核酸適體傳感法檢測中藥材中黃曲霉毒素B1

曾云龍， 程圓昕， 易守軍， 張 敏， 何 盼， 趙 敏， 唐春然

(1. 湖南科技大學化學化工學院 理論有機和功能分子教育部重點實驗室， 湖南 湘潭 411201；2. 湖南科技大學 材料科學與工程學院， 湖南 湘潭 411201)

1 引 言

中藥是中國醫(yī)藥學的瑰寶，是中醫(yī)治療疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)，對人類的文明和進步做出了偉大貢獻。世界衛(wèi)生組織調(diào)查顯示：世界范圍內(nèi)約70%～80%的人口在一級疾病治療中使用過傳統(tǒng)藥物，其中主要是中草藥[1]。由于西藥顯示出各種副作用，以及中藥對疾病尤其是重大疾病如癌癥以及重度燒燙傷等均能顯示出高的療效，歐美等發(fā)達國家開始使用植物藥，從而引發(fā)植物藥中藥材在國際市場的持續(xù)升溫。真菌毒素是某些真菌的代謝物，具有強毒性，尤其是黃曲霉毒素。黃曲霉毒素對中藥材污染很普遍[2-5]，但中藥材中微量黃曲霉毒素一般不表現(xiàn)出急性毒性，然而它們在人體內(nèi)有較強的蓄積性，具有致癌、致畸、致突變、肝毒性等。黃曲霉毒素B1(AFB1)是目前已知最強的化學致癌物，其潛在危害巨大，嚴重影響中藥的安全性。為了保證藥用安全，中藥材中AFB1為必檢項目。歐州藥典規(guī)定草藥中AFB1限量為2 μg/kg，韓國藥典規(guī)定為10 μg/kg，中國藥典為5 μg/kg。

目前，黃曲霉毒素檢測方法主要有色譜法和酶聯(lián)免疫法等[6-9]。酶聯(lián)免疫法靈敏、選擇性高，但所用抗原/抗體和酶的價格高，且易失活而失效；薄層色譜掃描法存在不夠靈敏、重現(xiàn)性低、操作繁瑣以及有機溶劑耗量大的缺點；色譜法及色-質(zhì)聯(lián)用法技術(shù)要求高、所需試劑純度高、儀器設(shè)備昂貴、分析成本高，不易普及。因此，非常有必要發(fā)展簡單、快速、靈敏、準確的中藥材黃曲霉毒素檢測方法。核酸適體具有特異性高、穩(wěn)定、價格低的顯著優(yōu)勢。近年來，基于核酸適體的生物傳感法[10-11]廣泛用于環(huán)境監(jiān)測、疾病診斷和食品中毒物殘留分析，然而，用于檢測中藥(材)中痕量真菌毒素殘留的報道較少。CdTe量子點優(yōu)異的光學特性使其廣泛應用于化學生物傳感[12-14]。本文擬利用核酸適體對黃曲霉毒素B1呈現(xiàn)的高特異性，以CdTe量子點為熒光探針，建立幾種中藥材中黃曲霉毒素B1的簡單、快速、靈敏的核酸適體傳感檢測新方法。

2 實 驗

2.1 主要試劑與儀器

巰基修飾的AFB1核酸適體(Apt)：HS-5′-AAAAAAGTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCT-CGTGCCCTTCGCTAGGCCCACA-3′[11]由生工生物工程(上海)股份有限公司提供，黃曲霉毒素B1(AFB1)、黃曲霉毒素B2(AFB2)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(DON)、伏馬毒素B1(FB1)、赭曲霉毒素A(OTA)、玉米赤霉烯酮(ZEN)(北京華安麥科生物技術(shù)有限公司)，氯化鎘、硼氫化鈉、半胱胺鹽酸鹽、氯金酸、檸檬酸鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鉀、三(2-羧基乙基)膦鹽酸鹽(TCEP)、TeO2等均為分析純(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，其他試劑均為分析純。實驗用水為二次蒸餾水。

RF-5301PC熒光分光光度計(日本島津公司)；TG16B臺式高速離心機(湖南凱達科學儀器有限公司)；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；78-1磁力加熱攪拌器(金壇市雙捷實驗儀器廠)。

