一例RhD－－缺失型患者的血清學(xué)及分子生物學(xué)分析?

水波 侯治兵△ 姚麗 嚴(yán)威 何繼武

(1.襄陽市中心血站,湖北 襄陽 441021,2.湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽市第一人民醫(yī)院輸血科)

在臨床輸血領(lǐng)域,人類紅細(xì)胞抗原的表達(dá)和血清中意外抗體的產(chǎn)生都對(duì)輸血安全產(chǎn)生了較大的影響。除ABO 血型系統(tǒng)中的抗原外,免疫原性最強(qiáng)的要數(shù)Rh 血型系統(tǒng)的C、c、D、E、e 抗原,臨床檢測出的大部分不規(guī)則抗體來源于Rh 血型系統(tǒng)。近年來,Rh 血型系統(tǒng)的研究取得了突破性的進(jìn)展,從血型血清學(xué)到分子生物學(xué),積累了大量的經(jīng)驗(yàn),并收集了大量研究資料。但Rh 血型系統(tǒng)較為復(fù)雜,各種RHCE和RHAG的基因突變及其臨床意義還有待進(jìn)行進(jìn)一步研究。我們發(fā)現(xiàn)了1 例RhD 陽性,C、c、E、e 抗原表達(dá)缺失(RHD－－)的患者,現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 患者,女,因三胎足月待產(chǎn)入院,預(yù)行剖宮產(chǎn),手術(shù)備血,輸血前血清學(xué)檢測發(fā)現(xiàn)存在意外抗體,送入本站。既往于2006 年順產(chǎn)一子,健存,2020 年8 月因“孕32周、胎盤早剝、死胎”行剖宮取胎術(shù),術(shù)中輸注去白細(xì)胞懸浮紅細(xì)胞6 U,冷沉淀凝血因子1.75 U,病毒滅活冰凍血漿400 mL,余無特殊。本研究經(jīng)襄陽市第一人民醫(yī)院倫理審查委員會(huì)倫理審查(2023KYWT02)。

1.2 儀器與試劑 儀器:離心機(jī)(KA2200,日本久保田)、離心機(jī)(Baso2020-2,江蘇貝索)、電恒溫水浴箱(H.SWX.600BS,上海新苗)、基因擴(kuò)增儀(9700,ABI)、測序儀(3130,ABI)。試劑:抗-A、B 標(biāo)準(zhǔn)血清(長春博德,批號(hào):20220906)、ABO 紅細(xì)胞(批號(hào):20235308)、多特異性抗人球蛋白(批號(hào):20225001)、譜細(xì)胞(批號(hào):20230318)、抗-D 標(biāo)準(zhǔn)血清(Baso,批號(hào):V237948),IgM 抗-C 標(biāo)準(zhǔn)血清(批號(hào):20223002)、IgM抗-c 標(biāo)準(zhǔn)血清(批號(hào):20223102)、IgM 抗-E 標(biāo)準(zhǔn)血清(批號(hào):20223203)、IgM 抗-e 標(biāo)準(zhǔn)血清(批號(hào):20223302)均為上海血液生物試劑。RHCE 血型基因分型檢測試劑盒(江蘇偉禾生物,批號(hào):202207E)、RHAG 血型基因檢測試劑盒(江蘇偉禾生物,批號(hào):202303G)。

1.3 方法 ABO 正反定型及RhD 定型試驗(yàn)按照?全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程?進(jìn)行,Rh 分型試驗(yàn)按照標(biāo)準(zhǔn)血清說明書進(jìn)行,不規(guī)則抗體鑒定采用間接抗人球蛋白法,具體操作按多特異性抗人球蛋白檢測試劑盒進(jìn)行,分子生物學(xué)試驗(yàn)采用PCR-SBT 法進(jìn)行檢測,檢測依據(jù)人類RHCE血型基因分型檢測試劑盒及RHAG血型基因分型檢測試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 血清學(xué)試驗(yàn) 患者為O 型,RhD 陽性,C、c、E、e 抗原均陰性,由于實(shí)驗(yàn)室無C、c、E、e 抗原的確認(rèn)試劑,未進(jìn)行吸收放散試驗(yàn)。不規(guī)則抗體鑒定10 譜細(xì)胞均為陽性,新生兒Rh表現(xiàn)型為CCDee。

