干擾素調(diào)節(jié)因子5通過調(diào)節(jié)M1型巨噬細(xì)胞極化促進(jìn)小鼠心肌梗死后心臟重構(gòu)

盧煜 賈立昕 張文美 杜杰 解軍

急性心肌梗死是由冠狀動脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死[1-2］。心臟重構(gòu)對心肌梗死遠(yuǎn)期預(yù)后具有重要意義，巨噬細(xì)胞參與心肌梗死后心臟重構(gòu)的全過程[3］。在不同刺激下，巨噬細(xì)胞可分化為M1型(經(jīng)典活化型)和M2型(替代活化型)型兩種表型[4］發(fā)揮不同的作用：M1型巨噬細(xì)胞主要發(fā)揮促炎/殺菌等作用，M2型巨噬細(xì)胞則主要表現(xiàn)為抑炎及促修復(fù)等作用[5］。但轉(zhuǎn)錄因子IRF5是巨噬細(xì)胞極化的主要調(diào)節(jié)因子[6-7］，外源性IRF5可以上調(diào)M1型或下調(diào)M2型巨噬細(xì)胞表型標(biāo)記物的表達(dá)[8］，但是IRF5是否參與心肌梗死后心臟重構(gòu)的作用和機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過構(gòu)建小鼠心肌梗死模型，以及體外缺氧/復(fù)氧刺激小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞研究IRF5對小鼠心肌梗死后心臟重構(gòu)的影響及其可能的作用機(jī)制。

材料與方法

1.實(shí)驗(yàn)動物與分組 實(shí)驗(yàn)所用8周齡，雄性，C57BL/6J小鼠，全部購買自華阜康生物科技有限公司，飼養(yǎng)于北京市心肺血管疾病研究所SPF級動物房。將30只，8周齡，雄性小鼠，隨機(jī)分為兩組：假手術(shù)組(n=15)和心肌梗死手術(shù)組(n=15)。

2.小鼠心肌梗死模型 用1%～2%異氟烷和氧氣混合氣體麻醉小鼠，在第四肋間間隙經(jīng)開胸?cái)D出心臟后，用6-0尼龍單絲縫線永久性結(jié)扎冠狀動脈左前降支，用4-0線縫合胸腔，等待小鼠自然蘇醒。假手術(shù)組不結(jié)扎冠狀動脈前降支，其余操作與觀察組一致。心肌梗死模型構(gòu)建由專業(yè)人員在同一地點(diǎn)完成，保證模型復(fù)制的一致性。

3.小鼠心功能檢測 心肌梗死后7d利用Vevo 2100 High Resolution Imaging System進(jìn)行超聲心動圖檢測。將小鼠麻醉后仰臥位固定小鼠，心率維持在450～550次/min，在二維模式下獲得胸骨旁長軸和心室中短軸圖像，記錄乳頭肌水平的M型軌跡。使用Visual Sonics Vevo 2100軟件離線進(jìn)行圖像分析。

4.心臟組織病理切片制備及染色 小鼠心肌梗死7d后，用含肝素的0.9%氯化鈉溶液灌注心臟，去除心臟內(nèi)血液，用10%甲醛固定后用石蠟包埋，每隔5μm切片。根據(jù)制造商(雷根公司)產(chǎn)品說明書進(jìn)行Masson染色，檢測心臟纖維化水平。免疫組化染色是將石蠟切片(5μm)脫蠟并抗原修復(fù)后用5%BSA封閉然后用一抗 IRF5(ab33478，Abcam)、MAC-2(sc20157， Santa Cruz Biotechnology)4℃孵育過夜。次日用二抗(anti-mouse IgG)與一抗反應(yīng)，常溫孵育1h。所有圖像用NIS-Elements BR 3.0軟件進(jìn)行分析。

