貴州芒果畸形病病原菌的分離與鑒定

趙玳琳，王 廿，卯婷婷，陶 剛

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，貴州 貴陽(yáng) 550006)

【研究意義】芒果(MangiferaindicaL)屬漆樹科(Anacardiaceae)芒果屬(Mangifera)，是世界第二大熱帶水果[1]。其在我國(guó)海南、云南、廣西、福建、廣東、四川、臺(tái)灣和貴州等熱帶及亞熱帶地區(qū)均有種植[2]。貴州省地處我國(guó)南亞熱帶北緣地區(qū)，是國(guó)家農(nóng)業(yè)部確定的全國(guó)9個(gè)南亞熱作省區(qū)之一，適宜南亞熱作生產(chǎn)的土地面積達(dá)108.9萬(wàn)hm2，芒果適宜種植區(qū)面積10.5萬(wàn)hm2，可發(fā)展種植面積5.3萬(wàn)hm2，優(yōu)勢(shì)區(qū)面積2.3萬(wàn)hm2，其中，南、北盤江及紅水河流域低海拔河谷地區(qū)(E104°14′～107°06′、N24°32′～25°52′)具備芒果種植的自然氣候及土壤條件[3]。芒果畸形病(mango malformation disease)是一種嚴(yán)重的世界性病害，1891年在印度首次被發(fā)現(xiàn)[4]，目前在非洲(埃及、南非、蘇丹、斯威士蘭和烏干達(dá))、美洲(巴西、薩爾瓦多、墨西哥、尼加拉瓜、委內(nèi)瑞拉和美國(guó)南部的佛羅里達(dá)州)、亞洲(印度、馬來(lái)西亞、緬甸、巴基斯坦和中國(guó)南部)、歐洲(西班牙南部)和中東(以色列和阿曼)等地廣泛分布[5-14]。在我國(guó)，芒果畸形病主要分布在云南和四川海拔較高的種植地區(qū)，且有進(jìn)一步蔓延的趨勢(shì)[15-17]。該病害主要引起營(yíng)養(yǎng)器官和花序畸形，致使花序坐果后不育或敗育而導(dǎo)致減產(chǎn)，平均產(chǎn)量損失達(dá)50 %～80 %，嚴(yán)重時(shí)絕產(chǎn)[18-19]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】芒果畸形病的病因在學(xué)術(shù)界一直存在爭(zhēng)論，病因主要包括生理失調(diào)[20-21]、營(yíng)養(yǎng)因素[22]、植原體[23]、病毒理論[24-25]、癭螨危害[26-27]和真菌侵染等[28-29]。自20世紀(jì)80年代以來(lái)，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明，該病主要由鐮刀菌(Fusariumspp.)引起，不同地區(qū)病原鐮刀菌種類有所不同，目前報(bào)道引起該病的病原菌主要有F.subglutinans、F.mangiferae、F.proliferatum、F.sterilihyphosum、F.mexicanum和F.tupiense[30-33]。【本研究切入點(diǎn)】黃海等[34]在貴州省興義市調(diào)查發(fā)現(xiàn)芒果畸形病的發(fā)生；貴州省植物保護(hù)研究所生物防治實(shí)驗(yàn)室于2016年3月在貴州省興義市南盤江地區(qū)芒果種植園調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病普遍發(fā)生，且對(duì)芒果的產(chǎn)量和品質(zhì)造成嚴(yán)重影響，但目前尚未見有關(guān)貴州芒果畸形病病原菌準(zhǔn)確鑒定的報(bào)道。因此，準(zhǔn)確分離和鑒定是該病害科學(xué)防控的關(guān)鍵?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)貴州省興義市山地芒果基地發(fā)生芒果畸形病的病原菌進(jìn)行分離、致病性測(cè)定、形態(tài)學(xué)觀察及rDNA-ITS序列分子系統(tǒng)學(xué)鑒定研究，以明確該病病原菌種類，為其科學(xué)有效防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

(1)病原菌。具有芒果畸形病典型癥狀的芒果花序，2016年3月采集于貴州省興義市南盤江鎮(zhèn)田房村山地芒果種植園(N 24°52′21″，E 104°58′53″)。

