不同水平豌豆蛋白粉對高郵鴨生長及其相關(guān)激素與基因表達(dá)的影響

周根來，楊曉志，殷潔鑫，周明夏，左偉勇

(1.江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300；2.江蘇省現(xiàn)代畜牧與新獸藥工程技術(shù)中心，江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 泰州 225300)

【研究意義】作為我國重要的食用豆類之一，豌豆提取得到的淀粉、纖維和蛋白不僅可以作為食品工業(yè)原料，也可以用在紡織、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域[1-2]。豌豆蛋白粉是豌豆加工粉絲后的副產(chǎn)品之一，具有營養(yǎng)價(jià)值較高、價(jià)格較低、資源較豐富等優(yōu)勢，可以作為非常規(guī)蛋白飼料部分替代魚粉、豆粕等原料，其開發(fā)利用已逐漸得到重視。【前人研究進(jìn)展】如何合理利用豌豆蛋白粉需要廣泛深入的系統(tǒng)研究，但有關(guān)在豬、雞飼糧中的研究鮮見，也沒有在鴨飼糧中的研究報(bào)道。本團(tuán)隊(duì)前期研究表明豌豆蛋白粉可應(yīng)用于高郵鴨飼糧中，使用6 %豌豆蛋白粉代替部分豆粕未影響0～4周齡高郵鴨的主要養(yǎng)分消化率，有助于消化器官的發(fā)育，并促進(jìn)體內(nèi)蛋白質(zhì)和脂肪代謝。但其促生長的深層機(jī)制還未研究?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】本試驗(yàn)在0～4周齡高郵鴨飼糧中使用豌豆蛋白粉，研究其對鴨生長相關(guān)激素分泌及基因表達(dá)的影響?！緮M解決的關(guān)鍵問題】為豌豆蛋白粉有效應(yīng)用于鴨飼養(yǎng)實(shí)踐中提供理論機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及日糧

試驗(yàn)選取160只1日齡體質(zhì)健壯、體重接近的高郵鴨，隨機(jī)分為4組，每組4個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只鴨，公母各半。對照組(C0組)飼喂基礎(chǔ)飼糧，參照NRC(1994)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)以玉米—豆粕為基礎(chǔ)進(jìn)行配制；試驗(yàn)組(C1、C2、C3組)飼糧是在基礎(chǔ)飼糧的基礎(chǔ)上分別用3 %、6 %、9 %的豌豆蛋白粉代替豆粕配制而成，試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)期為28 d。試驗(yàn)鴨自由采食、充足飲水，按正常飼養(yǎng)程序進(jìn)行免疫接種、光照和飼喂。

表1 試驗(yàn)飼糧組成及營養(yǎng)水平(風(fēng)干基礎(chǔ))

注： 1)預(yù)混料為每千克飼糧提供: VA 15 000 IU，VD33200 IU，VE 12.5 IU，VK31.5 mg，VB14 mg，VB25 mg，VB62 mg，VB120.01 mg，生物素0.2 mg，葉酸0.5 mg，D-泛酸15 mg，煙酸65 mg，抗氧化劑100 mg，F(xiàn)e (as ferrous sulfate) 86 mg，Cu (as copper sulfate) 8 mg，Zn (as zinc sulfate) 90 mg，Mn (as manganese sulfate) 80 mg， I (as potassium iodide) 0.42 mg，Se (as sodium selenite) 0.3 mg。2)代謝能、氨基酸為計(jì)算值，其余為實(shí)測值。

Note: 1)The premix provided the following per kg of diets: VA 15 000 IU, VD33200 IU, VE 12.5 IU, VK31.5 mg, VB14 mg, VB25 mg, VB62 mg, VB120.01 mg, biotin 0.2 mg, folic acid 0.5 mg, D-pantothenic acid 15 mg, nicotinic acid 65 mg, antioxidant 100 mg, Fe (as ferrous sulfate) 86 mg, Cu (as copper sulfate) 8 mg, Zn (as zinc sulfate) 90 mg, Mn (as manganese sulfate) 80 mg, I (as potassium iodide) 0.42 mg, Se (as sodium selenite) 0.3 mg; 2) ME and AA were calculated values, while the others were measured values.

