清咽口服液水提醇沉工藝研究

紅河衛(wèi)生職業(yè)學(xué)院，云南　蒙自　661199

清咽口服液處方來(lái)源于臨床使用的經(jīng)驗(yàn)方射干豆根桔梗湯，主要由射干、山豆根、桔梗、甘草等組成，臨床用于預(yù)防和治療上呼吸道感染及流感，療效較好。處方中君藥為射干，文獻(xiàn)資料[1-2]表明，含射干的復(fù)方制劑多具有清利咽喉功能，常被用來(lái)預(yù)防或治療上呼吸道感染感染及流感。由于湯劑服用量大，不方便攜帶，在使用上有一定的局限性，因此特將射干豆根桔梗湯開(kāi)發(fā)成院內(nèi)制劑清咽口服液。根據(jù)藥材成分、藥理作用、中藥用藥習(xí)慣和臨床療效，為最大限度提取和保留該經(jīng)驗(yàn)處方的活性成分，實(shí)驗(yàn)采用水提醇沉工藝制備清咽口服液。在前期工藝研究中，對(duì)影響水提工藝的影響因素(浸泡時(shí)間、提取次數(shù)、提取時(shí)間、加水量)和醇沉的影響因素(藥液濃度、醇沉?xí)r間、醇沉濃度、醇沉溫度)進(jìn)行單因素考察，在此前提下進(jìn)行正交設(shè)計(jì)，考察各影響因素的交互作用，實(shí)驗(yàn)以處方中君藥射干的主要活性成分次野鳶尾黃素的轉(zhuǎn)移率和總皂苷轉(zhuǎn)移率作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)清咽口服液的制備工藝進(jìn)行優(yōu)化，為下一步申報(bào)醫(yī)院制劑提供依據(jù)。

1　儀器與材料

1.1儀器 Waters e2695-2489高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，AUW220型電子天平(日本島津)，C18色譜柱(Agilent ZORBAX SB-C18, 4.6 mm×250 mm, 5 μm, 美國(guó)安捷倫公司)，F(xiàn)A1004型電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

1.2材料射干(批號(hào)：20110403)、山豆根(批號(hào)：20110206)、桔梗(批號(hào)：20110711)、蟬蛻(批號(hào)：20110523)、甘草(批號(hào)：20120605)等均購(gòu)置云南白藥天紫紅飲片廠。次野鳶尾黃素對(duì)照品(批號(hào)：111557-200610，中國(guó)藥品生物制品檢定所)，甲醇為色譜純，水為純凈水，其余所用試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1水提工藝研究

2.1.1正交試驗(yàn)優(yōu)選通過(guò)前期單因素考察結(jié)果，在清咽口服液的提取過(guò)程中，影響提取效果的主要因素有浸泡時(shí)間(因素A)、加水量(因素B)、提取次數(shù)(因素C)、提取時(shí)間(因素D)，每個(gè)因素各選3個(gè)水平，各因素水平見(jiàn)表1。每次取處方量藥材100 g，按表2安排正交試驗(yàn)，并定容至100 mL進(jìn)行含量測(cè)定，選擇次野鳶尾黃素轉(zhuǎn)移率和總皂苷轉(zhuǎn)移率進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，其中次野鳶尾黃素轉(zhuǎn)移率權(quán)重系數(shù)0.7，總皂苷轉(zhuǎn)移率權(quán)重系數(shù)0.3。

表1　水提因素水平表

2.1.2次野鳶尾黃素含量測(cè)定

2.1.2.1色譜條件及系統(tǒng)適用性[3]以十八烷基反向鍵合硅膠為填充劑，C18色譜柱(AgilentXDB-C18，4.6 mm×150 mm，5 μm)；甲醇-0.2%磷酸(50∶50)為流動(dòng)相；流速1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：266 nm。理論板數(shù)按次野鳶尾黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于8000。

2.1.2.2測(cè)定方法取處方量藥材100 g，采用上述水提工藝進(jìn)行提取，藥液濃縮，定容至100 mL，從中精密量取25 mL藥液于分液漏斗中，加乙酸乙酯萃取4次，每次25 mL，搖勻，合并乙酸乙酯萃取液，用25 mL 2%的鹽酸溶液洗滌1次，回收乙酸乙酯萃取液，甲醇定容至25 mL，以微孔濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。另精密稱(chēng)取次野鳶尾黃素對(duì)照品2.1 mg，加甲醇溶解并定容至10 mL得濃度為0.21 mg/mL的對(duì)照品溶液。精密吸取上述供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀，按“2.1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2～4。