5.小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞提取及處理 從8周齡，雄性C57BL/6J小鼠的股骨和脛骨中分離出骨髓，過70μm尼龍篩網(wǎng)過濾器，1 500rpm，5min離心后用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，加入集落刺激因子M-CSF(Pepro Tech)，在37℃含5%二氧化碳和95%氧氣的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3d。siRNA轉(zhuǎn)染巨噬細(xì)胞是采用 LipofectamineTMiMAX轉(zhuǎn)染試劑將50nM的IRF5 siRNA或control siRNA轉(zhuǎn)染至巨噬細(xì)胞。缺氧/復(fù)氧刺激是將細(xì)胞在37℃含5%二氧化碳和無氧氣條件下培養(yǎng)8h，然后在常氧條件下繼續(xù)培養(yǎng)12h。

6.實(shí)時(shí)熒光定量PCR 用Trizol試劑(Invitrogen)從小鼠心臟組織及體外培養(yǎng)的細(xì)胞中提取總RNA，每份樣品用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)將2μg RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。然后每份樣品取1μL cDNA用10μL SYBR Green PCR Master Mix和1μmol/L primers進(jìn)行擴(kuò)增。實(shí)時(shí)熒光定量PCR用CFX-96實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行檢測，實(shí)驗(yàn)使用相關(guān)引物序列如下：IRF5，上游 5'-GGTCAACGGGGAAAAGAA ACT-3'，下游 5'-CATCCACCCCTTCAGTGTACT-3'；iNOS，上游 5'-GTTCTCAGCCCAACAATACAAGA-3'，下游 5'-GTGGACGGGTCGATGTCAC-3'；IL-1β，上游 5'-GCAACTGTTCCTGAACTCAACT-3'，下游5'-ATCTTTTGGGGTCCGTCAACT-3'；IL-6，上游 5'-TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC-3'，下游 5'-TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC-3'；GAPDH，上 游 5'-CCTGGAGAAACCTGCCAAGTATGA-3'，下游 5'-TTGAAGTCACAGGAGACAACCTGG-3'。

7.流式細(xì)胞術(shù) 假手術(shù)組和心肌梗死小鼠心臟組織炎癥細(xì)胞浸潤水平通過流式細(xì)胞術(shù)來檢測。取兩組小鼠心臟組織，切碎，用collagenase II和 Dispase II在37℃條件下消化30min。實(shí)驗(yàn)使用的相關(guān)抗體包括：PerCP-Cy5.5抗小鼠CD45.2、PE抗小鼠F4/80、Alexa APC抗小鼠 CD11b、FITC抗小鼠CD206。

8.統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)分析 應(yīng)用GraphPad-Prism 7.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.心肌梗死后小鼠存活情況和心功能變化 取30只，8周齡，雄性，C57BL/6J小鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組(n=15)和心肌梗死手術(shù)組(n=15)。統(tǒng)計(jì)兩組小鼠存活率：假手術(shù)組15只小鼠全部存活，存活率100%(15/15)；心肌梗死組分別在第3天死亡1只、第5天和6天各死亡2只，存活率66.7%(10/15)，心肌梗死組小鼠存活率明顯低于假手術(shù)組(圖1A)。利用Vevo 2100 High Resolution Imaging System進(jìn)行超聲心動圖檢測，從表1結(jié)果可見：假手術(shù)組和心肌梗死組小鼠室間隔(IVS)、LVIDD、LVIDS、左心室收縮期心室后壁厚度(LVPWS)、EF和縮短分?jǐn)?shù)(FS)均有明顯差異(P＜0.05)。由表2結(jié)果可見：與假手術(shù)組相比，心肌梗死術(shù)后小鼠體質(zhì)量無明顯差異，HW/BW明顯增加[(5.31±0.17)vs.(7.25±0.73)mg/g，P＜0.05］。 以上結(jié)果表明：心肌梗死術(shù)后7d小鼠存活率降低，心功能降低，心臟結(jié)構(gòu)也發(fā)生改變。

表1 兩組小鼠超聲心動圖測定結(jié)果(ˉ±s)

表1 兩組小鼠超聲心動圖測定結(jié)果(ˉ±s)