(2)培養(yǎng)基。馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)，馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDB)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 病原菌分離 采用方中達(dá)[35]的組織分離法分離病原菌。選取具有典型病害癥狀的芒果花序組織，用自來(lái)水輕輕沖洗干凈，在病健交界處切取面積約2 mm×2 mm的病害組織塊，用70 %的醫(yī)用酒精表面消毒20 s，再用5 % NaClO消毒30～60 s，無(wú)菌水沖洗3次，每次20 s，然后將組織塊接種于PDA培養(yǎng)基平板上，置于25 ℃、12 h光暗交替條件下培養(yǎng)，直至長(zhǎng)出菌落。取菌落邊緣的菌絲進(jìn)行繼代純化培養(yǎng)3代后保存于PDA斜面試管中，置4 ℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 致病性測(cè)定 (1)離體接種。采用健康的芒果果實(shí)進(jìn)行菌絲塊接種。果實(shí)經(jīng)70 %酒精表面消毒后用無(wú)菌水沖洗去除殘留酒精，置于鋪有濕潤(rùn)吸水紙的塑料盤中待用。將在PDA平板上25 ℃培養(yǎng)5 d后的病原菌菌落邊緣打取直徑為5 mm的菌絲塊接種于果實(shí)上，每個(gè)果實(shí)接種2塊，6次重復(fù)，以接種空白培養(yǎng)基塊作為對(duì)照，用保鮮膜封住塑料盤保濕，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中12 h光照條件培養(yǎng)，分別于接種后1、3、5和7 d觀察記錄果實(shí)發(fā)病情況。

(2)活體接種。采用分生孢子懸浮液接種。將分離純化的菌株菌絲塊在PDB培養(yǎng)液中常溫振蕩培養(yǎng)(160 r/min)，5 d后過(guò)濾除菌絲體，配置成濃度為106個(gè)/mL的分生孢子懸浮液，在3年生健康芒果花序上用噴壺噴灑分生孢子懸浮液，3次重復(fù)，以噴灑清水為對(duì)照。接種后觀察記錄花序發(fā)病情況。

1.2.3 病原菌再分離 從接種發(fā)病果實(shí)和花序病健交界處分別剪取約2 mm×2 mm的病組織，按照上述組織分離法對(duì)致病菌進(jìn)行再分離并進(jìn)行種類鑒定，完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.2.4 病原菌形態(tài)學(xué)觀察 將純化后的病原菌接種至PDA培養(yǎng)基，25 ℃黑暗培養(yǎng)5 d，觀察菌落及菌絲的顏色和形狀，鏡檢分生孢子的形狀、產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)及是否產(chǎn)生厚垣孢子等，分別測(cè)量50個(gè)大分生孢子和小分生孢子的大小，并顯微照相。參照文獻(xiàn)[36]的方法對(duì)分離病原物進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。

1.2.5 ITS 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 應(yīng)用CTAB法提取病原菌基因組DNA，利用真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)通用引物ITS1(5′-TCCGI.AGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)對(duì)病原菌rDNA上的ITS區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增[37]。ITS的PCR反應(yīng)體系：滅菌超純水9.5 μl，2×TaqPCR MasterMix 12.5 μl，ITS1 1 μl，ITS4 1 μl，DNA模板1 μl；擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性40 s，54 ℃退火40 s，72 ℃延伸60 s，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min，1.5 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，由上海生物工程股份有限公司測(cè)序。

通過(guò) Clustal-X 1.81軟件包[38]對(duì)所獲得的菌株MGXJB-1 ITS系列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中相似真菌ITS系列進(jìn)行比對(duì)，再運(yùn)用 BioEdit version 5.0.6對(duì)比對(duì)的結(jié)果進(jìn)行手工校正，采用PAUP* 4.0 beta 10 軟件對(duì)系列數(shù)據(jù)進(jìn)行最大簡(jiǎn)約法分析，以啟發(fā)式搜索獲得系統(tǒng)發(fā)育樹，應(yīng)用樹二等分再連接法作為啟發(fā)式搜索的算法。在系統(tǒng)進(jìn)化分析中堿基序列間空缺(Gaps)作為堿基缺失處理，所有堿基狀態(tài)視為無(wú)序，不加權(quán)處理，經(jīng)1000次重復(fù)計(jì)算自展檢驗(yàn)值標(biāo)記在分支上。

A:芒果畸形病害花序；B和D:致病性檢測(cè)的果實(shí)空白培養(yǎng)基對(duì)照和花絮清水對(duì)照；C和E:接種致病的果實(shí)和花序A.The inflorescence of mango infected with malformation disease; B and D.CK for fruit and CK for inflorescence; C and E.The fruit and inflorescence inoculated with pathogen MGXJB-1圖1 菌株MGXJB-1的致病性Fig.1 Pathogenicity of MGXJB-1 strain

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果畸形病的病原菌及其致病性

2.1.1 病原菌 從采集的具有典型畸形癥狀病株的芒果花序(圖1A)樣品中分離到2種不同菌落特征的真菌，命名為MGXJB類型菌株和MGXJBO類型菌株，從MGXJB類型真菌分離純化獲得菌株1株，編號(hào)為MGXJB-1；從MGXJBO類型真菌分離純化獲得菌株2株，編號(hào)為MGXJBO-1和MGXJBO-2。2種類型真菌分離率均為22.2 %。