1.2 樣品采集與處理

血清樣品：28日齡時(shí)，每重復(fù)隨機(jī)選取2只鴨進(jìn)行翅靜脈采血5 mL，靜置30 min，在3000 r/min低溫下離心10 min 取上清液裝至凍存管中，于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

肌肉組織樣品：28日齡時(shí)，每重復(fù)隨機(jī)選取1只鴨進(jìn)行屠宰采樣。試驗(yàn)鴨放血致死后，迅速采集每只鴨的胸肌和腿肌組織樣本各1個(gè)，各肌肉組織樣品立即放入液氮中速凍，實(shí)驗(yàn)室-70 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 生長性能 在第1和28日齡時(shí)分別對各重復(fù)試驗(yàn)鴨群體進(jìn)行空腹稱重，用于計(jì)算各處理鴨的平均日增重ADG(g/d)。試驗(yàn)期間，記錄每天每重復(fù)試驗(yàn)鴨的飼糧飼喂量，每1周統(tǒng)計(jì)每重復(fù)的剩料量，計(jì)算各處理鴨的平均日采食量ADFI(g/d)。根據(jù)每重復(fù)試驗(yàn)鴨的ADG和ADFI計(jì)算各處理鴨的料重比(F/G)。記錄鴨只死亡體重，以校正鴨只的耗料及其他指標(biāo)。

1.3.2 血清激素水平測定 鴨血清樣品中生長激素(GH)、胰島素(Insulin)、胰島素樣生長因-1(IGF-1)和瘦素(Leptin)水平采用放射性免疫法測定，測定所用試劑盒購自上海滬宇生物科技有限公司。

1.3.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)NCBI公布的禽類GH1(101790997)、Insulin(101794427)、IGF-I(101793597)、Obese(AY555727.1)和β-actin(101800437)的基因序列，采用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列見表2。

1.3.4 RNA提取與反轉(zhuǎn)錄 采用Trizol法提取鴨胸肌和腿肌組織中的總RNA。用分光光度計(jì)測定OD260/OD280的比值以檢測RNA的純度，再用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA的質(zhì)量，-70 ℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄體系為20 μl：10 μl 2×RT buffer，1 μl 6N 隨機(jī)引物(100 pmol/μl)，1μl RT-mix，5 μl RNA模板，3 μl DEPC水。反應(yīng)孵化條件為25 ℃ 10 min，42 ℃ 50 min，85 ℃ 5 min，反應(yīng)結(jié)束后短暫離心，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系50 μl：cDNA 2 μl，上、下游引物(25 pmol/μl)各1 μl，2×PCR buffer 25 μl，Sybr green I 0.5 μl，DEPC水20.5 μl。反應(yīng)程序：94 ℃ 4 min，94 ℃ 20 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s循環(huán)35次，72 ℃檢測信號。每個(gè)樣品3個(gè)重復(fù)的檢測，以內(nèi)參基因β-actin作對照，記錄各樣品的Ct值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

實(shí)時(shí)熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCt法表示試驗(yàn)組目的基因的相對表達(dá)量[3]，其中△Ct=Ct(目的基因)-Ct(內(nèi)參基因)，△△Ct=△Ct(試驗(yàn)組)-△Ct(對照組)。應(yīng)用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析各組數(shù)據(jù)，采用One-way ANOVA方差分析，LSD法進(jìn)行多重比較。各處理結(jié)果用平均值(mean)±標(biāo)準(zhǔn)差(SD)表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 鴨生長性能的比較

豌豆蛋白粉對鴨日增重、日采食量和料重比的影響見表3，C1和C3平均日增重極顯著低于C0(P<0.01)，C2日增重顯著低于C0(P<0.05)，其中C3比C0要低23.22 %。3個(gè)試驗(yàn)組的平均日采食量隨豌豆蛋白粉添加比例的增加呈下降趨勢，C1和C3都極顯著低于C0(P<0.01)，C2顯著低于C0(P<0.05)，其中C3采食量降低最多，比C0低24.57 %。C2和C3料重比要低于C0，但差異不顯著(P>0.05)，C1的料重比相對于C0高0.22，且差異顯著(P<0.05)。

表2 目的基因及β-actin的引物序列

表3 豌豆蛋白粉對鴨生長性能的影響

注: 相同指標(biāo)，不同大小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和差異顯著(P<0.05)。下同。

Note: In the same line, different capital or small letters mean significant difference at 0.01 or 0.05 levels．The same as below.

