轉(zhuǎn)錄組學(xué)在茶樹研究中的應(yīng)用進(jìn)展

江新鳳　劉本英　李友勇　李洪波

(1.江西省蠶桑茶葉研究所　330202；2.云南省茶學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室　666201)

中國是茶的故鄉(xiāng)，茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展源遠(yuǎn)流長，茶樹種質(zhì)資源豐富，截至2017年，通過國家級(jí)審(認(rèn)、鑒)定的茶樹品種有134個(gè)，數(shù)量位于世界前列[1～3]。長期以來，對(duì)于茶樹種質(zhì)資源以及品種特性研究均通過形態(tài)學(xué)特征和農(nóng)藝特征觀察來實(shí)現(xiàn)，但由于茶樹是一種長期異化授粉、自交不親和性的作物，表現(xiàn)為高度雜合的生殖特點(diǎn)，加上品種選育均采用傳統(tǒng)的系統(tǒng)和雜交選育，且父母本親緣關(guān)系較近，其后代發(fā)生的遺傳變異小，故通過表型來進(jìn)行品種鑒定存在一定的難度和不確定性。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)為茶樹基因研究開辟了新途徑，對(duì)茶樹的進(jìn)化、基因突變以及翻譯調(diào)控等多種生物學(xué)過程提供有效工具，也可作為標(biāo)記進(jìn)行輔助育種，降低標(biāo)記選擇成本，縮短了育種進(jìn)程[4～6]。本文對(duì)近年來茶樹轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，為轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)在茶樹上的進(jìn)一步應(yīng)用提供參考。

1　轉(zhuǎn)錄組學(xué)概況

轉(zhuǎn)錄組學(xué)(Transcriptomics)是研究細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所含mRNA的類型與拷貝數(shù)；比較不同功能狀態(tài)下mRNA表達(dá)的變化，搜尋與功能狀態(tài)變化緊密相關(guān)的重要基因群，對(duì)每種轉(zhuǎn)錄本在發(fā)育過程中和不同條件下表達(dá)水平的變化進(jìn)行量化[7～8]。轉(zhuǎn)錄組的概念是由Velculescu等人[9～10]于1997年最早提出的，20 世紀(jì)90 年代中期，轉(zhuǎn)錄組學(xué)開始在生物學(xué)領(lǐng)域作為一門新技術(shù)，成為研究熱點(diǎn)并且得到廣泛的應(yīng)用[11～12]，比如EST(Expressed Sequence tags，表達(dá)序列標(biāo)簽 )是從已建好的cDNA庫中隨機(jī)抽取克隆，從5’末端或3’末端對(duì)插入的cDNA片段進(jìn)行一輪單向自動(dòng)測序，所獲得的約60～500bp的一段cDNA序列。20世紀(jì)90年代初Craig Venter提出了EST的概念，并測定了609條人腦組織的EST，宣布了cDNA大規(guī)模測序時(shí)代的開始[13]。1993年前EST數(shù)據(jù)收錄于GenBank、EBI和DDBJ。同年NCBI(National Center of Biotechnology Information)建立了一個(gè)專門的EST數(shù)據(jù)庫dbEST來保存和收集所有的EST數(shù)據(jù)。1995年中期GenBank中EST的數(shù)目超過了非EST的數(shù)目?，F(xiàn)在GenBank中EST的數(shù)目已經(jīng)超過了三千五百萬，約占GenBank中序列數(shù)的60%。轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法尤其是cDNA微陣列的應(yīng)用促進(jìn)基因表達(dá)數(shù)據(jù)爆炸性增長，但如何對(duì)這些數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，從中提取有意義的生物學(xué)信息，是未來一段時(shí)間轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究熱點(diǎn)和需要攻克的技術(shù)瓶頸。

