醉馬芨芨草生物堿薄層色譜分析及GC-MS檢測

張睿涵 ， 李國中 ， 孫 暾 ， 達(dá)能太 ， 王建國 ， 路 浩 ， 趙寶玉

(1.西北農(nóng)林科技大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院 ， 陜西 楊凌 712100 ； 2.內(nèi)蒙古阿拉善左旗獸醫(yī)站 ， 內(nèi)蒙古 阿拉善 750300)

對于醉馬芨芨草毒性成分的研究可追溯至20世紀(jì)，最開始人們認(rèn)為中毒原因是其芒刺刺入動物皮膚、口腔、扁桃體等處引起物理性刺傷所致，現(xiàn)大量研究表明，其毒性成分是共生于植物中的內(nèi)生真菌產(chǎn)生的生物堿[1-2]，主要是麥角新堿和麥角酰胺。但是否還含有其他類型生物堿，醉馬芨芨草生物堿成分系統(tǒng)分析及毒性作用機(jī)制有待深入研究。

本試驗(yàn)采用生物堿提取方法結(jié)合薄層色譜和GC-MS法分析醉馬芨芨草中所含有的生物堿數(shù)量及種類。以采自內(nèi)蒙古阿拉善天然草地的醉馬芨芨草為材料通過醉馬芨芨草總浸膏的提取、生物堿定性檢驗(yàn)、分段萃取、薄層色譜分析證明醉馬芨芨草中存在生物堿及其所在溶劑部位、種類數(shù)。為避免雜質(zhì)太多導(dǎo)致的GC-MS法檢測結(jié)果的不準(zhǔn)確，需先將所得浸膏使用柱硅膠層析法除雜后使用GC-MS法進(jìn)行鑒定。

1 材料與方法

1.1 植物材料 醉馬芨芨草全草與2014年8月采集于內(nèi)蒙古阿拉善盟左旗(38°49′58.76″N，105°39′43.76″E)，曬干，粉碎備用。植物標(biāo)本由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院常朝陽研究員鑒定。

1.2 主要儀器與試劑 MC浙制02810218XMTB數(shù)顯控溫水浴鍋，北京市長風(fēng)儀表公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠； Canoscan LiDE 30彩色圖像掃描儀，佳能公司；UV-III 三用紫外分析儀，北京炳洋科技有限公司； SHB-III循環(huán)式多用真空泵，鄭州長城科貿(mào)有限公司；HP6890/5975C GC-MS聯(lián)用儀，美國安捷倫公司；硅膠GF254，青島海洋化工廠；改良碘化鉍鉀顯色機(jī)現(xiàn)用現(xiàn)配，其他試劑均為分析純。

1.3 醉馬芨芨草生物堿的提取 本試驗(yàn)采用工業(yè)酒精冷浸法和工業(yè)酒精熱回流法兩種方法提取。工業(yè)酒精冷浸法，稱取醉馬芨芨草干粉5 kg置于25 L塑料桶中，倒入工業(yè)酒精沒過草粉。1周更換1次工業(yè)酒精并減壓回收，兩月后將所得浸膏合并，計(jì)算出膏率。工業(yè)酒精熱回流法，取醉馬芨芨草干粉1.2 kg，分3批，每批400 g平均分裝于4個(gè)1 000 mL圓底燒瓶中加適量工業(yè)酒精于60 ℃條件下熱回流提取，每次熱回流4 h，連續(xù)進(jìn)行直至提取液澄清無色為止。提取完畢后將各批次提取液分別減壓回收，將所得浸膏合并后計(jì)算出膏率。

根據(jù)生物堿的溶解性和極性依次采用酸性氯仿、堿性氯仿和堿性正丁醇對工業(yè)酒精提取部分進(jìn)行分段萃取。每次萃取完后，減壓回收溶劑得各部分浸膏，計(jì)算出各萃取段出膏率。

1.4 薄層色譜分析 使用自制薄層板取上述各浸膏無水乙醇溶解液，用毛細(xì)管吸取適量液體，點(diǎn)于距薄層板底邊約0.5 cm的起始線上，點(diǎn)與點(diǎn)之間距離保持在0.5～1 cm，樣點(diǎn)直徑小于2 mm，各樣點(diǎn)位于同一水平位置。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)后選取適宜展開劑，放入展開槽中上行法展開，展開前沿距玻璃板上端1 cm時(shí)取出用電吹風(fēng)機(jī)吹干，使用改良碘化鉍鉀顯色。

