花生莖線蟲對(duì)花生根的趨向、定位及侵染特性

鄧明雪, 肖　順, 王文玉, 程　曦, 程　敏, 侯翔宇, 張紹升, 劉國(guó)坤

(福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002)

花生莖線蟲(Ditylenchusarachis)是近年來在我國(guó)山東省、河北省花生產(chǎn)區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種莖線蟲新種，主要為害花生果莢、種皮[1]，是除非洲莖線蟲(D.africanus)[2]外又一種可侵染花生并造成嚴(yán)重危害的莖線蟲.花生植株受侵染后，主要表現(xiàn)為根系發(fā)育不良、稀疏，根瘤菌較少，結(jié)莢量低，果莢表面出現(xiàn)黑褐色腐爛斑，種皮變褐皺縮[1,3-4].花生莖線蟲主要在遺落田間的病果莢或種皮上以脫水休眠的方式越冬，或以卵在病果莢或種皮上越冬[1]；第二年春季，土壤中越冬后的花生莖線蟲或卵孵化后的幼蟲，需遷移至寄主花生根系特定部位，并侵入根系進(jìn)行取食和發(fā)育，種群擴(kuò)大后再轉(zhuǎn)移至土壤中，侵染花生扎入土壤中的果針、發(fā)育中的果莢，最后再轉(zhuǎn)移至種皮進(jìn)行為害.但目前花生莖線蟲對(duì)花生根系的趨向、定位及侵染特性尚不明確，因此，本研究通過室內(nèi)試驗(yàn)，利用Pluronic F-127膠體系統(tǒng)接種[5]及次氯酸鈉—酸性品紅染色法對(duì)此進(jìn)行研究，為進(jìn)一步開展防控工作提供理論依據(jù).

1　材料與方法

1.1　供試線蟲種群及培養(yǎng)

供試的花生莖線蟲種群DCPXT為模式線蟲，采自河北省刑臺(tái)市花生果莢[1]，種群保存于福建農(nóng)林大學(xué)生物農(nóng)藥與化學(xué)生物學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室.將用于接種試驗(yàn)的花生莖線蟲采用胡蘿卜愈傷組織培養(yǎng)方法[3]培養(yǎng)30 d左右，線蟲包含不同齡期，數(shù)量大.將愈傷組織稍剪碎，靜置于無菌水中，1～2 h后線蟲游出，采用改良貝爾曼漏斗法收集線蟲，并離心濃縮，配制成適合濃度的花生莖線蟲懸浮液，備用.

1.2　花生莖線蟲對(duì)花生苗期根系的侵染

1.2.1供試花生品種及育苗供試的花生品種為冀油7號(hào).取健康飽滿花生種子，用0.3% NaOCl溶液消毒5 min，用無菌水充分淋洗3次以上，轉(zhuǎn)移并均勻排列至裝有適量無菌水的育苗盤上，育苗盤放在28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)至露白.將經(jīng)過180 ℃高溫滅菌2 h的砂土(沙子∶壤土∶營(yíng)養(yǎng)土=3∶1∶1)裝入?=6 cm的紙杯中，將上述露白的種子種入其中，將紙杯集中放到托盤上，置于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光照∶黑暗=16 h∶8 h，光照度為66%).

1.2.2花生莖線蟲的接種待紙杯中的花生真葉展開后，在花生植株根系周邊用藍(lán)色槍頭戳6個(gè)1 cm左右深的小孔，用移液槍吸取1 mL花生莖線蟲懸浮液(5 000條·mL-1),緩慢將線蟲液均勻地接種到小孔中，最后把小孔輕輕蓋平.接種后的培養(yǎng)條件同1.2.1.

1.2.3花生莖線蟲對(duì)花生苗的侵染情況測(cè)定接種花生莖線蟲后6、8、12、24、48、72、96、120 h依次從托盤中取出3株花生苗，用自來水輕輕沖洗掉根系表面雜質(zhì)，利用改良次氯酸鈉—酸性品紅染色法對(duì)根系進(jìn)行染色[6].根組織內(nèi)線蟲的觀察以酸性甘油為浮載劑，在體視顯微鏡(Nikon SMZ18，含照相系統(tǒng))下進(jìn)行, 統(tǒng)計(jì)根系線蟲的侵入量，觀察線蟲侵染和遷移情況.