表2　水提正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

注：射干藥材中次野鳶尾黃素含量為0.13%。次野鳶尾黃素最高轉(zhuǎn)移率+總皂苷最高含量=100，次野鳶尾黃素轉(zhuǎn)移率=水提藥液中次野鳶尾黃素苷的量/藥材中次野鳶尾黃素的量×100%，次野鳶尾黃素轉(zhuǎn)移率評(píng)分=次野鳶尾黃素轉(zhuǎn)移率/次野鳶尾黃素最高轉(zhuǎn)移率×70%；總皂苷提取率評(píng)分=水提總皂苷提取率/總皂苷最高含量×30%；綜合評(píng)分=次野鳶尾黃素轉(zhuǎn)移率評(píng)分+總皂苷含量評(píng)分[4]。

表3　水提正交工藝直觀分析結(jié)果

表4　水提正交工藝方差分析結(jié)果

注：F0.05(2,2)=19

2.1.3總皂苷提取率測(cè)定[5]精密量取供試品溶液25 mL，用等倍量的乙醚(25 mL)萃取2次，棄去乙醚萃取液，下層藥液再用水飽和正丁醇萃取3次，每次25 mL，回收正丁醇萃取液后，105 ℃烘干至恒重?？傇碥展┰嚻窚y(cè)定：采用重量分析法，分析天平精密稱(chēng)量其重量。

2.1.4射干藥材中次野鳶尾黃素的含量測(cè)定精密稱(chēng)取射干粉末(過(guò)四號(hào)篩)0.1202 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱(chēng)定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱(chēng)定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.5結(jié)果分析從表2～5可知，各因素影響順序?yàn)椋篊>B>D>A，經(jīng)方差分析，提取時(shí)間、提取次數(shù)、加水量對(duì)提取均有顯著影響。并經(jīng)水提驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，結(jié)果穩(wěn)定、可靠。即最佳水提工藝為：A1B3C3D3。

2.1.6水提工藝驗(yàn)證按清咽口服液處方稱(chēng)取藥材1000 g，選擇最佳水提工藝進(jìn)行提取，即加10倍量水，浸泡0.5 h，提取3次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮，蒸餾水定容至1 L。結(jié)果見(jiàn)表5。

表5　水提工藝驗(yàn)證試驗(yàn)表

2.2醇沉工藝優(yōu)選[6-7]

2.2.1正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)為最大限度除去雜質(zhì)，保留有效成分，減少患者的服用量，在濃縮的水提液中加適量的乙醇除去樹(shù)膠、淀粉、蛋白等雜質(zhì)。通過(guò)前期單因素考察結(jié)果，選擇醇沉溫度(A)、藥液濃度(B)、乙醇濃度(C)、靜置時(shí)間(D)四個(gè)主要影響因素進(jìn)行考察，每個(gè)因素各選擇3個(gè)水平，各因素水平見(jiàn)表6。按清咽口服液上述優(yōu)選最佳水提工藝進(jìn)行提取、濃縮，表7安排醇沉正交試驗(yàn)，靜置后的藥液過(guò)濾，醇沉藥液減壓回收至無(wú)乙醇味，蒸餾水定容。評(píng)價(jià)指標(biāo)次野鳶尾黃素含量測(cè)定、總皂苷的測(cè)定見(jiàn)“2.1.2.1、2.1.3”，醇沉供試品測(cè)定方法見(jiàn)2.2.2，結(jié)果見(jiàn)表7～9。

2.2.2醇沉供試品制備方法取處方量藥材1000 g，加10倍量水，浸泡0.5 h，提取3次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮，蒸餾水定容至1 L。按照表7醇沉工藝正交設(shè)計(jì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，回收乙醇至無(wú)醇味，蒸餾水定容至100 mL，從中精密量取25 mL藥液，置分液漏斗中，加乙酸乙酯萃取4次，每次25 mL，搖勻，合并乙酸乙酯萃取液，用2%的鹽酸溶液25 mL洗滌1次，回收乙酸乙酯，甲醇定容至25 mL，以微孔濾膜(0.45 μm)濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。按“2.1.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表6～8。