2.1.2 致病性 對(duì)3株菌株的致病性進(jìn)行測(cè)定：①果實(shí)接種菌株MGXJBO-1和MGXJBO-2均未出現(xiàn)病害癥狀，而接種菌株MGXJB-1 3 d后即可發(fā)病，發(fā)病率為100 %，5 d后病斑擴(kuò)大，病斑為圓形水漬狀病斑(圖1 C)，空白對(duì)照組未發(fā)病(圖1B)。對(duì)接種發(fā)病果實(shí)病健交界處組織進(jìn)行分離發(fā)現(xiàn)，所得菌株與原接種菌株形態(tài)一致。②芒果花序接種菌株MGXJBO-1和MGXJBO-2不能致病，而接種菌株MGXJB-1 15 d左右植株花序即可發(fā)病，花軸變短變粗變褐，花序部分畸形，接種30 d左右，發(fā)病花序畸形并枯死(圖1 E)，噴灑清水對(duì)照組未發(fā)病(圖1 D)。取接種發(fā)病花序病健交界處組織分離獲得的菌株與原接種菌株形態(tài)一致。因此確定，MGXJB-1類型菌株為芒果畸形病的致病菌。

2.2 病原菌株MGXJB-1的形態(tài)學(xué)特征

菌株MGXJB-1在PDA培養(yǎng)基上25 ℃光暗交替培養(yǎng)5 d后菌落直徑達(dá)(5.38±0.07)cm，菌落呈圓形，邊緣整齊，基部無(wú)色素沉著，菌落背面略帶黃色(圖2A和圖2B)，氣生菌絲棉絮狀，顯微特征具有隔膜和分枝，分枝較細(xì)，直徑為 2～5 μm(圖2H)。產(chǎn)孢細(xì)胞著生于瓶狀小梗上，單瓶梗、雙瓶?；驈?fù)瓶梗，較長(zhǎng)，瓶狀小梗細(xì)小，近圓柱形(圖 2E～G)；PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生大量的大型分生孢子，大型分生孢子散生于分生孢子梗上，紡錘形至鐮刀形，兩端較鈍，頂細(xì)胞略彎曲，基細(xì)胞鈍圓形或足跟不明顯，整個(gè)孢子形態(tài)較短、較粗，多數(shù)具3～5個(gè)隔膜，大小為(30.01±2.93)μm×(5.73±0.66)μm(圖2D)；小型分生孢子數(shù)量較少，多假頭狀著生于單瓶梗上，多為卵圓形、腎形和柱形等，大多單胞，極少數(shù)有1個(gè)隔膜，大小為(8.22±1.69)μm×(4.38±0.82)μm(圖2C和圖2D)，培養(yǎng)過(guò)程未見厚垣孢子，未見有性態(tài)和菌核產(chǎn)生，形態(tài)學(xué)特征與腐皮鐮刀菌(F.solani)特征一致。

2.3 病原菌株MGXJB-1的ITS序列測(cè)定與系統(tǒng)發(fā)育學(xué)

通過(guò)PCR擴(kuò)增菌株MGXJB-1的ITS序列全長(zhǎng)，根據(jù)ITS系列構(gòu)建了鐮刀菌屬部分種類的分子系統(tǒng)發(fā)育樹(表1，圖3)。系統(tǒng)發(fā)育樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)中有2個(gè)鐮刀菌屬種的平行分支，其中，第一個(gè)平行分支包含2個(gè)近緣的鐮刀菌屬種類，病原分離物菌株MGXJB-1和腐皮鐮刀菌(F.solani)聚為一類(支持強(qiáng)度為88 %)，將其鑒定為腐皮鐮刀菌。同時(shí)，與F.equiseti相比，MGXJB-1和F.keratoplasticum有較近的親緣關(guān)系。菌株MGXJB-1在分子系統(tǒng)樹中與其他鐮刀菌屬種類的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系與形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果一致。

A～B:培養(yǎng)7 d的PDA菌落正面(A)和菌落背面(B)；C:小型分生孢子假頭狀著生于單瓶梗上；D:分生孢子；E～G:分別為大型分生孢子梗、單瓶梗(E)，雙瓶梗(F)，復(fù)瓶梗(G)；H:菌絲。標(biāo)尺=25 μmA-B.Front side(A) and reverse side(B) of colonies cultured on PDA after 7 d; C.False heads of microconidia grown on monophialides; D.Conidia; E-G.Monophialide(E)，double monophialides(F) and multphialide(G); H.Hyphae. Scale=25 μm圖2 菌株MGXJB-1的形態(tài)學(xué)特征Fig.2 Morphological characteristics of MGXJB-1 strain