1.3　花生莖線蟲對(duì)花生離體根的侵染

1.3.1供試花生品種及育苗供試花生品種為冀油7號(hào).消毒、淋洗方法同1.2.1，在育苗盤中催芽，待其萌發(fā)后，置于28 ℃光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(光照∶黑暗=16 h∶8 h，光照度為66%)，至花生長(zhǎng)出白色健壯長(zhǎng)達(dá)1或5 cm左右的花生根系，備用.

1.3.2Pluronic F-127膠體配制采用Pluronic F-127三維膠系統(tǒng)[5,7]開展花生莖線蟲對(duì)根的趨向試驗(yàn).稱取23 g Pluronic F-127(sigma, USA)顆粒溶解于80 mL 4 ℃預(yù)冷的無菌水中，置于4 ℃環(huán)境下24 h以上，使顆粒充分溶解，配制成100 mL 23% Pluronic F-127膠體(pH=7.0)，置于4 ℃冰箱中備用.這種膠體在低溫條件(<15 ℃)下呈液態(tài)，而在較高的溫度(>15 ℃)下則凝固成膠體狀.

1.3.3花生莖線蟲對(duì)花生根尖部位的趨向性測(cè)定采用爪哇根結(jié)線蟲(Meloidogynejavanica)作為陽性對(duì)照.爪哇根結(jié)線蟲種群在實(shí)驗(yàn)室的番茄(Solanumlycopersicum)根系上繁育.從番茄根系根結(jié)處挑取新鮮卵囊到無菌水中，28 ℃下黑暗孵育，每隔24 h收集一次新孵化的2齡幼蟲(J2)，最后將線蟲液離心濃縮，備用.

在10 ℃環(huán)境下，吸取Pluronic F-127膠體液3 mL于無菌的?=3.5 cm的一次性塑料培養(yǎng)皿中，并加入上述線蟲濃縮懸浮液(花生莖線蟲和爪哇根結(jié)線蟲J2)，輕搖混勻，皿內(nèi)最終線蟲濃度為800條·mL-1.剪取新鮮的長(zhǎng)1 cm的花生根系，平置于上述含有線蟲的液態(tài)膠體中，每皿放置1條，用parafilm膜封住培養(yǎng)皿，轉(zhuǎn)移至28 ℃黑暗培養(yǎng)箱中培養(yǎng).花生莖線蟲和爪哇根結(jié)線蟲J2各設(shè)置25皿.培養(yǎng)0、3、6、9和12 h后，隨機(jī)取出5皿，在Nikon SMZ18體視顯微鏡(含照相系統(tǒng))下觀察線蟲趨向行為，拍照并統(tǒng)計(jì)1 cm長(zhǎng)的根尖周邊2 mm內(nèi)聚集的線蟲數(shù)目.培養(yǎng)24 h后取5條根系，利用改良次氯酸鈉—酸性品紅染色法進(jìn)行染色，以酸性甘油為浮載劑，統(tǒng)計(jì)根系內(nèi)線蟲的侵入量.

1.3.4花生莖線蟲對(duì)花生根定位及侵染特性測(cè)定10 ℃環(huán)境下，在?=7.5 cm的一次性無菌培養(yǎng)皿中加入10 mL Pluronic F-127膠體(含線蟲800條·mL-1)，并加入花生莖線蟲濃縮懸浮液.取長(zhǎng)5 cm左右(帶10條左右新側(cè)根)的健康花生根，采用3種處理方式進(jìn)行研究.處理1：將健康花生根平放入膠體中，每皿放1條花生根，目的是觀測(cè)花生莖線蟲對(duì)根的趨向部位.處理2：采用消毒的鋒利刀片在健康花生根表面隔一定距離劃一個(gè)微小傷口(深約200 μm)，每皿放1條花生根，目的是觀測(cè)根表面微小傷口對(duì)花生莖線蟲的吸引情況.處理3：采用消毒的鋒利刀片橫切花生根段，每段1 cm左右，形成切面?zhèn)冢棵蠓?條花生根段，目的是觀測(cè)根橫切面?zhèn)趯?duì)花生莖線蟲的吸引情況.將各處理根轉(zhuǎn)移到28 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng).分別在膠體凝固后0、3、6、9和12 h，觀察線蟲對(duì)根的趨向部位，統(tǒng)計(jì)側(cè)根基部及微小傷口、橫切面?zhèn)谔幍木€蟲數(shù)目；隨后在每個(gè)處理中隨機(jī)取5條根系(0 h除外)進(jìn)行改良次氯酸鈉—酸性品紅染色，統(tǒng)計(jì)各處理部位侵入的線蟲量.

