響應(yīng)面法優(yōu)化索式提取茄子根中總黃酮工藝的研究

王亞紅,賈穎超

(吉林化工學(xué)院 化學(xué)與制藥工程學(xué)院,吉林 吉林 132022)

茄子性味古寒，有散血瘀、消腫止疼、治療寒熱、祛風(fēng)通絡(luò)和止血等功效.茄子根含有極為豐富的生物活性成分-黃酮類化合物[1].黃酮類化合物又稱生物類黃酮，是植物經(jīng)光合作用產(chǎn)生的一大類化合物[2].黃酮類化合物具有一定的藥學(xué)性能，如增強機體免疫力、降血糖、降低心肌耗氧量、增加冠狀動脈及腦血管流量、消除體內(nèi)自由基、抗氧化、抗衰老等功能[3].此外，天然黃酮類化合物因具有相對安全的特點在食品加工中廣泛用作添加劑[4].在大多數(shù)地區(qū)，茄子根隨意丟棄或焚燒，不但沒有將資源合理利用，還污染環(huán)境.因此，茄子根中總黃酮的提取對生產(chǎn)生活有很重要的現(xiàn)實意義[5].

索氏提取法采用溶劑回流和虹吸原理，連續(xù)提取固體物料，既節(jié)省溶劑又可以提高提取效率[6].本研究用索氏提取器提取茄子根中總黃酮，為其進(jìn)一步分離提純和生產(chǎn)實踐應(yīng)用奠定基礎(chǔ).

1　實驗部分

1.1　實驗材料

茄子根飲片購于吉林市江城大藥房；試劑主要有無水乙醇(分析純)，天津市大茂化學(xué)試劑廠；無水三氯化鋁(分析純)，天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心；醋酸鈉(分析純)，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司；醋酸(分析純)，天津市福晨化學(xué)試劑廠.

1.2　實驗儀器

FA2204N型電子分析天平，上海箐海儀器有限公司；DNG-9076A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；759型紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司.

1.3　實驗方法

1.3.1對照品溶液的制備

精密稱取干燥至恒重的對照品蘆丁7.2 mg，用無水乙醇溶解定容至25 mL容量瓶中，取上述溶液10 mL定容于25 mL容量瓶中，配制成濃度為0.115 2 mg/mL對照品溶液.

1.3.2供試品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取干燥的茄子根粉末2 g，以60%乙醇為溶媒，液料比為35 mL/g，用索氏提取器提取兩次，提取時間為3 h，減壓過濾后，合并兩次提取液，密封備用.

1.3.3檢測波長的確定

分別移取蘆丁對照品溶液、供試品溶液各2 mL置10 mL容量瓶中，各加入質(zhì)量濃度為1.34%的三氯化鋁溶液2 mL，pH5.2的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液1 mL，充分振搖混合，用60%乙醇定容.40 ℃水浴加熱15 min，以不加對照品溶液的空白組為對照，在同一臺紫外分光光度儀進(jìn)行最大吸收波長的掃描.

1.3.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密移取蘆丁對照品溶液1.2、1.6、2.0、2.4、2.8 mL分別置于5個10 mL容量瓶中，各加入質(zhì)量濃度為1.34%的三氯化鋁溶液2 mL，pH5.2的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液1 mL，充分振搖混合，用60%乙醇定容.40 ℃水浴加熱15 min，以不加對照品溶液的空白組為對照，于398 nm處測定吸光度[7,8].

1.3.5茄子根總黃酮提取率計算

移取每次實驗合并所得的提取液適量置于10 mL容量瓶中，按照1.3.4方法測定吸光度，若結(jié)果超出線性范圍則做稀釋或濃縮處理.依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取率，公式如下[9]：

其中w%為茄子根總黃酮提取率，y為吸光度，n為稀釋倍數(shù)，V1為每次實驗合并所得提取液體積，單位為mL.

1.3.6茄子根前處理與提取率關(guān)系

分別準(zhǔn)確稱取干燥的24目、50目、65目、80目、100目茄子根粉末2 g，按照1.3.2項方法提取，按照1.3.4項方法測定吸光度，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取率.

1.3.7單因素實驗

準(zhǔn)確稱取干燥的50目茄子根粉末2 g，分別就乙醇濃度(30%、40%、50%、60%、70%)，提取時間(2.5 h、3 h、3.5 h、4 h、4.5 h)，溶媒用量(15 mL/g、25 mL/g、35 mL/g、45 mL/g、55 mL/g)，按照1.3.2項實驗方法進(jìn)行單因素實驗.

