愈傷組織和培養(yǎng)溫度對花生莖線蟲繁殖力的影響

章淑玲, 林谷園, 肖　順

(1.福建農(nóng)業(yè)職業(yè)技術學院園藝園林系，福建 福州 350119；2.福建出入境檢驗檢疫局 福建 福州 350001；3.福建農(nóng)林大學植物保護學院，福建 福州 350002)

花生莖線蟲(Ditylenchusarachis)是2014年我國首次報道危害山東和河北兩省花生的一種病原線蟲[1].該線蟲主要侵染花生的根系、胚栓、果莢和種粒，致使受害花生植株根系減少、腐爛,結莢少,固氮根瘤菌減少，果莢外殼變黑、腐爛，種皮褐變、皺縮，嚴重降低了花生的產(chǎn)量和質(zhì)量；該線蟲還可寄生于花生田間的雜草以及在病果莢內(nèi)長期存活，成為次年病害的初侵染源[1-2].因此，花生莖線蟲已成為繼根結線蟲(Meloidogynespp.)后又一個可對我國花生產(chǎn)業(yè)造成嚴重影響的病原線蟲[3].

為了防治花生莖線蟲病，必須開展該病原線蟲的生物學、病理學及遺傳特性等方面的研究，而線蟲培養(yǎng)條件的確定是對其全面系統(tǒng)研究的基礎.目前,常用于線蟲培養(yǎng)的方法有寄主接種法、離體組織培養(yǎng)法和真菌培養(yǎng)法等，其中,離體組織培養(yǎng)中的愈傷組織已廣泛用于相似穿孔線蟲(Radopholussimilis)、短體線蟲(Pratylenchusspp.)、菊花滑刃線蟲(Aphelenchoidesritzemabosi)、腐爛莖線蟲(D.destructor)等的人工培養(yǎng)[4-8].本研究測試不同愈傷組織和培養(yǎng)溫度下花生莖線蟲的繁殖情況，以期為研究該線蟲在我國的適生性、科學評估其危害以及制定有效的防控措施提供參考.

1　材料與方法

1.1　供試線蟲

供試的6個花生莖線蟲種群(表1)分別采自各地的花生莖線蟲病果莢，用改良貝爾曼漏斗法[9]分離病果莢中的線蟲.將分離的線蟲懸浮液收集至1.5 mL離心管中，3 000 r·min-1離心2 min，去上清液；加入0.1%硫酸鏈霉素溶液，表面消毒10 min，再用無菌水清洗2～3次，備用.

表1　供試的花生莖線蟲種群Table 1　List of tested D.ararchis populations

1.2　愈傷組織的制備

參考Reise et al[10]的方法，從市場上選取新鮮、健康、粗細一致的胡蘿卜和甘薯塊莖，洗凈后切去塊莖兩端較細的部分，在超凈工作臺內(nèi)，用75%乙醇對塊莖的表面進行消毒.用滅菌刀削去塊莖的表皮，再切成厚度約為10 mm(直徑約為40 mm)的圓塊，在酒精燈外焰上消毒2～3 s，迅速放入滅菌的培養(yǎng)皿中，用封口膜封閉后置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)14 d左右，待長出愈傷組織后備用.

1.3　不同愈傷組織下花生莖線蟲的繁殖力測定

挑取消毒后的花生莖線蟲Dar01種群的30條雌蟲，分別接種到培養(yǎng)皿內(nèi)長滿愈傷組織的胡蘿卜和甘薯圓塊上，將培養(yǎng)皿重新封口后，置于28 ℃恒溫箱中黑暗培養(yǎng)60 d，分別對愈傷組織里的線蟲進行分離并計數(shù).各處理設10個重復.

1.4　溫度對愈傷組織上花生莖線蟲繁殖力的影響

挑取消毒后的花生莖線蟲Dar01種群的30條雌蟲，接種于胡蘿卜愈傷組織上，分別置于15、20、25、30和35 ℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)60 d，分別對愈傷組織里的線蟲進行分離并計數(shù).各溫度處理設10個重復.

1.5　不同地理種群花生莖線蟲的繁殖力測定

挑取消毒后的6個不同地理種群(表1)各30條雌蟲，分別接種到胡蘿卜愈傷組織中，各地理種群分別設10個重復.培養(yǎng)60 d后，分別對愈傷組織里的線蟲進行分離并計數(shù).

1.6　線蟲的分離、計數(shù)與統(tǒng)計分析

將培養(yǎng)皿中的愈傷組織取出，放入攪拌器(康華HJ-1型)中，加入適量的水進行攪拌，將攪拌后的懸浮液分別過100目、300目、500目組合的線蟲過濾篩，用洗瓶反復沖洗300目和500目篩上的線蟲至燒杯中.待線蟲沉降后，將線蟲懸浮液收集至10 mL離心管中，3 000 r·min-1離心2 min，棄多余液體，定容至1 mL.用移液管吸取20 μL線蟲懸浮液于載玻片上，在體視顯微鏡下分別統(tǒng)計卵、幼蟲、雌蟲、雄蟲的數(shù)量，重復3次，取平均值.根據(jù)定容的體積計算各處理重復的總蟲數(shù).