項(xiàng)目 Sham(n=15) MI(n=15)IVSd/mm 0.99±0.08 0.85±0.29 IVSs/mm 1.50±0.10 1.03±0.22*LVID d/mm 3.47±0.21 4.36±0.91*LVID s/mm 2.08±0.21 3.83±1.03*LVPW d/mm 0.80±0.09 0.77±0.16 LVPW s/mm 1.17±0.19 0.92±0.18*LVEF/% 72.72±3.55 29.77±6.63*LVFS/% 41.53±2.64 14.63±5.44*LV Mass(Corrected)/g 91.34±2.98 108±18.03

表2 兩組小鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量/體質(zhì)量測定結(jié)果(ˉ±s)

表2 兩組小鼠體質(zhì)量、心臟質(zhì)量/體質(zhì)量測定結(jié)果(ˉ±s)

項(xiàng)目 Sham(n=15) MI(n=15)BW/g 27.30±0.99 26.66±0.82 HW/BW/(mg/g) 5.31±0.17 7.25±0.73*

2.心肌梗死后小鼠心臟纖維化加重 心肌梗死7天后，用0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行灌流后進(jìn)行病理檢測。通過Masson染色觀察心臟纖維化水平，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與假手術(shù)組相比，心肌梗死組小鼠心臟纖維化水平明顯增加[(0.90±0.29)%vs.(24.54±5.43)%］(圖1B)。

3.心肌梗死后心臟組織巨噬細(xì)胞表型分析 首先我們對假手術(shù)組和心肌梗死術(shù)后7天小鼠心臟組織進(jìn)行了流式細(xì)胞術(shù)檢測，結(jié)果表明：與假手術(shù)組相比，心肌梗死組小鼠心臟組織CD45+白細(xì)胞[(1.90±0.53)vs.(10.05±0.44)%］以及 CD45+CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞[(0.77±0.21)vs.(7.70±1.68)%］浸潤明顯增多，并且 CD45+CD11b+F4/80+CD206-M1型巨噬細(xì)胞[(0.43±1.52)vs.(4.47±0.45)%］以及 CD45+CD11b+F4/80+CD206+M2巨噬細(xì)胞[(0.33±0.06)vs.(3.13±0.60)%］也明顯增加(圖2A)。通過MAC2免疫組化染色進(jìn)一步說明心肌梗死后巨噬細(xì)胞浸潤增加[(2.25±1.89)vs.(96.5±7.90)%］(圖2B)。 接下來我們通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了心肌梗死7天后心臟組織中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS、IL-1β、IL-6的表達(dá)情況，統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明與假手術(shù)組相比，心肌梗死后M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)均明顯增加(圖2C)。以上結(jié)果表明：小鼠心肌梗死術(shù)后7d，心臟組織炎癥細(xì)胞浸潤增加，M1型巨噬細(xì)胞浸潤增加。

圖1 心肌梗死對小鼠存活率及心臟纖維化的影響 A：與假手術(shù)組相比，心肌梗死7天小鼠存活率明顯降低；B：Masson染色評價(jià)假手術(shù)組和心肌梗死7天小鼠心臟纖維化水平。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

圖2 心肌梗死后心臟組織炎癥細(xì)胞浸潤情況 A：流式細(xì)胞術(shù)檢測假手術(shù)組和心肌梗死7天小鼠心臟組織CD45+白細(xì)胞、CD45+CD11b+F4/80+巨噬細(xì)胞、CD45+CD11b+F4/80+CD206-M1型巨噬細(xì)胞、CD45+CD11b+F4/80+CD206+M2巨噬細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)比例；B：免疫組化染色檢測假手術(shù)組和心肌梗死組小鼠IRF5表達(dá)；C：使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物mRNA表達(dá)水平。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

4.心肌梗死后心臟組織IRF5表達(dá)升高 為了進(jìn)一步探索心肌梗死引起M1型巨噬細(xì)胞增多的分子機(jī)制，我們利用免疫組化染色和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測了心肌梗死后7d心臟組織中IRF5表達(dá)水平，結(jié)果表明心肌梗死后 IRF5蛋白表達(dá)水平[(2.67±2.08)vs.(76±9.54)%］和RNA表達(dá)水平[(1.01±0.18)vs.(12.91±1.34)%］均明顯升高(圖3)。