2.2 實驗方法

2.2.1 CdTe量子點的制備

CdTe量子點的制備參照文獻[15]方法并稍做改進。取1.92 mmol CdCl2和5.76 mmol半胱胺鹽酸鹽置于250 mL圓底燒瓶中，在磁力攪拌下用160 mL二次蒸餾水溶解，調(diào)節(jié)pH=6.0，得到Cd前體溶液；再取0.96 mmol二氧化碲于20 mL二次水中，并向其中加入7.68 mmol的硼氫化鈉，磁力攪拌下置于60 ℃的水浴中避光反應1 h，得紫色透明的Te前體溶液；將剛制備的Te前體溶液加入到Cd前體溶液中并在室溫下攪拌反應2 h，然后迅速轉(zhuǎn)移至100 ℃水浴中回流反應3 h，得到192 mL紅色透明的半胱胺(巰基乙胺)修飾的CdTe量子點(CdTe QDs)。CdTe QDs的濃度為5 mmol/L(按Te量計)，避光保存。臨用時，先對CdTe QDs純化。以乙醇將CdTe QDs沉降，離心分離，棄去離心液；沉淀用50%乙醇溶液洗滌，離心分離，棄去離心液，如此處理3次后，超聲分散到二次水中即得到純化的巰基乙胺修飾的CdTe QDs，避光保存，備用。

2.2.2 金納米粒子的制備

金納米粒子按文獻[16]方法以檸檬酸鈉還原氯金酸制備。取250 mL 0.1 mmol HAuCl4溶液置于潔凈的燒杯中，在劇烈攪拌下加熱至沸騰，然后迅速加入5 mL 38.8 mmol 檸檬酸鈉，溶液顏色由淺黃變?yōu)榫萍t色，繼續(xù)反應30 min后冷卻至室溫。AuNPs 的濃度按文獻[17]方法測定為2.7 nmol/L。

2.2.3 金納米粒子表面修飾核酸適體

依據(jù)文獻[18]方法，以巰基修飾的核酸適體對金納米粒子進行表面修飾。先將巰基AFB1核酸適體用 10 mmol/L TCEP(Apt∶TCEP=1∶5) 活化1 h，然后將活化的Apt與2.6 nmol/L AuNPs 混合，再加入500 mmol/L pH 3.0 酒石酸-HCl 緩沖溶液，在室溫下輕搖孵化30 min，轉(zhuǎn)至10 000 r/min離心25 min除去未修飾到金納米粒子表面的Apt，再用pH 為7.0的10 mmol/L 磷酸鹽緩沖溶液(PBS)沖洗，如此3次，得到Apt修飾的金納米粒子(AuNPs/ Apt)，將其分散至水中，4 ℃下儲存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.4 AFB1分析程序

巰基乙胺修飾的CdTe QDs 2 mmol/mL 與AuNPs/Apt在10 mmol/L PBS(pH 7.2)溶液中混合反應10 min,離心除去過量的CdTe量子點，得到AuNPs/Apt/CdTe QDs復合物。測定體系熒光強度；然后，向AuNPs/Apt/CdTe QDs復合物體系中加入不同濃度的AFB1(0～2.0 ng/mL)，混勻，測定體系的熒光光譜。并按同樣的方法，向AuNPs/Apt/CdTe QDs復合物中加入其他真菌毒素(AFB2、FB1、OTA、ZEN和DON)，進行傳感器的選擇性實驗，AFB1的濃度為1.0 ng/mL，其他真菌毒素的濃度均為10 ng/mL，以460 nm為激發(fā)波長，測定熒光發(fā)射光譜(最大發(fā)射波長為575 nm)。所有的光譜測定都在室溫下10 mmol/L 磷酸二氫鈉-磷酸氫二鉀(PBS，pH7.2)緩沖溶液中進行。所得數(shù)據(jù)均為三次測定平均值。

2.2.5 中藥材中AFB1分析

取中藥材樣品研碎粉末5 g(過3號篩),準確稱定,準確加70%甲醇溶液50 mL,超聲處理 30 min,離心5 min(離心速度4 000 r/min),準確吸取上清液10 mL,用水稀釋至20 mL,搖勻,即得供試品溶液。

取供試品溶液適量置于AuNPs/Apt/CdTe QDs復合物分散體系中，混勻，再加入PBS緩沖溶液，搖勻，孵化10 min，測定體系的熒光光譜，確定中藥材中AFB1含量。

用RF-5301PC型熒光分光光度計測熒光強度(F)。同時做AFB1試劑空白(F0)。測定時激發(fā)波長選用460 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫都設(shè)置為5.0 nm。