1.4　數(shù)據(jù)分析

采用Excel軟件對(duì)所有數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，用SPSS 19.0軟件進(jìn)行單因素方差分析.

2　結(jié)果與分析

2.1　花生莖線蟲對(duì)花生幼苗根系的侵染特性

花生莖線蟲盆栽接種6 h后，取花生根系進(jìn)行染色，未發(fā)現(xiàn)線蟲侵入；8 h后，在根系中可見少量線蟲侵入薄壁組織，每條根平均線蟲侵入量為7.8條；12、24、48、72 h侵染數(shù)量逐漸增多(每條根平均線蟲侵入量分別為12.5、15.4、47.2、73.4條)；96 h時(shí)根內(nèi)線蟲侵入量為80.6條，且根內(nèi)可見線蟲卵，說明受精雌蟲可侵入花生根系并在根內(nèi)產(chǎn)卵(圖1A，B)；120 h時(shí)根內(nèi)線蟲量達(dá)到高峰，平均達(dá)133.5條·根-1(圖1C)，最多可達(dá)220條·根-1.在不同時(shí)期，根內(nèi)均可見到不同齡期的幼蟲或成蟲，表明其幼、成蟲均可侵染花生根系；在不同時(shí)期，花生根尖(含根冠1 cm左右)均未發(fā)現(xiàn)花生莖線蟲，但在靠近莖基部處或與側(cè)根生長(zhǎng)相接的主根內(nèi)線蟲量較大.

A.接種后96 h的根；B.接種后96 h的根,含有線蟲卵；C.接種后120 h的莖基部.圖1　接種花生莖線蟲后的盆栽花生根系(標(biāo)尺=250 μm)Fig.1　Potted peanut roots after inoculation of D.arachis (scale bar=250 μm)

2.2　花生莖線蟲對(duì)花生離體根的趨向、定位及侵染特性

2.2.1花生莖線蟲對(duì)花生根尖的趨向性在Pluronic F-127膠體系統(tǒng)中，通過體視顯微鏡觀察可知，在剛放入根尖時(shí)，線蟲隨機(jī)均勻地分散在膠體中，根尖周圍線蟲數(shù)量為9.84條；6、9、12 h觀察的線蟲數(shù)量分別為10.3、10.3、10.7條，無顯著差異，也未見線蟲向根尖游動(dòng)聚集的現(xiàn)象(圖2A-C).通過改良次氯酸鈉—酸性品紅染色法對(duì)花生根尖組織進(jìn)行染色可見，在接種24 h后，只有極少數(shù)花生莖線蟲在根冠表皮處被發(fā)現(xiàn)(圖2D).這表明花生莖線蟲對(duì)花生1 cm長(zhǎng)的根尖無趨向性.

A-D.花生莖線蟲；E-H.爪哇根結(jié)線蟲J2.圖2　Pluronic F-127膠體中花生莖線蟲和爪哇根結(jié)線蟲J2對(duì)花生根尖的趨向性(標(biāo)尺=500 μm)Fig.2　Tropism of D.arachis and M.javanica J2 to peanut root tips in Pluronic F-127 gel (scale bar=500 μm)

陽性對(duì)照爪哇根結(jié)線蟲J2對(duì)花生根尖具有明顯的趨向性.0 h時(shí)，J2隨機(jī)均勻地分散在膠體中，根尖周圍線蟲數(shù)量為10.2條；3 h后可看到J2以曲線運(yùn)動(dòng)方式向根尖分生區(qū)遷移(35.2條)；6 h時(shí)大量線蟲聚集到根尖分生區(qū)(圖2E)，線蟲平均數(shù)量為60.3條；9 h時(shí)線蟲聚集到分生區(qū)的數(shù)量達(dá)到頂峰，J2平均數(shù)量達(dá)到85條(圖2F)，與其他時(shí)間的線蟲數(shù)量存在顯著差異(α=0.05)；12 h時(shí)根尖周圍J2平均數(shù)量為62.5條(圖2G)，數(shù)量降低可能與部分J2侵入根內(nèi)有關(guān).在觀察過程中未見J2遠(yuǎn)離根尖游動(dòng)的現(xiàn)象.每個(gè)時(shí)期根冠處吸引的線蟲量不多(圖2E-G).接種24 h后花生根尖組織染色表明，J2大量侵入根系中，聚集在根尖分生區(qū)與伸長(zhǎng)區(qū)(圖2H).