2.2RHCE基因測序 經(jīng)與參考序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),第1 外顯子的48 位堿基由G 變?yōu)镃(c.48G>C),第2 外顯子的150 位堿基由C 變?yōu)門(c.150C>T)、178 位堿基由C 變?yōu)锳(c.178C>A)、201 位堿基由A 變?yōu)镚(c.201A>G)、203 位堿基由A 變?yōu)镚(c.201A>G)、307 堿基由C 變?yōu)門(c.307C>T),第5 外顯子的676 位表現(xiàn)為G?；颊逺HCE基因型為RHCE?02/RHCE?02,即紅細(xì)胞抗原表現(xiàn)型應(yīng)為CCDee。見圖1。

2.3RHAG基因測序 經(jīng)與參考序列比對(duì)發(fā)現(xiàn),第6 外顯子的808 位堿基由G 變?yōu)锳(c.808G>A)、861 位堿基由G 變?yōu)锳(c.861G>A)。見圖2。

圖2 RHAG 外顯子測序結(jié)果圖

3 討論

Rh 血型系統(tǒng)是除ABO 血型系統(tǒng)外,抗原性最強(qiáng)、且最具多態(tài)性的血型系統(tǒng)[1]。在輸血領(lǐng)域,ABO 血型同型輸注后,Rh 血型系統(tǒng)引起的輸血不良反應(yīng)占主導(dǎo)地位。Rh 血型抗原基因包括RHD和RHCE,二者是緊密連鎖、高度同源的基因,其同源性高達(dá)96%～97%[2]。廣泛的單核苷酸多態(tài)性和遺傳重組,從而導(dǎo)致變異性Rh 抗原的產(chǎn)生[3]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展,Rh 抗原表達(dá)的多態(tài)性得到進(jìn)一步的解釋,上百種變異性血型抗原得以發(fā)現(xiàn)。研究發(fā)現(xiàn),Rh 血型抗原的表達(dá)不僅受RHD/CE基因的控制,同時(shí)受調(diào)節(jié)RHAG基因的影響,當(dāng)RHAG基因發(fā)生突變,則可能導(dǎo)致RHAG基因表達(dá)的調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)發(fā)生變化,RHAG基因不能正常表達(dá),造成RHD/CE 蛋白不能正常穿膜,導(dǎo)致RH 血型抗原無法激活,從而使血型抗原無法表達(dá)于紅細(xì)胞表面[4-5]。

RhD 缺失型,即紅細(xì)胞上的C、c、E、e 4 種抗原均不表達(dá),但D 抗原正常表達(dá)或過量表達(dá),是極為罕見的變異型。研究發(fā)現(xiàn),RHD 缺失型產(chǎn)生的原因分2 種,一是RHCE基因變異導(dǎo)致的抗原無法正常表達(dá),二是抗原正常表達(dá)但RHAG基因突變導(dǎo)致抗原不具有活性[6]。RHAG 與RHD/CE 雖然屬于不同的血型系統(tǒng),但兩者密切相關(guān)[7-8]。本文中的患者有3 次孕產(chǎn)史,并在第2 次懷孕32 周發(fā)生胎停,行剖宮產(chǎn)手術(shù)過程中發(fā)生大出血,有輸血搶救史。本次懷孕足月待產(chǎn),預(yù)行剖宮產(chǎn)術(shù),在術(shù)前輸血相容性檢測過程中發(fā)現(xiàn)其表現(xiàn)型為RHD－－(實(shí)驗(yàn)室條件受限,無法進(jìn)行C、c、E、e4 中抗原的確認(rèn)試驗(yàn)),且血漿中存在不規(guī)則抗體,該抗體與10 個(gè)譜細(xì)胞均發(fā)生凝集反應(yīng)。遂行基因檢測,發(fā)現(xiàn)該患者RHCE基因型為RHCE?02/RHCE?02,即紅細(xì)胞抗原表現(xiàn)型應(yīng)為CCDee。但該患者抗原缺失,于是懷疑可能存在調(diào)節(jié)基因RHAG的突變。經(jīng)DNA 測序發(fā)現(xiàn)在RHAG基因第6 外顯子的808 位點(diǎn)和861 號(hào)位點(diǎn)存在G>A 的突變(其中861 號(hào)位點(diǎn)G>A 的突變,ISBT 庫暫未公布其相關(guān)信息,可能為1 個(gè)新突變位點(diǎn)),據(jù)此懷疑該患者RHCE 抗原缺失與RHAG基因6號(hào)外顯子2 個(gè)位點(diǎn)的點(diǎn)突變相關(guān),即抗原正常表達(dá)但不具有抗原活性?；颊逺hD 抗原正常檢測,是否因位點(diǎn)突變不影響其表達(dá)或?qū)Ρ磉_(dá)的影響不足以影響血清學(xué)試驗(yàn),還有待進(jìn)一步考證?；颊哐獫{中檢測出的抗體與抗原C、c、E、e 均發(fā)生凝集反應(yīng),但是否為抗-Hro 還有待進(jìn)一步考證。