3 結(jié)果與討論

3.1 方法原理

金納米粒子具有強烈的熒光猝滅功能[19]。在本工作中，我們選用CdTe量子點作為熒光探針，金納米粒子為熒光猝滅劑。先將帶負電荷的巰基-AFB1核酸適體修飾金納米粒子表面形成AuNPs/Apt；帶正電荷的CdTe QDs通過靜電作用在AuNPs/Apt表面自組裝形成AuNPs/APt/CdTe QDs復合物，并使CdTe QDs熒光猝滅。向體系中加入AFB1時，Apt選擇性地與AFB1作用，并釋放出CdTe QDs，體系熒光恢復。圖1表明，加入的AFB1量越大，釋放出的CdTe QDs就越多，體系熒光強度就越大，依據(jù)熒光強度與AFB1的量的關(guān)系，可以建立一種基于CdTe量子點熒光恢復的核酸適體熒光傳感檢測AFB1的新方法。

圖1 金納米粒子/核酸適體/CdTe量子點+黃曲霉素B1體系的熒光光譜

Fig.1 Fluorescence spectra of AuNPs/aptamer/CdTeQDs+AFB1

3.2 核酸適體用量的影響

在Apt∶AuNPs的摩爾濃度比為50∶1～300∶1范圍，制備AuNP/Apt復合物，然后向AuNPs/Apt復合物體系中加入過量的CdTe QDs，離心分離除去未自組裝的CdTe DQs，再將AuNPs/Apt/CdTe QDs分散至二次水中，測其熒光發(fā)射光譜曲線。結(jié)果見圖2。從圖2可知，Apt∶AuNPs在175∶1～225∶1范圍，體系熒光均能有效猝滅，而225∶1時猝滅程度最大。

圖2 核酸適體與金納米粒子的量比對體系熒光猝滅的影響

Fig.2 Influence of aptamer and AuNPs molar ratio on fluorescent quenched

考察Apt修飾量對CdTe QDs的猝滅后，體系中加入AFB1的熒光恢復情況。在Apt∶AuNPs為175∶1、200∶1和225∶1復合物體系中，CdTe QDs熒光恢復分別為75.9%、79.3%和81.6%。因此，Apt∶AuNPs為225∶1有更為有效的熒光猝滅和熒光恢復。所以在后續(xù)實驗中選擇Apt的用量為AuNPs的225倍，依此確定AuNPs/Apt/CdTe QDs之比為1∶225∶900(量比，CdTe QDs濃度以Te量計算)。

3.3 pH及鹽的濃度的影響

在pH 4.0～9.0范圍，研究了pH對體系熒光恢復的影響。在pH 4.0～7.0時，體系熒光隨pH升高而顯著增強；pH 7.0～7.5范圍，體系熒光緩慢增強，且在pH 7.5時達到最大值；之后隨pH值的增大而逐漸降低，當達到pH 9.0時體系熒光強度顯著下降。故在后續(xù)實驗中，控制體系pH 值為7.2。

體系熒光強度隨pH值的改變而變化的現(xiàn)象主要是CdTe QDs對H+離子敏感。在酸性條件下，量子點表面氨基接受質(zhì)子，引起熒光猝滅，隨pH值的升高，氨基接受的質(zhì)子明顯減少，熒光強度顯著提高；在堿性條件下，由于量子點表面的氨基存在，彼此間可以形成氫鍵，從而引發(fā)團聚現(xiàn)象，使熒光猝滅，體系的熒光強度顯著降低。

考察了NaCl對體系熒光的影響。實驗表明，NaCl 濃度在50 mmol/L時，對體系熒光無明顯影響。

3.4 孵化時間的影響

在室溫下，考察了孵化時間對熒光恢復的影響。實驗結(jié)果顯示，孵化時間達到5 min時，體系熒光迅速恢復并在1 h內(nèi)熒光強度無明顯變化，繼續(xù)延長孵化時間，體系熒光強度不再變化。故確定孵化時間為5 min。

孵化實驗表明，溶液中AFB1迅速與納米復合物中的Apt結(jié)合并釋放出CdTe QDs，使體系熒光強度迅速恢復并達到平衡，為樣品中AFB1的快速檢測提供了保證。

3.5 其他真菌毒素物的影響

控制AFB1濃度為1.0 ng/mL，其他真菌毒素的濃度為10 ng/mL，進行了方法的選擇性實驗，結(jié)果見圖3。從圖3可知，AFB1核酸適體對AFB1呈現(xiàn)高選擇性，其他真菌毒素無明顯干擾。

圖3 核酸適體傳感分析的選擇性，AFB1為1.0 ng/mL，其余真菌毒素濃度為10 ng/mL。

Fig.3 Selectivity of the aptasensor assay, concentration of AFB1: 1.0 ng/mL, others: 10.0 ng/mL.