菌株Strain種名Speciesname地理來(lái)源GeographicoriginGenBank登錄號(hào)GenBankaccessionNo.Zbf-R4F.solaniChinaKX079482G6F.solaniChinaMF800959TVD_Fungal-Culture132F.solaniCanadaKF494130Zbf-R15F.solaniChinaKX064991UOA/HCPFAB90F.keratoplasticumGreeceKC254052HSf5F.keratoplasticumSaudiArabiaKR425650ATS53F.keratoplasticumIndiaKY436176IFM63624F.keratoplasticumJapanURLLC184267IFM57371F.keratoplasticumJapanURLLC184241G328F.equisetiUSAKR094440286-09F.equisetiSerbiaJQ41210932F.equisetiSouthAfricaKY318493MM11F.equisetiSpainKX343174CPC26370F.sarcochroumNetherlandsLT746256

3 討 論

芒果畸形病由鐮刀菌引起，目前經(jīng)過(guò)柯赫氏法則驗(yàn)證的有F.subglutinans、F.mangiferae、F.proliferatum、F.sterilihyphosum、F.mexicanum和F.tupiense[30-33]。有研究報(bào)道，我國(guó)芒果畸形病病原菌主要有F.mangiferae和F.proliferatum，其他病原菌未見報(bào)道[39]。該研究對(duì)貴州省興義市的芒果畸形病病原菌進(jìn)行分離鑒定表明，該病原菌為F.solani。Liew等[40]在芒果植株中分離得到F.solani，但最后證明不是芒果畸形病致病病原菌。F.solani是一種世界性分布的真菌種類，其可以作為腐生菌普遍存在于土壤、植物病殘?bào)w內(nèi)，同時(shí)也能使許多植物致病，如侵染豆科植物(如黃豆、豌豆、豇豆、大豆等)和林木(如核桃、梨樹、國(guó)槐)引起植株根腐，還能侵染一些熱帶果樹造成潰瘍和頂端枯死癥狀，如鱷梨和柑橘[36,41-43]。該研究結(jié)果是國(guó)內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)F.solani能夠引起芒果畸形病害。

根據(jù)ITS序列構(gòu)建的最大簡(jiǎn)約樹，以F. sarcochroum為外群(TL=100，CI=0.98，HI=0.02，RI=0.99)，分支上顯示的是展檢驗(yàn)值等于或大于50 %(1000次重復(fù))The structured the maximum parsimony tree according to ITS sequence based on F. sarcochroum(TL=100，CI=0.98，HI=0.02，RI=0.99). The number on branches indicates the test value with equal to or greater than 50 %(1000 repetitions)圖3 菌株MGXJB-1與相關(guān)種的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of MGXJB-1 strain and related species

印度和墨西哥等國(guó)對(duì)芒果畸形病的流行特點(diǎn)研究表明，氣候條件與芒果畸形病的發(fā)生關(guān)系密切，氣溫較低的種植區(qū)發(fā)病較嚴(yán)重[39]。貴州氣候?qū)儆趤啛釒駶?rùn)季風(fēng)氣候，年平均氣溫15 ℃左右[44]，有利于該病害發(fā)生。喻群芳等[40]應(yīng)用 Max Net 3.3.3.e 和Arc GIS9.3軟件對(duì)芒果畸形病在中國(guó)的潛在適生區(qū)進(jìn)行預(yù)測(cè)表明，廣西、云南、海南、廣東、臺(tái)灣和貴州等省區(qū)均為該菌的潛在適生區(qū)。目前，我國(guó)只在進(jìn)口巴基斯坦芒果植物檢驗(yàn)檢疫要求中將芒果畸形病病原菌F.subglutinans列為檢疫性有害生物[39]。但該研究結(jié)果表明，F(xiàn).solani能夠引起芒果畸形病害，鑒于該病害傳入我國(guó)的風(fēng)險(xiǎn)高性，建議擴(kuò)大對(duì)芒果畸形病原種類如F.solani的檢疫，并加強(qiáng)檢疫措施，從而有效控制該病害的傳入和進(jìn)一步擴(kuò)散；同時(shí)，要積極開展芒果畸形病研究工作，建立芒果畸形病檢測(cè)和鑒定體系，結(jié)合我國(guó)國(guó)情制定相應(yīng)的監(jiān)測(cè)、檢疫及防控等相關(guān)方案，以達(dá)到及時(shí)發(fā)現(xiàn)與防控的目的。

4 結(jié) 論

貴州省興義市芒果畸形病害的病原菌為腐皮鐮刀菌(F.solani)，該病原菌為新發(fā)現(xiàn)的芒果畸形病致病菌。

致謝:在病害調(diào)查、試驗(yàn)材料采集和活體接種方面得到貴州省植物保護(hù)研究所葉照春和李鴻波老師的指導(dǎo)和幫助，特此感謝！

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