餐飲食品中罌粟殼的快速測(cè)定方法

◎ 黃 寧，丁建蘭，黃恩堂，楊 希

（鷹潭市綜合檢驗(yàn)檢測(cè)中心，江西 鷹潭 335000）

近年來(lái)，人們?cè)絹?lái)越關(guān)注食品中非法添加藥物的問(wèn)題。黨的十九大報(bào)告明確指出“實(shí)施食品安全戰(zhàn)略，讓人民吃得放心”。中央已經(jīng)把食品安全提高到戰(zhàn)略高度，但在食品中非法添加罌粟殼來(lái)吸引顧客的行為，仍屢禁不止。長(zhǎng)期食用含罌粟殼的食品會(huì)對(duì)人的神經(jīng)系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)造成危害。為了維護(hù)廣大人民群眾的身體健康，要嚴(yán)厲打擊非法添加現(xiàn)象，建立快速、準(zhǔn)確的餐飲食品中罌粟殼的測(cè)定方法具有重要意義。

餐飲食品中罌粟殼的檢測(cè)方法于2018 年之前尚無(wú)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，2018 年4 月市場(chǎng)監(jiān)管總局發(fā)布的《食品中罌粟堿、嗎啡、可待因、那可丁和蒂巴因的測(cè)定液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》補(bǔ)充了檢驗(yàn)方法，由于設(shè)備資源有限，基層推廣時(shí)無(wú)法直接照搬使用，給我國(guó)餐飲食品的監(jiān)督管理工作帶來(lái)了一定的技術(shù)難題，為進(jìn)一步保障人民的飲食安全，維護(hù)人民身體健康，研究餐飲食品中罌粟殼的檢測(cè)方法勢(shì)在必行。筆者參考了大量文獻(xiàn)[1-67]，在相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，建立了一種經(jīng)濟(jì)、快速、準(zhǔn)確且靈敏度高的餐飲食品中罌粟殼的檢測(cè)方法。

1 儀器與材料

1.1 儀器

液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用儀（三重串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜）LC/MS QQQ（配四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器、電噴霧離子源ESI，美國(guó)Agilent Technologies 1290 Inf inity Ⅱ/6460 Triple Quad LC/MS）；電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器上海有限公司MSA225P-CE）。

1.2 材料

鹽酸、乙醇、正丁醇、三氯甲烷、濃氨、碘化鉍鉀試液、碘化汞鉀試液、甲醛硫酸試液、鉬硫酸試液、稀鐵氰化鉀試液、氫氧化鈉、乙酸乙酯、甲酸、丙酮、氨水、苯、甲苯及亞硝酸鈉乙醇試液為分析純；甲醇、乙腈為色譜純，水為超純水。過(guò)濾用0.22 μm 濾膜。其他材料及其來(lái)源見(jiàn)表1 和表2。

表1 罌粟殼藥材來(lái)源表

表2 標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)源表

待測(cè)樣品為市場(chǎng)上的牛肉粉面、烤肉串、醬鹵雞腿、 火鍋底料、自制醬料及麻辣燙6 類食品共25 批樣品。

2 試驗(yàn)條件的選擇

2.1 理化反應(yīng)試劑的選擇

根據(jù)生物堿特性，分別用碘化鉍鉀試液、碘化汞鉀試液、甲醛硫酸試液、鉬硫酸試液和稀鐵氰化鉀試液與樣品反應(yīng)，結(jié)果顯示（圖1）加碘化鉍鉀試液（管1、3）、碘化汞鉀試液（管2、4）反應(yīng)效果好，陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照結(jié)果區(qū)別很明顯。

圖1 化學(xué)鑒別反應(yīng)結(jié)果圖

2.2 薄層色譜條件的選擇

2.2.1 薄層板的選擇

分別用硅膠G 薄層板、硅膠GF254薄層板、2%氫氧化鈉溶液制備的硅膠G薄層板試驗(yàn)。

2.2.2 展開(kāi)劑的選擇

分別用乙酸乙酯-甲酸-氨水（13 ∶2 ∶1）、三氯甲烷-丙酮-氨水（16 ∶4 ∶0.3）、三氯甲烷-甲醇-氨水（13 ∶2 ∶0.3）、丙酮-苯-乙醇-氨水（20 ∶20 ∶5 ∶2）、乙酸乙酯-甲醇-氨水（85 ∶5 ∶2）以及甲苯-丙酮-乙醇-濃氨試液（20 ∶20 ∶3 ∶1）作為展開(kāi)劑進(jìn)行試驗(yàn)。