1.5 硅膠柱層析法除雜純化 將各萃取段按質(zhì)量比1∶1與柱層析硅膠充分拌勻，用氯仿濕法裝柱，干法上樣，后依次使用氯仿、氯仿∶甲醇(50∶1)、氯仿∶甲醇(20∶1)、氯仿∶甲醇(10∶1)、氯仿∶甲醇(5∶1)、氯仿∶甲醇(3∶1)、氯仿∶甲醇(1∶1)、甲醇為洗脫劑進(jìn)行洗脫，每10 mL收集一瓶，將每瓶樣品使用薄層色譜法檢測，并合并Rf值相同或相近的組份。

1.6 GC-MS法分析 將純化后的樣品用甲醇溶解，用GC-MS儀器檢測生物堿的種類和相對含量。氣象色譜條件：色譜柱為 ZB-5MSI 5% Phenyl-95% DiMethylpolysiloxane(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱，柱溫 50 ℃(保留 2 min)，以 5 ℃ /min升溫至 310 ℃，保持10 min；運(yùn)行時(shí)間：64 min；汽化室溫度 250 ℃；載氣為高純 He(99.999%)；柱前壓7.65 psi，載氣流量 1.0 mL/min，不分流，溶劑延遲時(shí)間：3.0 min。質(zhì)譜條件：離子源為 EI 源；離子源溫度 230 ℃；四極桿溫度 150 ℃；電子能量 70 eV；發(fā)射電流 34.6 μA；倍增器電壓 1294 V；接口溫度 280 ℃；質(zhì)量范圍 29～500 amu。

2 結(jié)果

2.1 生物堿提取結(jié)果 使用工業(yè)酒精冷浸法提取醉馬芨芨草生物堿的浸膏含量為293.21 g，出膏率為5.8%，使用工業(yè)酒精熱回流法提取的浸膏含量為120.10 g，出膏率為10.01%，約為冷浸法的兩倍。其中工業(yè)酒精冷浸法提取酸性氯仿段浸膏重量為2.8 g，出膏率為1.16%；堿性氯仿段浸膏重量為0.24 g，出膏率為0.1%；堿性正丁醇段浸膏重量為14.97 g，出膏率為6.23%，工業(yè)酒精熱回流法提取酸性氯仿段浸膏重量為0.83 g，出膏率為0.69%；堿性氯仿段浸膏重量為0.25 g，出膏率為0.21%；堿性正丁醇段浸膏重量為18.71 g，出膏率為15.58%。

2.2 各萃取段薄層色譜分析結(jié)果 醉馬芨芨草工業(yè)酒精提取部分酸性氯仿萃取段，共使用了27種展開系統(tǒng)進(jìn)行展開，其中V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(氨水)=11∶1∶1展開效果最好，在改良碘化鉍鉀顯色條件下有3個(gè)斑點(diǎn)；堿性氯仿萃取段，共使用了29種展開系統(tǒng)進(jìn)行展開，其中V(氯仿)∶V(甲醇)∶V(氨水)=7∶1∶1展開效果最好，在改良碘化鉍鉀顯色條件下有4個(gè)斑點(diǎn)；堿性正丁醇萃取段，共使用了24種展開系統(tǒng)進(jìn)行展開，其中V(氯仿)∶V(甲醇)=1∶1展開效果最好，在改良碘化鉍鉀顯色條件下有2個(gè)斑點(diǎn)。結(jié)果見表1。

表1 醉馬芨芨草生物堿薄層色譜分析結(jié)果

2.3 醉馬芨芨草各萃取段柱層析結(jié)果 酸性氯仿段共回收164份樣品，經(jīng)薄層色譜法分析合并為3份待測樣品，分別是4-14、15-104、105-164，命名為酸性氯仿1、酸性氯仿2和酸性氯仿3；堿性氯仿段共回收246份樣品，經(jīng)薄層色譜法分析合并為3份待測樣品，分別是66-123、132-182、183-246，命名為堿性氯仿1、堿性氯仿2、堿性氯仿3；堿性正丁醇段共回收155瓶樣品，經(jīng)薄層色譜法分析合并為2瓶待測樣品，分別是5-111、112-155，命名為堿性正丁醇1、堿性正丁醇2。

2.4 醉馬芨芨草生物堿GC-MS法分析結(jié)果 將上述8份樣品使用GC-MS法分析鑒定，其中酸性氯仿1、酸性氯仿3和堿性氯仿3檢測出生物堿。經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對 Nist2008和 Wiley275 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，酸性氯仿1共出峰63個(gè)，檢出13個(gè)化合物，其中有2種生物堿，分別是甲基乙基馬來酰亞胺和乙琥胺(圖1、表2)；酸性氯仿2共出峰35個(gè)，檢出12個(gè)化合物，其中有2種生物堿，分別是三丙酮胺和芥酸酰胺(圖2、表3)；堿性氯仿共出峰29個(gè)，檢出10個(gè)化合物，其中有2種生物堿，分別是槐定堿和芥酸酰胺(圖3、表4)。

