨動力學(xué)效應(yīng)，在靜脈注射60 min后，僅10%的劑量留于血液循環(huán)，因此，18F-NaF被快速骨吸收和快速血漿清除的同時可產(chǎn)生較高的骨與背景比值，且18F-NaF不在炎性軟組織中累積，僅最低限度地與血清蛋白結(jié)合[12]；此外，18F-NaF PET/CT在測量骨疾病的動物模型中具有極好的重現(xiàn)性。研究[13-14]表明99Tcm-MDP或其他99Tcm-二磷酸鹽骨顯像劑對骨的親和力明顯不及18F-NaF，且骨外攝取時有發(fā)生。

RA骨和軟骨的侵蝕、修復(fù)過程與血流量密切相關(guān)，在不同階段炎癥部位骨面積和礦物質(zhì)結(jié)合能力也相應(yīng)變化。因此，通過血流量增加并提高礦物質(zhì)結(jié)合能力可導(dǎo)致關(guān)節(jié)炎關(guān)節(jié)中的18F-NaF被特異性吸收增加，使18F-NaF micro-PET/CT能可視化評估疾病嚴(yán)重程度，且能非侵入性量化病理性骨代謝。18F-NaF PET/CT的SUV值與骨代謝的標(biāo)記物具有良好的相關(guān)性，通過測量18F-NaF在骨骼礦物質(zhì)中的凈吸收(Ki)，結(jié)果顯示Ki和SUV有顯著的相關(guān)性[15]。

Ingo等[16]研究表明，在造模成功后14天大鼠出現(xiàn)急性期改變，28天后逐步轉(zhuǎn)入慢性期，本實(shí)驗(yàn)選取造模成功后10天大鼠，病理示46只大鼠出現(xiàn)早期關(guān)節(jié)炎病理改變，μCT掃描曝光時間1 000 ms，像素為3 072×2 048，遠(yuǎn)高于常規(guī)CT,可清晰顯示骨小梁結(jié)構(gòu)，RA輕微骨質(zhì)破壞即可顯示。本研究發(fā)現(xiàn)18F-NaF Micro-PET/CT顯像與RA組織病理學(xué)改變有較高的相關(guān)性，且呈正相關(guān)，SUVmin、SUVmax及SUVmean均隨著組織病理學(xué)評分的增高而增高，且相關(guān)系數(shù)高于μCT，表明18F-NaF Micro-PET/CT可用于定量分析CIA大鼠骨破壞，且優(yōu)于μCT評分。

綜上所述，18F-NaF Micro-PET/CT能可靠定量評價CIA大鼠模型骨侵蝕和骨畸形，優(yōu)于μCT評分。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Wu H, Wang K, Wang H, et al. Novel self-assembled tacrolimus nanoparticles cross-linking thermosensitivehydrogels for local rheumatoid arthritis therapy. Colloids Surf B Biointerfaces, 2017,14(9):97-104.

[2]張江林.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的骨質(zhì)疏松研究進(jìn)展.中華風(fēng)濕病學(xué)雜志,2005,9(8):503-505.

[3]Ikeda K, Sanayama Y, Nakagomi D, et al. Evaluation of joint damage with conventional radiograph and synovitis with musculoskeletal ultrasonography in rheumatoid arthritis. Nihon Rinsho, 2013,71(7):1185-1192.

[4]Kim Y, Lee HY, Yoon HJ, et al. Utility of18F-fluorodeoxy glucose and18F-sodium fluoride positron emission tomography/computed tomography in the diagnosis of medication-related osteonecrosis of the jaw: A preclinical study in a rat model. J Craniomaxillofac Surg, 2016,44(4):357-363.

[5]Raynor W, Houshmand S, Gholami S, et al. Evolving role of molecular imaging with (18)F-sodium fluoride PET as a biomarker for calcium metabolism. Curr Osteoporos Rep, 2016,14(4):115-125.

[6]Pfeil A, Haugeberg G, Renz DM, et al. Digital X-ray radiogrammetry and its sensitivity and specificity for the identification of rheumatoid arthritis-related cortical hand bone loss. J Bone Miner Metab, 2016,77(18):1207-1216.

[7]Hildebrandt G, Jahns J, Hindemith M, et al. Effects of low dose radiation therapy on adjuvant induced arthritis in rats. Int J Radiat Biol, 2000,76(8):1143-1153.

[8]Frost ML, Blake GM, Park-Holohan SJ, et al. Long-term precision of18F-fluoride PET skeletal kinetic studies in the assessment of bone metabolism. J Nucl Med, 2008,49(5):700-707.

[9]Hsu WK, Virk MS, Feeley BT, et al. Characterization of osteolytic, osteoblastic, and mixed lesions in a prostate cancer mouse model using18F-FDG and18F-fluoride PET/CT. J Nucl Med, 2008,49(3):414-421.

[10]Grant FD, Fahey FH, Packard AB, et al. Skeletal PET with18F-fluoride: Applying new technology to an old tracer. J Nucl Med, 2008,49(1):68-78.

[11]黃禾,陳躍.18F-NaF PET/CT在骨良性病變中的臨床應(yīng)用于研究進(jìn)展.中國醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2016,32(3):457-460.

[12]Even-Sapir E, Metser U, Mishani E, et al. The detection of bone metastases in patients with high-risk prostate cancer:99mTc-MDP Planar bone scintigraphy, single-and multi-field-of-view SPECT,18F-fluoride PET, and18F-fluoride PET/CT. J Nucl Med, 2006,47(2):287-297.

[13]Assaf AT, Zrnc TA, Remus CC, et al. Intraindividual comparison of preoperative (99m)Tc-MDP SPECT/CT and intraoperative and histopathological findings in patients with bisphosphonate-or denosumab-related osteonecrosis of the jaw. J Craniomaxillofac Surg, 2015,43(8):1461-1469.

[14]Huang H, Chen Y. Recurrent alveolar soft part sarcoma on bone scintigraphy. Clin Nucl Med, 2016,41(3):251-252.

[15]Ng SF, Tan LS, Buang F. Transdermal anti-inflammatory activity of bilayer film containing olive compound hydroxytyrosol: Physical assessment, in vivo dermal safety and efficacy study in Freund's adjuvant-induced arthritic rat model. Drug Dev Ind Pharm, 2017,43(1):108-119.

[16]Ingo M, Peter G, Bianca H, et al.18F-Fluoride positron emission tomography/computed tomography for noninvasive in vivo quantification of pathophysiological bone metabolism in experimental murine arthritis. Arthr Res Ther, 2014,16(4):2-9.