2.2.3 顯色劑的選擇

分別用碘化鉍鉀試液、亞硝酸鈉乙醇試液、改良碘化鉍鉀試液噴在展開(kāi)后的薄層板上。

2.2.4 檢視條件的選擇

分別在日光下、紫外光燈254 nm 下、紫外光燈365 nm 下檢視。

2.2.5 結(jié)果

檢視結(jié)果如圖2 ～4 所示。

圖2 噴顯色劑碘化鉍鉀 試液后日光下檢視圖

圖3 紫外光燈365 nm 下 檢視圖

圖4 噴顯色劑亞硝酸鈉乙醇試液后日光下檢視圖

如圖3 所示，薄層板用硅膠G 板較好，選擇“丙酮-苯-乙醇-氨水（20 ∶20 ∶5 ∶2）”作為展開(kāi)劑，5 種生物堿分離效果好，生物堿對(duì)照品點(diǎn)1 ～5 分離較好。顯色劑選擇碘化鉍鉀試液較理想，目標(biāo)物質(zhì)斑點(diǎn)顯色清晰，呈橙紅色，薄層板背景呈淡黃色，顏色均勻。如圖3 中點(diǎn)5 所示，噴顯色劑亞硝酸鈉乙醇試液后，目標(biāo)物質(zhì)的斑點(diǎn)明顯變成鮮艷的橘紅色，斑點(diǎn)顏色明顯，但界限不清晰，而且薄層板背景由深紅棕色慢慢轉(zhuǎn)白，顏色不均勻。

檢視在日光下較好，如圖2 所示。在紫外光365 nm下檢視很不理想，目標(biāo)物質(zhì)沒(méi)有熒光斑點(diǎn)，檢視不出來(lái)，如圖4 中點(diǎn)1 ～5 所示；樣品中的其他雜質(zhì)熒光斑點(diǎn)清晰，如圖4 中點(diǎn)7 所示。

2.3 流動(dòng)相的選擇

試驗(yàn)嘗試多種流動(dòng)相：甲醇-0.02 mol·L-1乙酸銨溶液、乙腈-0.02 mol·L-1磷酸二氫鉀+0.02 mol·L-1磷酸氫二鈉氫溶液、乙腈-0.01mol·L-1乙酸銨溶液（pH3.0、3.5、3.8、4.0、4.3），試驗(yàn)表明乙腈-0.01 mol·L-1乙酸銨溶液（pH4.3）梯度洗脫分離效果最好，如圖5 所示。

2.4 柱溫的選擇

分別在30、35、40 ℃柱溫下進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果在柱溫40 ℃時(shí)峰分離度和峰型最好，如圖5 所示。

圖5 40 ℃柱溫時(shí)峰分離度圖

3 方法與結(jié)果

3.1 理化反應(yīng)法

3.1.1 方法

取樣品5 g，加5%鹽酸乙醇溶液20 mL，超聲 30 min，趁熱濾過(guò)，濾液蒸至近干，殘?jiān)屑?%鹽酸溶液5 mL 使之溶解，分置二支試管中，一管中加碘化鉍鉀試液，生成橙紅色沉淀；另一管中加碘化汞鉀試液，生成灰白色沉淀。

3.1.2 結(jié)果判斷

供試品應(yīng)不呈正反應(yīng)，若兩管均呈正反應(yīng)，則結(jié)果疑似陽(yáng)性，待液-質(zhì)聯(lián)用法確證。

3.2 薄層色譜法

3.2.1 實(shí)驗(yàn)方法

（1）對(duì)照品溶液的制備。分別取嗎啡、那可汀、可待因、蒂巴因及罌粟堿對(duì)照品，用甲醇分別稀釋至0.2、0.2、0.4、0.8 mg·mL-1與0.4 mg·mL-1的溶液，即得單個(gè)對(duì)照品溶液。將5 種對(duì)照品溶于同一容量瓶中，得混合對(duì)照品溶液。