表4 豌豆蛋白粉對鴨血清激素水平的影響

2.2 鴨血清激素水平的比較

豌豆蛋白粉對4周齡高郵鴨血清激素水平的影響見表4。C2、C3的胰島素樣生長因子-I IGF-I水平顯著高于試驗(yàn)組C1(P<0.05)，同時(shí)也高于C0但差異不顯著(P>0.05)。豌豆蛋白粉對生長激素GH、胰島素Insulin和瘦素Leptin3種激素水平的影響不顯著，各試驗(yàn)組之間、以及與對照組之間沒有顯著差異(P>0.05)。

2.3 鴨生長相關(guān)基因表達(dá)量的比較

豌豆蛋白粉對4周齡高郵鴨胸肌、腿肌中生長基因GH、肥胖基因Obese、胰島素基因Insulin和 胰島素樣生長因子基因IGF-I4種與生長發(fā)育相關(guān)基因mRNA表達(dá)量的影響分別見圖1～2。

相同基因不同處理不同大小寫字母分別表示差異極顯著(P<0.01)和差異顯著(P<0.05)。下同In the same gene, different capital or small letters mean significant difference at 0.01 or 0.05 levels. The same as below圖1 豌豆蛋白粉對鴨胸肌中生長相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.1 Effects of pea gluten meal on the expression of genes related to growth in the breast muscles of ducks

試驗(yàn)組腿肌中GH表達(dá)量均不同程度高于對照組，但差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)組胸肌中GH表達(dá)量與C0差異不顯著，C2胸肌GH表達(dá)量最高，達(dá)到C0的1.5倍，同時(shí)極顯著高于C1(P<0.01)。C2和C3胸肌中Obese表達(dá)量要高于C0，但差異不顯著(P>0.05)；試驗(yàn)組腿肌中Obese表達(dá)量也高于C0，其中C2組要顯著高于C0(P<0.05)。試驗(yàn)組胸肌和腿肌中Insulin表達(dá)量(除C1組腿肌)均不同程度地高于C0，但差異不顯著(P>0.05)。C2、C3組胸肌和腿肌中IGF-I表達(dá)量均高于對C0組，但胸肌中差異不顯著(P>0.05)，腿肌中C2表達(dá)量要顯著高于C0(P<0.05)。

3 討 論

3.1 對鴨生長性能的影響

豌豆蛋白粉作為非常規(guī)飼料資源，其各種營養(yǎng)成分含量接近于大豆粕，可用作植物性蛋白質(zhì)飼料。但與其他飼料相比，豌豆蛋白粉含有抗原蛋白、凝集素等抗?fàn)I養(yǎng)因子，同時(shí)含有多酚類物質(zhì)，具有一定的苦澀味，影響其適口性[4-5]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，豌豆蛋白粉替代豆粕降低了鴨的平均日增重和日采食量，這是由于豌豆蛋白粉抗?fàn)I養(yǎng)因子和適口性的影響，特別是其添加比例為9 %時(shí)下降最明顯。李金喜在肉雞生產(chǎn)中的應(yīng)用研究表明豌豆蛋白粉的使用降低了試驗(yàn)雞的增重和采食量，但對料重比沒有顯著影響[6]，這也與本試驗(yàn)研究基本一致。各試驗(yàn)鴨的料重比除了3 %組顯著高于豆粕組，其余試驗(yàn)組與豆粕組差異不顯著，結(jié)合增重和采食量2個(gè)指標(biāo)，表明在3種豌豆蛋白粉使用量中添加6 %豌豆蛋白粉時(shí)鴨的養(yǎng)分利用效率最高。使用豌豆蛋白粉明顯降低了畜禽采食量和日增重兩個(gè)重要的生長性能指標(biāo)，但考慮到豌豆為非轉(zhuǎn)基因食品和非過敏源、豌豆蛋白粉價(jià)格對于豆粕，加之試驗(yàn)表明6 %豌豆蛋白粉組的料重比要高于豆粕組，因此豌豆蛋白粉替代豆粕后可以保障動(dòng)物產(chǎn)品安全、降低飼養(yǎng)成本。

圖2 豌豆蛋白粉對鴨腿肌中生長相關(guān)基因表達(dá)的影響Fig.2 Effects of pea gluten meal on the expression of genes related to growth in the leg muscles of ducks

3.2 對鴨生長相關(guān)激素分泌及基因表達(dá)的影響

畜禽生長發(fā)育是一個(gè)極其復(fù)雜的生理過程，受到品種、營養(yǎng)、環(huán)境、飼養(yǎng)管理及動(dòng)物疾病等多個(gè)因素的影響和控制。其中，營養(yǎng)等外在因素會(huì)通過調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌激素的水平而影響畜禽生長，也會(huì)調(diào)控機(jī)體的基因表達(dá)量以影響畜禽的生長代謝。