2　轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究方法

隨著科學(xué)研究的不斷深入，雜交技術(shù)、PCR 技術(shù)、標(biāo)簽序列分析等新方法、新技術(shù)已成功地應(yīng)用于轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究方法到目前為止，經(jīng)歷三代發(fā)展。早期，由于測序價(jià)格昂貴、基因序列數(shù)目有限，轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究者只能進(jìn)行極少數(shù)特定基因的結(jié)構(gòu)功能分析和表達(dá)研究。最早廣泛應(yīng)用測序技術(shù)為70年代的 Sanger 法，這也是完成人類基因組計(jì)劃的基礎(chǔ)。最近十幾年， 分子生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展使高通量分析成為可能，高通量研究方法主要可以分為兩類：一類是基于雜交的方法，主要是指微陣列技術(shù)(Microarray)；一類是基于測序的方法，這類方法包括表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)(Expression Sequence Tags Technology，EST)、基因表達(dá)系列分析技術(shù)(Serial analysis of gene expression，SAGE)、大規(guī)模平行測序技術(shù)(Massively parallel signature sequencing，MPSS)、RNA 測序技術(shù)(RNA sequencing，RNA-seq)。自2005年以來，以Roche 公司的454技術(shù)、Illumina 公司的 Solexa 技術(shù)以及 ABI 公司的 Solid 技術(shù)為標(biāo)志的高通量測序技術(shù)相繼誕生[14～15]。不同轉(zhuǎn)錄組研究方法比較見表1[16～17]。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究有助于了解特定生命過程中相關(guān)基因的整體表達(dá)情況，進(jìn)而從轉(zhuǎn)錄水平初步揭示該生命過程的代謝網(wǎng)絡(luò)及其調(diào)控機(jī)理。隨著后基因組時(shí)代的到來，轉(zhuǎn)錄組測序成為率先發(fā)展且應(yīng)用相對(duì)廣泛的技術(shù) 。

表1　各種轉(zhuǎn)錄組(測序技術(shù))研究方法比較

3　轉(zhuǎn)錄組學(xué)在茶樹研究中的應(yīng)用

高通量測序技術(shù)的發(fā)展極大推動(dòng)了轉(zhuǎn)錄組學(xué)的研究，使研究者能發(fā)現(xiàn)更多新轉(zhuǎn)錄本，挖掘更多分子標(biāo)記，更清晰地繪制轉(zhuǎn)錄圖譜以及更準(zhǔn)確地確定代謝途徑通路[6]。轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在茶樹中的應(yīng)用較玉米、大豆、水稻等大田作物較少[18]。但是隨著第三代測序技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，將來測序成本會(huì)大大降低，測序的通量和準(zhǔn)確性也會(huì)不斷提高，其在茶樹的功能基因挖掘、次生代謝調(diào)控、抗性及茶樹遺傳育種和進(jìn)化分析等研究中將進(jìn)一步拓展。

3.1　功能基因挖掘

目前，由于基因組測序的功能注釋還不夠完備，因此基因優(yōu)化可以通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)進(jìn)行，通過深入比較分析已知基因組注釋模型與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果，從而挖掘該物種的新基因及完善其基因組的注釋[19]。張成才[20]以中茶108和福鼎大白茶為材料，進(jìn)行了自交(SP)和雜交授粉(CP)，選取了自交和雜交授粉后24h、48h和72h的花柱，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，自交和雜交授粉花柱在基因表達(dá)模式上有顯著差異，篩選到了大量可能與茶樹育性相關(guān)的重要基因；韋康[21～22]使用Illumina測序法對(duì)茶樹扦插枝條使用吲哚丁酸(IBA)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)許多基因參與了植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、次生代謝、細(xì)胞壁組織和谷胱甘肽代謝；譚立強(qiáng)[23]利用Illumina測序平臺(tái)進(jìn)行高通量測序，分析了茶樹的轉(zhuǎn)錄組，構(gòu)建SSR覆蓋1 156.9cm的237個(gè)SSR標(biāo)記分布的15個(gè)連鎖群遺傳連鎖圖譜；馬春雷[24]利用第一代cDNA微陣列方法對(duì)“安吉白茶”泛白不同階段基因表達(dá)進(jìn)行了分析，篩選部分茶樹功能基因；韋朝領(lǐng)[25]發(fā)現(xiàn)了茶樹特有化合物主要代謝途徑的大量候選基因。