（2）樣品溶液的制備。取樣品10 g，加甲醇30 mL 加熱回流30 min，趁熱濾過(guò)，濾液蒸至近干，殘?jiān)蛹状? mL 溶解。

（3）薄層板。硅膠G 板。

（4） 展 開(kāi) 劑。 丙 酮∶苯∶乙 醇∶氨 水（20 ∶20 ∶5 ∶2）。

（5）檢視。噴碘化鉍鉀顯色劑，標(biāo)準(zhǔn)品與陽(yáng)性樣品應(yīng)出現(xiàn)明顯的橙紅色斑點(diǎn)。

3.2.2 結(jié)果判斷

供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，不得顯相同顏色的斑點(diǎn)。若顯相同顏色的斑點(diǎn)，則為疑似陽(yáng)性，待液-質(zhì)聯(lián)用法確證。

3.3 液-質(zhì)聯(lián)用法

3.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

分別精密稱取嗎啡、那可汀、可待因、蒂巴因及罌粟堿對(duì)照品，嗎啡用甲醇稀釋成系列濃度40、50、100、200、300、400 ng·mL-1及500 ng·mL-1，可待因用甲醇稀釋成系列濃度40、50、100、200、300、400、500、1 000 ng·mL-1及2 500 ng·mL-1，罌粟堿、蒂巴因和那可汀用甲醇稀釋成系列濃度2、4、8、10、20、40、60、80 ng·mL-1及100 ng·mL-1，分別精密吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液各5μL，注入液-質(zhì)聯(lián)用儀分析后得到不同濃度的峰面積，以峰面積為縱坐標(biāo)，罌粟殼生物堿濃度 （ng·mL-1）為橫坐標(biāo)，分別進(jìn)行線性回歸分析。

3.3.2 樣品溶液的制備

稱取樣品5 g（精確至0.01 g）于50 mL 聚四氟乙烯具塞離心管中，加水5 mL，振搖使之分散均勻（有些不易搖散的樣品，必要時(shí)可加水10 mL），加入乙腈15 mL，渦旋振蕩1 min，加入6 g 無(wú)水硫酸鎂和1.5 g 無(wú)水乙酸鈉的混合粉末，迅速振搖。渦旋振蕩 1 min，以4 000 r·min-1離心5 min，精密量取上清液 10 mL，用經(jīng)活化的C18小柱凈化，用10 mL 甲醇洗脫，收集洗脫液，氮吹至干，用甲醇定容至2 mL，經(jīng) 0.22 μm 濾膜過(guò)濾，待測(cè)。

3.3.3 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為色譜柱填充劑（規(guī)格為2.1 mm×100 mm，5 μm），柱溫40 ℃，流速 0.2 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm，掃描波長(zhǎng)范圍 200 ～400 nm，進(jìn)樣量5 μL，以乙腈為流動(dòng)相A，0.01 mol·L-1乙酸銨溶液（pH4.3）為流動(dòng)相B，按表3進(jìn)行梯度洗脫。

表3 洗脫條件表

3.3.4 質(zhì)譜條件ESI 離子源干燥氣溫度300 ℃，干燥氣流速11 L·min-1，毛細(xì)管電壓4 000 V，正掃描模式，MRM 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，待測(cè)化合物監(jiān)測(cè)母離子、子離子、碎裂電壓及碰撞能等質(zhì)譜參數(shù)見(jiàn)表4。

表4 待測(cè)化合物的質(zhì)譜參數(shù)表

3.3.5 測(cè)定法

分別精密吸取供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液各 5 μL，注入液-質(zhì)聯(lián)用儀，記錄色譜圖。