2.2.2花生莖線蟲對(duì)花生根的定位及侵染特性在處理1中，花生莖線蟲對(duì)花生根(5 cm，含新長(zhǎng)出的側(cè)根)的趨向部位與2.1和2.2.1試驗(yàn)結(jié)果一致.在接種12 h內(nèi)，健康花生根尖對(duì)花生莖線蟲沒有吸引作用，周邊線蟲也沒有向根尖游動(dòng)的趨勢(shì)；但是側(cè)根基部對(duì)花生莖線蟲具有明顯吸引作用(圖3A-C).在接種3、6 h時(shí)，側(cè)根基部吸引的線蟲量顯著增大，到9、12 h時(shí)線蟲總數(shù)稍下降(圖4)，側(cè)根基部的線蟲聚集成團(tuán)(圖3A).通過對(duì)根系染色發(fā)現(xiàn)，側(cè)根基部的主根處線蟲量在12 h內(nèi)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)(圖5).線蟲從側(cè)根基部侵入后，在根內(nèi)上下遷移(圖3B，C)；但側(cè)根基部以外的其他部位未見線蟲侵入.這表明側(cè)根基部是花生莖線蟲在完整根段上最主要的侵入位點(diǎn)；前6 h線蟲被大量吸引，后由于線蟲侵入根內(nèi)，側(cè)根基部聚集的線蟲量下降.

A.線蟲在花生側(cè)根基部聚集；B.側(cè)根基部的主根組織內(nèi)有線蟲侵入；C.線蟲從側(cè)根基部侵入并上下遷移；D.線蟲聚集于根表面的微傷口處；E、F.從花生根表面微傷口侵入的線蟲在根內(nèi)遷移；G.線蟲聚集于根冠破損處但未向上遷移；H.根橫切面?zhèn)谔幱芯€蟲聚集；I、J.從根橫切面?zhèn)谔幥秩氲木€蟲數(shù)量少，而從側(cè)根處侵入的線蟲數(shù)量多.圖3　花生莖線蟲對(duì)花生側(cè)根基部、人為微傷口、橫切面?zhèn)诘内呄蚣扒秩?A、F標(biāo)尺=2000 μm，B-E、G-J標(biāo)尺=500 μm)Fig.3　Tropism and infection of D.arachis to the lateral root base, artificial micro-wounds and transverse section wounds on peanut root (scale bar of A and F=2000 μm, scale bar of B-E, G-J=500 μm)

柱上不同小寫字母表示同一部位在不同時(shí)間的線蟲量在0.05水平上存在顯著差異.圖4　側(cè)根基部、根系小傷口及切面?zhèn)谔幓ㄉo線蟲的數(shù)量Fig.4　Number of D.arachis on lateral root base and artificial micro-wounds and transverse section wounds on peanut root

在處理2中，接種3 h時(shí)發(fā)現(xiàn)線蟲向微傷口移動(dòng)，6 h時(shí)微傷口處的線蟲量達(dá)到最高點(diǎn)，9、12 h時(shí)線蟲總數(shù)稍下降，表明線蟲已向根系侵入(圖4).在根段微傷口處，可見大量線蟲聚集，并呈侵入狀態(tài)(圖3D)；接種12 h后，根系染色可發(fā)現(xiàn)大量線蟲已從微傷口侵入并上下遷移(圖3E，F(xiàn)).這表明微傷口是花生莖線蟲趨向并聚集侵染的部位.根冠區(qū)域如果沒有傷口，未見線蟲侵入(圖3B)；但如果有小傷口，則可看到花生莖線蟲聚集在根冠處，集中侵染于根冠內(nèi)，但未見其在根內(nèi)向上遷移(圖3G).根內(nèi)侵入的線蟲量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)不斷增多，但在同一時(shí)間段低于側(cè)根處侵入的線蟲量(圖5).