3.6 標準曲線和檢出限

在10 mmol/L PBS(pH=7.2)納米復合物(AuNPs/Apt/CdTe QDs比為1∶225∶900)分散液中，分別依次加入不同濃度的AFB1標準溶液，孵化5 min，測定體系熒光光譜，結(jié)果見圖4。從圖4可知，隨著AFB1的濃度增大，體系熒光強度也隨之增強，但最大熒光發(fā)射波長不變；進一步研究表明，體系的熒光恢復程度y(y=F-F0)與AFB1濃度在0.005 ～ 2.0 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系(圖4)，其線性回歸方程為y=27.71+274.2C(C為AFB1的濃度，單位：ng/mL)，相關(guān)系數(shù)為0.997 1，方法檢出限(3σ/k)為1.2 pg/mL。

圖4 體系的熒光強度隨AFB1濃度(0,0.005,0.010,0.020,0.040,0.060,0.080,0.10,0.20,0.40,0.75,1.00,1.50，2.00 ng/mL)的變化情況。插圖：F-F0與AFB1的濃度在0.005～2.0 ng/mL范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。

Fig.4 Dependence of FL intensity on the concentration of AFB1(0, 0.005, 0.010, 0.020, 0.040, 0.060, 0.080, 0.10, 0.20, 0.40, 0.75, 1.0, 1.5, 2.0 ng/mL). Inset shows the linear relationship betweenF-F0and AFB1 concentration within the range of 0.005-2.0 ng/mL.

3.7 分析應用

將所構(gòu)建的核酸適體傳感體系應用于連翹、甘草和山楂等中藥材中的 AFB1 檢測，結(jié)果如表1所示。

表13種中藥材樣品中AFB1的檢測

Tab.1 Detection of AFB1 in three kind of Chinese traditional medicines (n=3)

中藥材樣品測定量/(μg·kg-1)加入量/(μg·kg-1)回收率/%相對標準差/%連翹10．00550．005105．53．5連翹20．00120．001104．23．2山楂10．861．0102．82．8山楂20．630．597．64．9山楂32．55．0103．22．5甘草113．515．0101．51．6甘草25．85．0102．82．4甘草311．410．0102．52．2甘草42．65．097．33．3

從表1 可知，甘草污染嚴重，山楂也有一定的污染，連翹僅是輕微污染。另外，回收率和 RSD 的結(jié)果表明，該傳感體系適用于中藥材中殘留黃曲霉毒素B1的檢測。

4 結(jié) 論

以黃曲霉毒素B1核酸適體、金納米粒子和CdTe量子點制備了AuNPs/Apt/CdTeQDs核酸適體復合物；金納米粒子使復合物中量子點熒光猝滅，而黃曲霉毒素B1與復合物中核酸適體高選擇性地結(jié)合并釋放出量子點，使其熒光恢復，據(jù)此，建立了一種高選擇性、高靈敏測定黃曲霉毒素B1的傳感分析方法。該方法在實際樣品分析中的回收率在97.3%～105.5%，相對標準差小于5%，能滿足中藥材中痕量黃曲霉毒素B1的檢測要求。

參考文獻：

[1] 韓錚.中藥材中常見真菌毒素分析方法學及代謝動力學研究 [D]. 杭州：浙江大學， 2011.

HANG Z.StudyonTheAnalyticalMethodologyandPharmacokineticsofMycotoxinsinTraditionalChineseMedicines[D]. Hangzhou： Zhejiang University， 2011. (in Chinese).

[2] 張鑫， 王福， 陳鴻平， 等. 中藥材真菌及真菌毒素污染研究現(xiàn)狀 [J]. 世界科學技術(shù)—中醫(yī)藥現(xiàn)代化， 2015, 17(11)：2381-2388.

ZHANG X， WANG F， CHEN H P，etal.. Research progress on fungi and mycotoxin infection of chinese medicinal materials [J].WorldSci.Technol.—Modern.Trad.Chin.Med.Mater.Med., 2015, 17(11):2381-2388. (in Chinese)

[3] KATERERE D R, STOCKENSTROM S, THEMBO K M,etal.. A preliminary survey of mycological and fumonisin and aflatoxin contamination of African traditional herbal medicines sold in South Africa [J].Hum.Exp.Toxicol., 2008, 27(11): 793-798.

[4] RIZZO I, VEDOYA G, MAURUTTO S,etal.. Assessment of toxigenic fungi on Argentinean medicinal herbs. Microbiol [J].Research, 2004, 159 (2):113-120.

[5] ASHIQ S, HUSSAIN M, AHMAD B. Natural occurrence of mycotoxins in medicinal plants: a review [J].FungalGeneBiol., 2014, 66:1-10.