5.體外缺氧/復(fù)氧刺激促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化與IRF5表達(dá) 我們利用體外缺氧/復(fù)氧刺激構(gòu)建巨噬細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS、IL-1β、IL-6以及IRF5表達(dá)，結(jié)果表明，與常氧假手術(shù)組相比，缺氧/復(fù)氧刺激后M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)均明顯增加，并且IRF5表達(dá)增加[(0.97±0.04)vs.1.28±0.13)%］(圖4)。

6.體外抑制IRF5可以降低缺氧/復(fù)氧刺激引起的M1巨噬細(xì)胞極化 為了進(jìn)一步探索IRF5與M1型巨噬細(xì)胞之間的關(guān)系，我們首先檢測了IRF5在巨噬細(xì)胞中的基因沉默效率，siIRF5處理C57BL/6J小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞后，IRF5的mRNA表達(dá)水平降低70%(圖5A)。接下來我們利用siIRF5處理C57BL/6J小鼠骨髓來源巨噬細(xì)胞，缺氧/復(fù)氧處理后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(iNOS，IL-1β，IL-6)表達(dá)，結(jié)果顯示siIRF5轉(zhuǎn)染組中M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)水平與假手術(shù)組相比均明顯降低(圖5B)。以上結(jié)果表明：抑制IRF5可以降低缺氧/復(fù)氧刺激引起的M1巨噬細(xì)胞極化。

討 論

心肌梗死后導(dǎo)致的心臟重構(gòu)最終會引起心力衰竭等嚴(yán)重后果[9］，隨著醫(yī)療水平的不斷發(fā)展，急性心肌梗死患者早期死亡率明顯降低，但是梗死晚期不良的心臟重構(gòu)，是心肌梗死后心衰等不良預(yù)后的重要病理基礎(chǔ)[10］。近年來研究發(fā)現(xiàn)，炎癥反應(yīng)在心肌梗死后心臟重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用[11］，巨噬細(xì)胞是重要的天然免疫細(xì)胞，主要通過吞噬細(xì)胞碎片、壞死細(xì)胞[12］，以及直接分泌生長因子或細(xì)胞因子等方式參與成纖維細(xì)胞激活與膠原產(chǎn)生等過程[13-14］。在我們的研究中發(fā)現(xiàn)，心肌梗死手術(shù)組小鼠心功能顯著降低，心臟炎癥細(xì)胞浸潤明顯高于假手術(shù)組，心臟纖維化面積較假手術(shù)組明顯增大。提示心肌梗死后炎癥因子表達(dá)增加，導(dǎo)致心臟炎癥和心臟纖維化的加重，惡化心肌梗死后的心臟重構(gòu)。

圖3 心肌梗死后心臟組織IRF5表達(dá)水平升高 A：免疫組化染色檢測假手術(shù)組和心肌梗死組小鼠心臟組織IRF5表達(dá)；B：實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IRF5表達(dá)水平。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

圖4 體外缺氧/復(fù)氧刺激促進(jìn)M1型巨噬細(xì)胞極化以及IRF5表達(dá)水平 A：缺氧/復(fù)氧刺激后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IRF5在mRNA水平的表達(dá)；B：缺氧/復(fù)氧刺激后，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物在mRNA水平的表達(dá)。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

圖5 體外抑制IRF5可以降低缺氧/復(fù)氧刺激引起的M1巨噬細(xì)胞極化 A：Realtime-PCR法檢測siCON和siIRF5處理后的WT小鼠骨髓巨噬細(xì)胞IRF5表達(dá)水平；B：利用si CON和si IRF5處理WT小鼠骨髓巨噬細(xì)胞，缺氧/復(fù)氧刺激后，利用realtime-PCR法檢測M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物iNOS、IL-1β、IL-6表達(dá)。注：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