Rh 血型系統(tǒng)的復(fù)雜性和在輸血領(lǐng)域的重要性,應(yīng)引起重視。有報(bào)道[9-10]稱,RHAG基因沉默導(dǎo)致Rh 抗原不表達(dá),稱為Rhnull 型,RHAG基因弱表達(dá),則Rh 抗原弱表達(dá),稱為Rhmod 型。該患者RhD 抗原表達(dá)正常,只有RHCE 抗原缺失,應(yīng)屬于Rhmod 型。RhD－－表現(xiàn)型雖然極為罕見,但其引起的輸血困難不可小覷。由于紅細(xì)胞膜表面抗原的缺失,在接受輸血、妊娠等免疫后,可產(chǎn)生多種不規(guī)則抗體,且該抗體僅與RhD－－、Rhnull 和Rhmod 不發(fā)生溶血性輸血反應(yīng)[11],很難找到與之配合的血液。妊娠則會(huì)導(dǎo)致胎兒新生兒溶血病,嚴(yán)重的可能導(dǎo)致死胎[12]。該患者在第2 次懷孕時(shí)就出現(xiàn)了胎停。臨床治療過程中,血液制劑目前無可替代品,在大出血緊急搶救中起著極為重要的作用。為了保護(hù)用血患者的安全,做好輸血前相容性檢測,不漏檢抗體和(或)抗原,同時(shí)聯(lián)合分子生物學(xué)技術(shù),正確鑒定患者的血型。輸血后進(jìn)行不規(guī)則抗體篩查,以便及時(shí)預(yù)防和監(jiān)測溶血反應(yīng)的發(fā)生[13]。

綜上所述,建議針對(duì)該類患者:1)未產(chǎn)生不規(guī)則抗體的患者,減少不必要抗原免疫性刺激,減少免疫性抗體產(chǎn)生,有助于保障臨床用血的安全。2)不規(guī)則抗體篩查能有效篩查出患者血液中的不規(guī)則抗體,從而減少或避免各種溶血性輸血反應(yīng)的發(fā)生,提高臨床輸血的安全性[14],做好檢測,已產(chǎn)生不規(guī)則抗體存在的患者,能不輸血?jiǎng)t不輸,擇期手術(shù)備血的患者可采用自體輸血的方式,滿足其手術(shù)中需要的用血,緊急輸血的患者,可以先利用血漿置換術(shù)減少患者體內(nèi)的抗體滴度后,再輸注紅細(xì)胞類血液制劑。3)對(duì)妊娠期婦女規(guī)范開展不規(guī)則抗體檢測及管理,可在孕產(chǎn)婦輸血、宮內(nèi)輸血或新生兒換血時(shí)予以特殊指導(dǎo)[15]。

利益沖突:所有作者均聲明不存在利益沖突。