1.3.8響應(yīng)面實驗

依據(jù)單因素實驗結(jié)果，根據(jù)Box-Behnken實驗設(shè)計原理，運用Design Expert 8.0.6軟件設(shè)計響應(yīng)面實驗，分別以乙醇濃度、提取時間、溶媒用量這三個因素設(shè)計三水平共計17次實驗，以總黃酮的提取率為響應(yīng)指標(biāo)確定最佳工藝條件，因素水平如表1[10].

表1　因素水平表

2　結(jié)果與分析

2.1　檢測波長的確定

掃描結(jié)果顯示，對照品溶液、供試品溶液的最大吸收峰均出現(xiàn)在398 nm，所以本實驗確定398 nm為測定波長.

2.2　標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=22.156X-0.044 4.R2=0.999 5.結(jié)果表明蘆丁在0.014～0.032 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系.

2.3　茄子根前處理與提取率關(guān)系

茄子根粉末目數(shù)對總黃酮提取率的影響見圖1.

茄子根粉末目數(shù)圖1　茄子根粉末目數(shù)對總黃酮提取率的影響

由圖1可知，茄子根總黃酮的提取率隨著藥粉目數(shù)的增大先增大后減小，當(dāng)目數(shù)達(dá)到50目時，茄子根的提取率達(dá)到最大值.確定以50目茄子根粉末為原料完成所有實驗研究.

2.4　單因素實驗

2.4.1乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

乙醇濃度的影響如圖2所示.

乙醇濃度/%圖2　乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

從圖2可以看出，茄子根總黃酮的提取率先隨著乙醇濃度增加而有所提高，當(dāng)乙醇濃度為40%時處于一個最高點，隨后提取率隨乙醇濃度增加而下降.確定40%乙醇濃度進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計.

2.4.2提取時間對總黃酮提取率的影響

提取時間的影響見圖3.

提取時間/h圖3　提取時間對總黃酮提取率的影響

從圖3可知，茄子根總黃酮的提取率隨著提取時間的增加而呈現(xiàn)先增后減的變化趨勢，當(dāng)提取時間達(dá)到3.5 h的時候，總黃酮提取率達(dá)到最大值.確定3.5 h進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計.

2.4.3溶媒用量對總黃酮提取率的影響

溶媒用量的影響見圖4.

溶媒用量/(mL/g)圖4　溶媒用量對總黃酮提取率的影響

從圖4可知，茄子根總黃酮的提取率隨著溶媒用量的增加而增加，當(dāng)溶媒用量為25 mL/g時，總黃酮提取率最大，隨后提取率開始下降.確定25 mL/g進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計.

2.5　響應(yīng)面實驗

2.5.1響應(yīng)面實驗結(jié)果

響應(yīng)面實驗結(jié)果如表2所示.

表2　響應(yīng)面實驗結(jié)果

采用Design Expert 8.0.6軟件對表中實驗結(jié)果進(jìn)行多項擬合回歸，得到總黃酮提取率對乙醇濃度、提取時間、溶媒用量的二次多項回歸模型，回歸方程為：

Y=0.42+0.016A+0.018B+2.000E-003C-0.012AB+7.500E-004AC+0.02BC-0.035A2-0.039B2-0.053C2.

其中Y為茄子根總黃酮提取率預(yù)測值，A、B、C分別為上述3個自變量的編碼值.

2.5.2方差分析與顯著性檢驗

方差分析與顯著性檢驗見表3.

由表3可以看出模型顯著(p<0.005)，在統(tǒng)計學(xué)上是有實際意義的，失擬項是不顯著的(p>0.05)，所以該實驗?zāi)Ｐ团c實驗的擬合度良好且實驗數(shù)據(jù)合理可靠.模型的R2=0.922 2，說明響應(yīng)值的變化有92.22%來源于所選自變量，因變量和所選自變量之間的線性關(guān)系顯著，進(jìn)一步說明該回歸方程可以替代實驗真實點對實驗結(jié)果進(jìn)行分析.模擬的二次項A2、B2、C2均達(dá)到顯著水平，響應(yīng)面模型一次項溶媒用量B達(dá)到顯著水平，表明溶媒用量對茄子根總黃酮提取的影響不是簡單的線性關(guān)系.本模型可以得到足夠的響應(yīng)信號，因此可以用此模型分析和預(yù)測茄子根總黃酮提取工藝結(jié)果.