[6] LIU L, JIN H, SUN L,etal.. Determination of aflatoxins in medicinal herbs by high- perfor mance liquid chromatography-tandem mass spectrometry [J].Phytochem.Anal., 2012, 23(5): 469-476.

[7] 李寧俠， 唐招平， 馬寧. 超高效液相色譜-質(zhì)譜法同時檢測中藥酒劑中多種真菌毒素的污染水平 [J]. 現(xiàn)代中藥研究與實踐, 2017, 31(2):57-63.

LI N X, TANG Z P, MA N. Simultaneous determinations of multi-residue mycotoxins in Chinese medicine health wines by ultra high performance liquid chromatography-tan-dem mass spectrometry [J].Chin.Med.J.Res.Prac., 2017, 31(2):57-63. (in Chinese).

[8] WEN J, KONG W J, HU Y C,etal.. Multi-mycotoxins analysis in ginger and related products by UHPLC-FLR detection and LC-MS/MS confirmation [J].FoodControl, 2014, 43(8):82-87.

[9] PAEK S H, LEE S H, CHO J H,etal.. development of rapid one-step immuno-chro- matographic assay [J].Methods, 2000, 22(1):53-60.

[10] WANG B, CHEN Y F, WU Y Y,etal.. Aptamer induced assembly of fluorescent nitrogen-doped carbondots on gold nanoparticles for sensitive detection of AFB1 [J].Biosens.Bioelectron., 2016, 78:23-30.

[11] GUO X D, WEN F, ZHENG N,etal.. Development of an ultrasensitive aptasensor for the detection of aflatoxin B1[J].Biosens.Bioelectron., 2014, 56:340-344.

[12] 孫琳， 張秋艷， 李珍珍， 等. CdTe 量子點功能化玻片的制備及其對Pb2 +濃度的檢測 [J]. 發(fā)光學報， 2015， 36(3):339-347.

SUN L, ZHANG Q Y， LI Z Z,etal.. Preparation of CdTe quantum dots modified wafer and its application in Pb2 +detection [J].Chin．J．Lumin., 2015, 36(3):339-347. (in Chinese).

[13] 李滿秀， 張強， 趙三虎， 等. 基于CdTe 量子點熒光猝滅-恢復方法測定依諾沙星的研究 [J]. 發(fā)光學報， 2016， 37(4):467-472.

LI M X, ZHANG Q, ZHAO S H,etal.. Enoxacin detection based on CdTe quantum-dot-based OFF-ON fluorescent probe [J].Chin.J.Lumin., 2016, 37(4):467-472. (in Chinese).

[14] 謝憲， 于梅花， 王益林， 等. 抗壞血酸還原亞碲酸鈉水相合成CdTe量子點 [J]. 高等學?；瘜W學報， 2015， 36(4)：608-613.

XIE X， YU M H， WANG Y L，etal.. Aqueous synthesis of CdTe quantum dotsviaascorbic acid reducing sodium tellurite [J].Chem.J.Chin.Univ., 2015， 36(4)：608-613. (in Chinese).

[15] 秦元斌， 楊曦， 于俊生. 巰基乙胺穩(wěn)定的水溶性CdTe納米粒子的合成與表征 [J]. 無機化學學報， 2006， 22(5)：851-855.

QIN Y B, YANG X, YU J S. Synthesis and characterization of CdTe nanoparticles stabilized by cysteamine [J].Chin.J.Inorg.Chem., 2006, 22(5)：851-855. (in Chinese)

[16] WANG B, ZHU Q K, LIAO D L,etal.. Perylene probe induced gold nanoparticle aggregation [J].J.Mater.Chem., 2011, 21:4821-4826.

[17] JIN R C, WU G S, LI Z ,etal.. What controls the melting properties of DNA-linked gold nanoparticle assemblies [J].J.Am.Chem.Soc., 2003. 125:1643-1654.

[18] ZHANG X, SERVOS M R, LIU J W. Instantaneous and quantitative functionalization of gold nanoparticles with thiolated DNA using a pH-assisted and surfactant-free route [J].J.Am.Chem.Soc., 2012, 134:7266-7269.

[19] SAHA K, AGASTI S S, KIM CY,etal.. Gold nanoparticles in chemical and biological sensing [J].Chem.Rev., 2012, 112:2739-2779.

曾云龍(1955-)，男，湖南邵東人，博士，教授，2007年于湖南大學獲得博士學位，主要從事量子點熒光材料的合成及在化學生物傳感中的應用的研究。

E-mail: yunlongzeng1955@126.com