線蟲的繁殖倍數(shù)=最終線蟲繁殖量/初始線蟲接種量.

采用SPSS PASW Statistics v18.0軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行方差分析，并用Duncan′s新復極差法在P<0.05顯著水平上進行多重比較，計算標準誤.

2　結果與分析

2.1　愈傷組織對花生莖線蟲繁殖力的影響

從圖1及表2可見，花生莖線蟲在供試的2種愈傷組織上均可繁殖；但在胡蘿卜愈傷組織上的繁殖倍數(shù)為208.27，明顯高于在甘薯愈傷組織上的繁殖倍數(shù)(6.93)，二者的差異達到顯著水平(F=601.97;df=1,18;P<0.05.表3).

2.2　溫度對花生莖線蟲繁殖力的影響

由表4可見，溫度對花生莖線蟲在胡蘿卜愈傷組織上的繁殖力存在顯著影響.溫度在15和35 ℃時花生莖線蟲繁殖力低，有時甚至無法完成生活史.20～30 ℃時線蟲在胡蘿卜愈傷組織上能大量繁殖并完成生活史，且隨著溫度的升高，線蟲的幼蟲量、雌蟲量、雄蟲量、總蟲數(shù)及繁殖倍數(shù)均逐漸增大，30 ℃時總蟲數(shù)達7 728條，其中卵672條、幼蟲5 064條、雌蟲828條、雄蟲1 164條，繁殖倍數(shù)為257.59，繁殖力與其他溫度存在顯著差異(P<0.05).

A:接種線蟲60 d后的胡蘿卜愈傷組織；B:接種線蟲60 d后的甘薯愈傷組織；C:愈傷組織培養(yǎng)的花生莖線蟲.圖1　胡蘿卜愈傷組織和甘薯愈傷組織對花生莖線蟲的培養(yǎng)Fig.1　Cultivation of D.arachis on carrot callus and sweet potato callus

愈傷組織卵量/個幼蟲量/條雌蟲量/條雄蟲量/條總蟲數(shù)/條繁殖倍數(shù)胡蘿卜100847002283126248208.27甘薯 1014634182086.93

表3　花生莖線蟲在胡蘿卜愈傷組織和甘薯愈傷組織上繁殖倍數(shù)的方差分析1)Table 3　Variance analysis of breeding multiple of D.arachis (Dar01) on carrot callus and sweet potato callus

1)*表示差異達到顯著水平(P<0.05).

表4　不同培養(yǎng)溫度下花生莖線蟲在胡蘿卜愈傷組織上的繁殖力1)Table 4　Reproductive ability of D.arachis (Dar01) on carrot callus at different temperatures

1)表中數(shù)值為10個重復的均值±標準誤；同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同者表示在0.05水平上差異顯著，字母相同者表示差異不顯著.

2.3　花生莖線蟲不同種群的繁殖力

將不同地理來源的花生莖線蟲6個種群各30條分別接種于胡蘿卜愈傷組織上，于28 ℃下黑暗培養(yǎng)60 d，各個種群均能繁殖并完成生活史.其中，Dar06的繁殖能力最強，60 d后的線蟲總量達到7 232條，繁殖倍數(shù)為241.07；但不同種群的繁殖力不存在顯著差異(P>0.05，表5).

表5　不同地理種群花生莖線蟲在胡蘿卜愈傷組織上的繁殖力1)Table 5　Reproductive ability of different populations of D.arachis on carrot callus

1)表中數(shù)值為10個重復的均值±標準誤;同列數(shù)據(jù)后小寫字母不同者表示在0.05水平上差異顯著，字母相同者表示差異不顯著.

3　結論

本研究結果表明，花生莖線蟲在胡蘿卜愈傷組織上的繁殖效果大大高于甘薯愈傷組織，培養(yǎng)60 d后蟲量可達到6 000條以上，且胡蘿卜愈傷組織的制備和操作簡單、不易污染、培育周期短，適用于花生莖線蟲的快速大量繁殖.甘薯愈傷組織因含水量低，在培養(yǎng)后期不易腐爛，適用于線蟲的長期保存.花生莖線蟲繁殖的適宜溫度為20～30 ℃，30 ℃時繁殖量最高，溫度低于15 ℃或高于35 ℃不適于該線蟲繁殖.花生莖線蟲不同地理種群在胡蘿卜愈傷組織上的繁殖力差異不顯著，這一結果說明我國花生莖線蟲種群間比較保守，不存在明顯的地理變異[11].

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