表3　回歸模型方差分析

注：P<0.000 1為極顯著，P<0.01為非常顯著，P<0.05為顯著.

2.5.3響應(yīng)面分析

采用Design Expert 8.0.6軟件，將三種因素兩兩進(jìn)行分析比較，根據(jù)回歸方程，各因素間交互作用的響應(yīng)面見圖5～圖7.

乙醇濃度/%

圖5　乙醇濃度與溶媒用量交互作用對提取率的影響

響應(yīng)曲面反映每兩個影響因素之間的交互作用，考察響應(yīng)面可進(jìn)一步確定溶媒用量對總黃酮提取率的影響最大，乙醇濃度次之，提取時間對其影響相對較小.等高線的形狀反映交互作用的強弱大小，圓形表示兩因素的交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著.

圖5中顯示乙醇濃度與溶媒用量交互作用對提取率有影響，但不顯著.隨著乙醇濃度的增高，總黃酮提取率呈現(xiàn)先增高后降低趨勢；隨著溶媒用量增多，總黃酮提取率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢.乙醇濃度在40%～45%之間，溶媒用量在20～30 mL/g之間，茄子根總黃酮提取率達(dá)到本次實驗最大值.

圖6中顯示了乙醇濃度與時間交互作用對提取率有影響，但不顯著.隨著乙醇濃度的增高，黃酮提取率呈現(xiàn)先增高后降低趨勢；隨著時間的增大，總黃酮提取率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢.乙醇濃度在40%～45%之間，時間在3.6～3.8 h之間，茄子根總黃酮提取率達(dá)到本次實驗最大值.

時間/h

圖6　乙醇濃度與時間交互作用對提取率的影響

圖7中顯示了溶媒用量與時間交互作用對提取率有影響，但不顯著.隨著溶媒用量增多，總黃酮提取率呈現(xiàn)先增高后降低趨勢；隨著時間的增大，總黃酮提取率呈現(xiàn)先增加后降低趨勢.溶媒用量在20～30 mL/g之間，時間在3.6～3.8 h之間，茄子根總黃酮提取率達(dá)到本次實驗最大值.

時間/h

圖7　溶媒用量與時間交互作用對提取率的影響

2.5.4響應(yīng)面最佳條件確定

經(jīng)過Design Expert分析，得到模型最佳數(shù)據(jù)為乙醇濃度42.20%、溶媒用量25.62 mL/g、提取時間3.60 h，模型預(yù)測總黃酮提取率為0.424%.為了具有可操作性，將上述數(shù)據(jù)修正為乙醇濃度42%，溶媒用量26 mL/g，提取時間3.6 h.

2.5.5模型的驗證

為檢驗響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果的科學(xué)性，按照修正后的最佳條件提取茄子根總黃酮，3次平行實驗提取率分別為0.423%、0.427%、0.425%，平均值為0.425%，RSD值為0.007%.

實驗值與預(yù)測值相對誤差為0.24%.因此采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到的索氏提取茄子根總黃酮的條件參數(shù)準(zhǔn)確可靠.

3　結(jié)　　論

本研究通過茄子根前處理與提取率關(guān)系實驗確定茄子根粉末最適宜粒度為50目基礎(chǔ)之上，采用單因素實驗考察了乙醇濃度、提取時間、溶媒用量對總黃酮提取率的影響，將乙醇濃度考察范圍定為30～50%，提取時間考察范圍定為3～4 h、溶媒用量考察范圍定為15～35 mL/g.通過星點設(shè)計-響應(yīng)面法，建立了茄子根總黃酮索氏提取的數(shù)學(xué)模型，模型的決定系數(shù)為0.922 2，方程顯著，擬合良好，可以進(jìn)行實際預(yù)測，并最終確定茄子根總黃酮索氏提取最佳工藝條件為：乙醇濃度42%，溶媒用量26 mL/g，提取時間3.6 h，茄子根粉末目數(shù)50目.3次驗證實驗平均提取率為0.425%，和模型預(yù)測的提取率0.424%相對誤差0.24%，因此響應(yīng)面法對茄子根總黃酮提取的優(yōu)化是可行的，優(yōu)化得到的總黃酮提取工藝條件具有實際應(yīng)用價值.

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