3.2　次生代謝調(diào)控

近年，轉(zhuǎn)錄組技術(shù)在次生代謝調(diào)控方面運(yùn)用頗多，對(duì)茶樹特征性次生代謝相關(guān)基因進(jìn)行挖掘，以及對(duì)基因的結(jié)構(gòu)、功能、表達(dá)及調(diào)控方面研究也有相關(guān)報(bào)道[26]。李春芳[27]通過對(duì)茶樹的13個(gè)不同組織部位進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序，得到了34.7萬條特異的茶樹基因序列,找到了1 719個(gè)基因參與次生代謝產(chǎn)物的合成，其中206個(gè)基因參與類黃酮、咖啡因和茶氨酸的合成，找到了339個(gè)可能調(diào)控類黃酮、咖啡因和茶氨酸合成途徑基因的轉(zhuǎn)錄因子。邰玉玲[28]對(duì)茶樹和油茶轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行比較分析，研究了茶樹特征性代謝成分形成的分子機(jī)制，結(jié)果表明，在茶樹特征性成分積累的過程中，與兒茶素、茶氨酸和咖啡堿相關(guān)的代謝途徑的基因表達(dá)量茶樹比油茶高；王璐[29]通過比較龍井43和中黃2號(hào)，分析了兩品種的生化成分、葉綠體結(jié)構(gòu)、基因表達(dá)與代謝途徑，發(fā)現(xiàn)中黃2號(hào)與龍井43中存在4 902個(gè)差異基因，其中259個(gè)與氨基酸代謝、光合作用和色素代謝有關(guān)；吳華玲[30]用20個(gè)特色茶樹品系的嫩梢、幼葉、成熟葉為材料，構(gòu)建cDNA文庫并利用Roche/454轉(zhuǎn)錄組測序，共讀取437 908個(gè)基因序列，通過重組裝得到25 637條，并用這些序列與公眾數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這些基因的大多數(shù)映射到碳水化合物代謝、能量代謝和次生代謝產(chǎn)物生物合成途徑。

3.3　抗性研究

劉聲傳[31]以“寧州2 號(hào)”為RNA-Seq材料進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組測序，揭示了干旱脅迫與復(fù)水下茶樹激素代謝和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及可溶性糖和脯氨酸代謝的機(jī)理；王璐[32]、王新超[33]、張悅[34]使用Illumina及RNA-Seq技術(shù)對(duì)茶樹冷脅迫下進(jìn)行全轉(zhuǎn)錄組測序，通過比較轉(zhuǎn)錄組或基因表達(dá)譜的研究以揭示生物學(xué)現(xiàn)象或疾病發(fā)生的分子機(jī)制。王丹[35～36]比較不同茶樹品種轉(zhuǎn)錄組差異，借助生物信息學(xué)方法分析海量數(shù)據(jù)后，對(duì)茶樹抵御茶尺蠖抗性相關(guān)基因進(jìn)行了功能注釋、代謝通路分析，同時(shí)關(guān)鍵基因進(jìn)行了篩選。

4　展望

目前，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)已在醫(yī)學(xué)和農(nóng)學(xué)等基礎(chǔ)以及應(yīng)用基礎(chǔ)研究中廣泛應(yīng)用。由于測序技術(shù)和生物信息學(xué)的不斷發(fā)展，分析其測序結(jié)果會(huì)越來越真實(shí)可靠，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的分析研究，將有助于得到新的功能基因和代謝通路，為茶樹種質(zhì)資源鑒定、保存與優(yōu)良種質(zhì)選育提供分子基礎(chǔ)；通過對(duì)次生代謝途徑關(guān)鍵酶基因的研究，為茶樹活性成分的生物合成與調(diào)控提供新的思路和方法，或通過基因轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)，提高茶樹功能成分的產(chǎn)量與活性，為茶樹的良種選育、規(guī)范化種植和質(zhì)量控制提供技術(shù)支撐。當(dāng)然，作為一種快速、高通量、全面解讀茶樹基因組信息的全新技術(shù)手段，茶樹轉(zhuǎn)錄組研究在基礎(chǔ)理論和生產(chǎn)實(shí)踐中均具有重要的意義的同時(shí)也存在一些弊端，如樣本需求量大、容易受環(huán)境因素的影響，因此轉(zhuǎn)錄組學(xué)的應(yīng)用結(jié)合眾多新興組學(xué)，例如蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)的研究，實(shí)現(xiàn)高通量與高效率的結(jié)合，揭示傳統(tǒng)茶樹生物學(xué)內(nèi)涵，為茶產(chǎn)業(yè)的發(fā)展提供助力。

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