巨噬細(xì)胞在不同刺激下分化為M1(經(jīng)典活化)型和M2(替代活化)型，其中以分泌促炎因子為主，發(fā)揮促炎作用的巨噬細(xì)胞稱為M1型巨噬細(xì)胞，其表面標(biāo)志物有：iNOS， IL-1β，IL-6，HLA-DR，CD197等，巨噬細(xì)胞在脂多糖、腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ等刺激因子作用下會極化為具有宿主免疫功能的M1型巨噬細(xì)胞。在炎癥反應(yīng)后期發(fā)揮抗炎作用并促進(jìn)組織修復(fù)及纖維化的巨噬細(xì)胞為M2型巨噬細(xì)胞，常見的 M2巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物有：Arg1，CD206， TGF-β等，巨噬細(xì)胞在 IL-4、IL-13、M-CSF和TGF-β等作用下向M2型極化[15-16］。M1型和M2型巨噬細(xì)胞與心肌梗死后炎癥反應(yīng)和心臟重構(gòu)有密切關(guān)系。M1型巨噬細(xì)胞會促進(jìn)炎癥反應(yīng)，加重組織損傷，M2型巨噬細(xì)胞發(fā)揮抑制炎癥反應(yīng)并且促進(jìn)瘢痕形成的作用。Hu等研究發(fā)現(xiàn)在小鼠心肌梗死模型中，清道夫受體A缺陷使M1型巨噬細(xì)胞極化增加，炎癥因子分泌增多，心功能惡化，心室擴(kuò)張[17］。Pooja等報(bào)道指出Caveolin-1敲除通過調(diào)節(jié)TGF-β信號通路促進(jìn)M2型巨噬細(xì)胞激活加劇小鼠心肌梗死后心肌間質(zhì)纖維化[18］。Mira等研究表明在小鼠心肌梗死后，IL-10治療可以增加M2型心臟巨噬細(xì)胞極化，減少炎癥，增加傷口愈合，防止MI后不良的心臟重構(gòu)[19］。與上述報(bào)道一致，我們的研究中發(fā)現(xiàn)小鼠心肌梗死后心臟組織中M1型巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物表達(dá)明顯增加，心功能惡化，并且在體外缺氧/復(fù)氧刺激小鼠骨髓巨噬細(xì)胞同樣發(fā)現(xiàn)M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(iNOS、IL-1β、IL-6)表達(dá)的增加。以上結(jié)果表明巨噬細(xì)胞極化在心肌梗死后炎癥反應(yīng)和心臟重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用。

巨噬細(xì)胞的不同分化影響心臟重構(gòu)及遠(yuǎn)期心功能，但其分化調(diào)控機(jī)制仍不完全明確。有報(bào)道表明，LPS刺激骨髓來源巨噬細(xì)胞使其向M1型分化，這些巨噬細(xì)胞的IRF5 mRNA和蛋白高度表達(dá)，并分泌促炎細(xì)胞因子，并且在抗原誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型中同樣證明IRF5是M1型巨噬細(xì)胞極化的主要調(diào)節(jié)因子，可以被用作炎癥巨噬細(xì)胞的可靠標(biāo)志物[20］。在脊髓損傷小鼠模型中，siRNA介導(dǎo)的IRF5基因敲除導(dǎo)致 M1巨噬細(xì)胞標(biāo)志物表達(dá)減少[21］。但在心肌梗死后的心臟重構(gòu)中，IRF5是否參與調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞分化及重構(gòu)過程并不清楚。我們的結(jié)果表明，在小鼠心肌梗死以及體外缺氧/復(fù)氧刺激后，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)志物(iNOS、IL-1β、IL-6)的表達(dá)明顯增加，并且IRF5的表達(dá)水平也明顯增加，給予si-IRF5轉(zhuǎn)染后，M1型巨噬細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)水平降低。提示IRF5在心肌梗死后M1型巨噬細(xì)胞極化過程中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，心肌梗死后心肌組織IRF5表達(dá)顯著上調(diào)，伴隨著M1型巨噬細(xì)胞極化，加重心肌梗死后炎癥反應(yīng)和心臟重構(gòu)。提示IRF5可以作為調(diào)節(jié)M1型巨噬細(xì)胞極化的主要因子，參與心肌梗死后心臟重構(gòu)，為深入探討心肌梗死后的心臟重構(gòu)的分子機(jī)制及治療提供新的思路。