表6　醇沉因素表

表7　醇沉正交試驗(yàn)及結(jié)果

注：次野鳶尾黃素最高轉(zhuǎn)移率+總皂苷最高轉(zhuǎn)移率=100分(次野鳶尾黃素轉(zhuǎn)移率=醇沉藥液中次野鳶尾黃素苷的量/水提最佳工藝中次野鳶尾黃素的量×100%)，次野鳶尾黃素轉(zhuǎn)移率評(píng)分=次野鳶尾黃素轉(zhuǎn)移率/次野鳶尾黃素最高轉(zhuǎn)移率×70%；總皂苷提取率評(píng)分=醇沉總皂苷提取率/水提最佳工藝中總皂苷含量×30%；綜合評(píng)分=次野鳶尾黃素轉(zhuǎn)移率評(píng)分+總皂苷含量評(píng)分。

表8　醇沉正交試驗(yàn)直觀分析

表9　醇沉正交試驗(yàn)方差分析

2.2.2結(jié)果分析 從表7～9可知，各影響因素順序?yàn)椋篊>B>D>A，方差分析結(jié)果表明，B因素對(duì)醇沉結(jié)果有顯著性影響，A因素、C因素和D因素對(duì)結(jié)果無(wú)顯著影響，故最佳醇沉工藝為A2B1C3D1。

2.3驗(yàn)證試驗(yàn)按清咽口服液處方稱(chēng)取藥材，最佳水提工藝進(jìn)行提取，即浸泡0.5 h，加10倍量水，提取3次，每次2 h，濾過(guò)，合并濾液，減壓濃縮，再按最佳醇沉工藝：藥液濃度1.0 g/mL，乙醇濃度為70%，15 ℃靜置12 h。結(jié)果見(jiàn)表10。

表10　醇沉精制工藝驗(yàn)證試驗(yàn)表

3　討論

咽炎屬于上呼吸道感染范疇，多為病毒感染，而現(xiàn)代醫(yī)學(xué)主要使用抗生素進(jìn)行治療，資料[8-9]表明，抗菌素既不能改變本病的病程和轉(zhuǎn)歸，也不能因此而有效地預(yù)防普通感冒的細(xì)菌性并發(fā)癥。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程的推進(jìn)，在傳統(tǒng)中藥基礎(chǔ)上研發(fā)的中藥新藥具有臨床療效好、起效時(shí)間快、服用方便、不良反應(yīng)少、價(jià)格優(yōu)廉等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)體現(xiàn)了中醫(yī)辨證論治、同病異治的特色，發(fā)揮了中醫(yī)藥的特色優(yōu)勢(shì)。同時(shí)，由于中藥復(fù)方成分非常復(fù)雜，同一藥材在不同復(fù)方中可能作用不同。研究在工藝設(shè)計(jì)時(shí)根據(jù)組方的功能主治，針對(duì)每味中藥在組方中君臣佐使的地位，查閱文獻(xiàn)分析其所含的有效成分、藥理作用，充分考慮其合理性，再根據(jù)提取原理和預(yù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，選擇適宜的準(zhǔn)備工藝路線。

清咽口服液處方中射干為君藥，含有次野鳶尾黃素，具有抗病毒、抗菌、消炎的作用[10]。通過(guò)控制君藥中的次野鳶尾黃素轉(zhuǎn)移率來(lái)考察制備工藝的可行性。此外，結(jié)合總皂苷轉(zhuǎn)移率(有效部位)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，其原因在于中藥復(fù)方制劑是多方位、多靶點(diǎn)共同作用的藥物，通過(guò)射干中次野鳶尾黃素和有效部位總皂苷進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，使制劑的藥效和質(zhì)量得到保證。同時(shí)，增加對(duì)有效部位的控制，對(duì)企業(yè)的質(zhì)量檢查、質(zhì)量控制，降低經(jīng)濟(jì)成本。

在水提工藝和醇沉過(guò)程中，首先對(duì)影響提取、純化的各個(gè)因素進(jìn)行了單因素考察，確定各個(gè)因素的水平范圍，再采用正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)對(duì)各個(gè)因素的交互作用進(jìn)行考察，篩選出清咽口服液的最佳水提工藝為10倍量水，浸泡0.5 h，提取3次，每次2 h；最佳醇沉工藝為藥液濃度1.0 g/mL，乙醇濃度為70%，15 ℃靜置12 h。

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