在處理3中，通過人為橫切根造成大的切面?zhèn)?，觀測(cè)發(fā)現(xiàn)切面?zhèn)谕瑯幽芪ㄉo線蟲聚集(圖3H)，其聚集數(shù)量在12 h內(nèi)隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而上升；但在同一時(shí)間段，其聚集的數(shù)量顯著小于側(cè)根基部和微傷口處聚集的線蟲數(shù)量(圖4).通過染色觀察發(fā)現(xiàn)，從切面?zhèn)谇秩氲木€蟲量很少(圖3I, J)，在同一時(shí)間段顯著小于從側(cè)根基部和微傷口侵入的線蟲數(shù)量(圖5).

3　討論

線蟲主要靠頭部化感器感應(yīng)植物根部或根際微生物所釋放的水溶性或有氣味的化學(xué)信號(hào)物質(zhì)而趨向并定位寄主根部特定位置[7].植物的根系中含有許多化學(xué)物質(zhì)，如氨基酸類、多糖類、蛋白質(zhì)類、多種萜烯類和植物激素，都可能參與到對(duì)植物寄生線蟲的吸引作用中，并且不同線蟲的趨向物質(zhì)存在差異[7].本研究發(fā)現(xiàn)，花生莖線蟲對(duì)花生根系的趨向部位及侵染位點(diǎn)與爪哇根結(jié)線蟲J2存在明顯的差異.J2對(duì)根尖部位具有明顯趨向性，其侵染位點(diǎn)位于根冠后部的細(xì)胞分生區(qū)或伸長(zhǎng)區(qū)，這與內(nèi)寄生定居型線蟲2齡幼蟲，如根結(jié)線蟲(Meloidogynespp.)、孢囊線蟲(Heteroderaspp.)侵入部位[8-12]一致；而花生莖線蟲對(duì)花生根尖并無明顯的趨性，對(duì)側(cè)根基部或微傷口具有明顯的趨向性.由于側(cè)根起源于母根的中柱鞘，經(jīng)分裂、分化形成生長(zhǎng)點(diǎn)和根冠，側(cè)根在突破母根時(shí)形成的擠壓力會(huì)造成母根處形成微傷口[13]，花生莖線蟲可能被微傷口處“泄漏”的植物組織分泌物所吸引，并從微傷口侵入.花生主根橫切面大傷口雖對(duì)花生莖線蟲有吸引作用，但線蟲數(shù)量明顯低于側(cè)根基部及微傷口處的線蟲數(shù)量.猜測(cè)完整細(xì)胞產(chǎn)生的化學(xué)物質(zhì)通過微傷口釋放到根表面來吸引花生莖線蟲，而橫切面?zhèn)诳赡苡捎谇锌谔幖?xì)胞大量死亡，對(duì)線蟲具有吸引作用的化學(xué)物質(zhì)減少致使吸引效果不明顯，切面死亡細(xì)胞也可能影響線蟲的侵入.然而，花生莖線蟲對(duì)花生側(cè)根基部或微傷口的趨向是何種物質(zhì)在起作用，尚需進(jìn)一步研究.本研究還發(fā)現(xiàn)，在根冠樣本處理過程中造成的小傷口也能吸引大量線蟲侵入,但侵入根冠處的線蟲并未向上部遷移，與從微傷口或側(cè)根基部侵入的線蟲在根內(nèi)上下遷移存在明顯的差異，這些機(jī)制均需進(jìn)一步深入研究.

利用Pluronic F-127系統(tǒng)研究植物寄生線蟲的化學(xué)趨向性，具有模擬土壤三維系統(tǒng)、三維空間觀、熱可逆、無毒等優(yōu)點(diǎn)[5,7].植物寄生線蟲在土壤中對(duì)根部的識(shí)別和定位除了與根系分泌物有關(guān)外，還可能涉及根際微生物所釋放的化學(xué)物質(zhì).在Pluronic F-127膠體系統(tǒng)下只涉及根部分泌物因素，根際微生物是否發(fā)揮作用以及作用大小，無法通過該系統(tǒng)完成.研究過程中發(fā)現(xiàn)，利用Pluronic F-127膠體系統(tǒng)觀察根系對(duì)線蟲的吸引作用時(shí)，根系不宜太弱，并且試驗(yàn)時(shí)間不宜過長(zhǎng)，因?yàn)檫@會(huì)造成根系失水變黃，影響試驗(yàn)結(jié)果.

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