3.3.6 結(jié)果判斷

供試品色譜中，應(yīng)不得出現(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)品色譜保留時(shí)間一致的色譜峰。若出現(xiàn)保留時(shí)間相同的色譜峰，則相應(yīng)的一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜均不得與對(duì)照品一致。若色譜圖、一級(jí)質(zhì)譜及二級(jí)質(zhì)譜均與對(duì)照品一致，結(jié)果判定為陽(yáng)性。陽(yáng)性結(jié)果按式（1）定量計(jì)算。

式（1）中：X—試樣中待測(cè)組分的含量，單位為mg·kg-1。

ρ—從標(biāo)準(zhǔn)曲線得到的試樣中待測(cè)組分的含量，單位為ng·mL-1。

V—試樣的體積，單位為mL。

m—試樣的質(zhì)量，單位為g。

n—樣品稀釋倍數(shù)。

計(jì)算結(jié)果保留三位有效數(shù)字，在重復(fù)性條件下，獲得的兩次獨(dú)立測(cè)定結(jié)果的絕對(duì)差值不得超過(guò)算術(shù)平均值的20%。

3.3.7 線性關(guān)系考察

按2.2.3 做標(biāo)準(zhǔn)曲線，進(jìn)行線性回歸，嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀的線性方程及相關(guān)系數(shù)如表5 所示。

表5 嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因、那可汀的回歸方程表

3.3.8 定量限

將已知低濃度的罌粟殼生物堿對(duì)照品溶液，按3.3.3 至3.3.6 所述方法測(cè)定，以信噪比（S/N）為10 ∶1 時(shí)的濃度為定量限（LOQ），嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因及那可汀的定量限分別為2.4×10-2、2.4×10-2、6×10-4、6×10-4mg·kg-1及6×10-4mg·kg-1。

3.3.9 精密度

將混合標(biāo)準(zhǔn)品連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄其峰面積，精密度用峰面積變化的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示，嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因和那可汀的峰面積的RSD 值分別為1.32%、4.63%、1.11%、0.56%及1.77%，RSD均小于5%，表明精密度良好。

3.3.10 穩(wěn)定性試驗(yàn)

在室溫條件下，將同一份樣品溶液每隔一段時(shí)間（0、2、4、8 h 及12 h）測(cè)定一次，計(jì)算嗎啡、可待因、罌粟堿、蒂巴因且那可汀峰面積變化的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），分別為3.38%、1.38%、4.44%、4.99%及3.60%。說(shuō)明樣品在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性好。

3.3.11 回收率試驗(yàn)

分別精密稱取相同質(zhì)量的樣品10 份，一份不加標(biāo)準(zhǔn)品，作為測(cè)定本底值的樣品。另外9 份分別加入高、中、低3 種濃度的標(biāo)準(zhǔn)品制備供試液，每種濃度重復(fù)3 次，計(jì)算其樣品加標(biāo)回收率，嗎啡的平均加標(biāo)回收率是78.28%～103.62%，可待因的平均加標(biāo)回收率是80.86%～108.80%，罌粟堿的平均加標(biāo)回收率是84.21%～101.61%，蒂巴因的平均加標(biāo)回收率是74.63%～96.40%，那可汀的平均加標(biāo)回收率是 76.26%～91.08%。表明本法準(zhǔn)確度良好。

4 應(yīng)用

用本法對(duì)市場(chǎng)上的牛肉粉面、烤肉串、醬鹵雞腿、火鍋底料、自制醬料及麻辣燙6 類食品共25 批樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果均未檢出嗎啡、那可汀、可待因、蒂巴因及罌粟堿。方法檢測(cè)準(zhǔn)確率達(dá)100%，經(jīng)理化反應(yīng)法、薄層色譜法及液-質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)，確實(shí)未檢出罌粟殼生物堿。

5 討論

目前大多研究只采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀測(cè)定罌粟殼中的生物堿，但液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀價(jià)格昂貴，維護(hù)費(fèi)用高，考慮到基層監(jiān)管部門(mén)儀器設(shè)備的有限性和監(jiān)測(cè)方法的可行性，筆者建立的方法經(jīng)濟(jì)快捷，定量準(zhǔn)確穩(wěn)定，易于推廣，為保障人民飲食安全，為加強(qiáng)餐飲食品非法添加的監(jiān)管提供技術(shù)支撐。