圖1 醉馬芨芨草酸性氯仿1 GC-MS總離子流圖

表2 酸性氯仿1 GC-MS法檢測結(jié)果

圖2 醉馬芨芨草酸性氯仿3 GC-MS總離子流圖

圖3 醉馬芨芨草堿性氯仿3GC-MS總離子流圖

表3 酸性氯仿3 GC-MS法檢測結(jié)果

3 討論

從醉馬芨芨草生物堿提取方法結(jié)果來看，工業(yè)酒精熱回流法的出膏率是冷浸法的出膏率兩倍還多，從薄層色譜結(jié)果來看，生物堿顯色基本沒有差別，所以對于醉馬芨芨草生物堿的提取，工業(yè)酒精熱回流法效率更高效果更好。

表4 堿性氯仿3GC-MS法檢測結(jié)果

1992年黨曉鵬等[3]從采自寧夏海原南華山醉馬芨芨草中分離出生物堿二氯化六甲基乙二銨，經(jīng)動物毒性試驗(yàn)證明是醉馬芨芨草的主要有毒成分，并命名為醉馬草毒素；1992年汪恩強(qiáng)等[4]人工合成二氯化六甲基乙二銨，給馬按1 000 mg/kg體重劑量口服，未復(fù)制出中毒病例。

醉馬芨芨草為禾本科植物，組織中存在多種內(nèi)生真菌，這些內(nèi)生真菌與宿主互利共生，可提高宿主植物對生物脅迫和非生物脅迫的抵抗能力，包括抗病性[5]、抗寒性[6]、抑菌性[7]、耐重金屬性[8]等。且這些內(nèi)生真菌絕大多數(shù)可以在宿主植株體內(nèi)產(chǎn)生生物堿，這些生物堿可能與引起家畜中毒有關(guān)。

1998年李學(xué)森等[9]在與新西蘭研究機(jī)構(gòu)的合作中發(fā)現(xiàn)，醉馬芨芨草中含有多種生物堿且多為麥角類生物堿，其中含量最高的是麥角新堿和麥角酰胺，認(rèn)為是其主要毒性物質(zhì)。而早在1982年，張友杰等[10]就從采自新疆昌吉醉馬芨芨草中分離出麥角新堿和異麥角新堿。而二者使用的醉馬芨芨草樣本都采集自新疆昌吉地區(qū)，而后蘭州大學(xué)的李春杰等從采自甘肅夏河的醉馬芨芨草種子培育出的植株中也檢測出了麥角類生物堿。2006年桑明[11]從采自甘肅天祝的醉馬芨芨草中分離出的7種生物堿，卻并未檢測出麥角類生物堿。根據(jù)本試驗(yàn)GC-MS法分析結(jié)果，從采自內(nèi)蒙古阿拉善的醉馬芨芨草中共檢測出5種生物堿，其中含量最高的是存在于堿性氯仿段的槐定堿(sophoridine)，與桑明分離出的生物堿無一一致，也未檢出文獻(xiàn)中報(bào)道的麥角類生物堿麥角新堿和麥角酰胺。這也許與醉馬芨芨草生長環(huán)境、生物堿提取方式有關(guān)。

據(jù)藥典介紹，麥角新堿是一種極性很大的化合物，但在本試驗(yàn)正丁醇段并未檢出生物堿，并且在該段有幾種含量很高的化合物也未檢出(保留時(shí)間：16.9，相對含量57.808%、保留時(shí)間：31.858，相對含量：24.483%)，可能與質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫大小有關(guān)。代樂英等[12]研究表明，帶內(nèi)生真菌的醉馬芨芨草植株均能檢測到不同含量的麥角生物堿，而不帶內(nèi)生真菌的植株均未能檢測出這兩種生物堿。故在本試驗(yàn)中檢測出的5種生物堿究竟是內(nèi)生真菌產(chǎn)生的還是植株自身產(chǎn)生，內(nèi)生真菌是否會選擇性的產(chǎn)生生物堿還有待研究。至于這批從內(nèi)蒙古阿拉善采集的醉馬芨芨草的毒性大小，也有待進(jìn)一步試驗(yàn)驗(yàn)證。

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