生長激素(growth hormone, GH)位于“下丘腦—垂體—靶器官”生長軸的中心環(huán)節(jié)，是由腦垂體前葉合成和分泌的一種蛋白質(zhì)激素。生長激素具有促進(jìn)動(dòng)物肌肉和骨骼等組織生長、調(diào)節(jié)機(jī)體新陳代謝、促進(jìn)蛋白質(zhì)合成和脂肪分解的生理功能。有研究表明，垂體中GH合成與血液中GH含量隨相對生長率的下降而降低，GH水平與禽類相對生長速度呈正相關(guān)，對促生長有積極意義[7]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，使用豌豆蛋白粉或豆粕后GH分泌沒有差異，表明豌豆蛋白粉不影響鴨的GH分泌。GH基因是一種重要的與生長發(fā)育相關(guān)的功能基因。已有研究通過基因敲除、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)驗(yàn)證了GH基因與畜禽生長和生產(chǎn)性能有關(guān)[8]。本研究表明，豌豆蛋白粉的使用對鴨肌肉中GH基因的表達(dá)沒有影響，但添加6 %的豌豆蛋白粉后鴨胸肌中GH表達(dá)量達(dá)豆粕組的1.5倍。這一結(jié)果提示適當(dāng)使用豌豆蛋白粉具有促進(jìn)鴨生長發(fā)育的潛力。GH發(fā)揮生理作用主要通過兩種方式：一是作用于肝臟等靶器官，通過結(jié)合GH受體介導(dǎo)產(chǎn)生IGF-I，IGF-I再以內(nèi)分泌方式進(jìn)入血液，與結(jié)合蛋白結(jié)合后到達(dá)靶器官，作用于胰島素樣生長因子受體，從而調(diào)節(jié)畜禽生長發(fā)育；二是直接作用于靶器官的GH受體，通過旁分泌或自分泌IGF-I來直接影響細(xì)胞的代謝或調(diào)節(jié)組織器官的發(fā)育，從而調(diào)節(jié)生長發(fā)育[9-10]。胰島素樣生長因子-I(Insulin-like growth factor-I, IGF-I)與GH同為調(diào)控畜禽生長發(fā)育的重要因子，可由肝臟、肌肉等多個(gè)組織產(chǎn)生，從而發(fā)揮自分泌、旁分泌作用[11]。研究表明，IGF-I具有促進(jìn)組織細(xì)胞的發(fā)育、增殖和分化的作用，以促進(jìn)畜禽的生長發(fā)育[12]。本研究發(fā)現(xiàn)6 %豌豆蛋白粉可顯著提高鴨腿肌中IGF-ImRNA表達(dá)量，提示鴨體內(nèi)GH主要通過第二種方式直接作用于肌肉組織，介導(dǎo)IGF-I的分泌以促進(jìn)鴨生長發(fā)育。

胰島素(Insulin)是由胰腺分泌的一類代謝調(diào)控的激素，具有促進(jìn)糖原、蛋白質(zhì)和脂肪合成的作用。作為調(diào)節(jié)糖代謝最重要的激素，能降低畜禽體內(nèi)血糖水平。本研究結(jié)果顯示，豌豆蛋白粉使用后對鴨Insulin激素水平和肌肉基因表達(dá)量沒有影響，這也進(jìn)一步驗(yàn)證了之前研究中豌豆蛋白粉對鴨血清葡萄糖水平?jīng)]有影響的結(jié)論。瘦素(Leptin)作為肥胖基因(Obese)的表達(dá)產(chǎn)物，是由脂肪組織特異分泌的蛋白類激素，可傳遞信號給下丘腦以調(diào)控畜禽攝食行為和機(jī)體能量代謝、減少體內(nèi)脂肪蓄積[13]。本研究結(jié)果表明，使用6 %豌豆蛋白粉的鴨腿肌中Obese表達(dá)量顯著高于豆粕組的鴨，這也從分子層面解釋了前期研究中6 %豌豆蛋白粉鴨血清甘油三酯水平提高以降低脂肪組織沉積的原因。

4 小 結(jié)

使用豌豆蛋白粉替代豆粕影響到高郵鴨的平均日增重和日采食量，但6 %豌豆蛋白粉組的料重比顯著低于豆粕組，表明其養(yǎng)分利用率最高。使用豌豆蛋白粉對高郵鴨血清中GH、Insulin、Leptin、IGF-I4種激素的水平?jīng)]有顯著影響。使用豌豆蛋白粉對高郵鴨肌肉中Insulin表達(dá)沒有顯著影響，GH、IGF-I和Obese3個(gè)基因的表達(dá)普遍上調(diào)。試驗(yàn)組中6 %豌豆蛋白粉基因表達(dá)成績最佳，該組GH表達(dá)量最高，腿肌中IGF-I和Obese的表達(dá)量顯著高于對照組，可部分揭示其促生長的分子機(jī)制。

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