黑葉猴支原體及細菌混合感染的診治

胡玲玲 ， 湯德元 ， 曾智勇，王 彬 ， 黃 濤 ， 龍冬梅 ， 石遠菊 ， 葉 麗 ， 楊 偉 ， 李 波

(1.貴州大學動物科學學院 ， 貴州 貴陽 550025 ； 2.遵義市紅花崗區(qū)農(nóng)牧局 ， 貴州 遵義 563000)

2016年夏，貴州省某動物園國家一級保護動物黑葉猴4只均出現(xiàn)流涎、喘氣、消瘦、被毛脫落、全身無力等癥狀，其中2只發(fā)病1 d后死亡。該黑葉猴沒有接種過任何疫苗。為弄清病因，于是送檢發(fā)病死亡黑葉猴1只及發(fā)病猴血液2份到我校物動物醫(yī)院進行確診。根據(jù)臨床癥狀、病理剖檢和實驗室診斷，確診黑葉猴為支原體感染、鏈球菌及結(jié)核分支桿菌混合感染引起死亡?，F(xiàn)報道如下。

1 臨床癥狀

黑葉猴發(fā)病前身體消瘦，被毛脫落、粗亂，發(fā)病后心跳為100次/min、呼吸次數(shù)為79次/min，伴有喘氣、食欲下降、口鼻有半透明黏稠液體流出，同時出現(xiàn)輕度拉稀現(xiàn)象，隨著病情的發(fā)展發(fā)病黑葉猴出現(xiàn)全身無力、反應遲鈍、行走不穩(wěn)、心力衰竭和呼吸衰竭死亡。

2 剖檢變化

剖檢可見病死黑葉猴(10歲左右)腹腔有積液，胃腸充氣、有較厚的腸系膜脂肪覆蓋、胃腸黏膜未見明顯充血和出血；氣管及鼻腔中有大量黏稠液體；肺臟出現(xiàn)不同程度壞死灶及淤血斑(見中插彩版圖1)；肝臟表面有嚴重瘀斑(見中插彩版圖2)、變脆，邊緣部分出現(xiàn)壞死灶； 腎臟有大面積出血點(見中插彩版圖3)；脾臟色澤變深、變硬；心臟包囊有積液，也有少許瘀斑。

3 實驗室診斷

3.1 細菌分離培養(yǎng) 取死亡黑葉猴的內(nèi)臟及無菌采集的血液進行細菌分離培養(yǎng)，接種于血瓊脂培養(yǎng)基中，37 ℃ 恒溫箱中厭氧/需氧培養(yǎng) 24 h～48 h觀察細菌的生長狀態(tài)和菌落特征，然后挑取單個菌落進行純培養(yǎng)。結(jié)果在需氧和厭氧環(huán)境下，血瓊脂培養(yǎng)基中均有菌落生成，判定分離菌為兼性厭氧菌，培養(yǎng)24 h后能觀察到灰白色、露滴狀、表面光滑，邊緣整齊的菌落，菌落周圍有明顯的溶血環(huán)。革蘭染色鏡檢可見，藍紫色圓形、鏈狀革蘭陽性球菌(如圖4)。

3.2 細菌的生化特性鑒定 分離菌經(jīng) 24 h 純培養(yǎng)后，得到的純培養(yǎng)物接種于微量生化鑒定管中，37 ℃，5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24～48 h，結(jié)果該分離菌株能發(fā)酵葡萄糖、山梨糖、乳糖、麥芽糖、木糖、蔗糖、淀粉，不能利用6.5%氯化鈉、甘露醇、肌醇、0.1%美藍牛乳，不液化明膠，與標準菌株相比具有典型的鏈球菌的生化特性，根據(jù)經(jīng)生化試驗結(jié)果，再結(jié)合細菌培養(yǎng)特性，判斷該分離菌為鏈球菌。

圖4 10x100油鏡下的革蘭陽性鏈狀球菌

3.3 藥敏試驗 挑取單菌落于1 mL液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫震蕩培養(yǎng)1 h后均勻涂板于血瓊脂平板，而后間隔適當距離放置藥敏紙片。藥敏試驗結(jié)果顯示，對慶大霉素、林可霉素、阿莫西林、頭孢曲松、氨芐西林抑菌圈直徑<10.00 mm屬低敏；卡那霉素和青霉素抑菌圈均>13.00 mm屬中度敏感；而氧氟沙星抑菌圈為17.50 mm屬高敏。

3.4 支原體PCR檢測 剖檢采集黑葉猴的肺臟及口腔黏液，適量取樣研磨后反復凍融3次，勻漿器磨20 min后收集勻漿，12 000 r/min 離心10 min，取上清提取DNA(按支原體PCR檢測核酸提取試劑盒使用說明書)。用支原體PCR 檢測試劑盒(購自北京世紀元亨動物防疫技術(shù)有限公司)進行 PCR 檢測。反應體系為(總體積20 μL) ：16 μL PCR反應液，2 μLTapDNA 聚合酶，2 μL 模板 DNA。PCR擴增程序為：94 ℃3 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，35個循環(huán)；72 ℃ 延伸10 min。反應結(jié)束后取5 μL PCR產(chǎn)物于1% 1×TAE瓊脂糖凝膠中電泳檢測(90 V，30 min)，凝膠成像系統(tǒng)拍照記錄。結(jié)果顯示，病料中檢測出支原體特異性核酸陽性條帶(圖5)，測序結(jié)果與預期相符，說明黑葉猴為支原體感染。

3.5 結(jié)核分支桿菌的檢測 將送檢的2份發(fā)病黑葉猴血樣于4 ℃過夜，8 000 r/min 離心 10 min，分別吸取上清于全新離心管中，標記后嚴格按照結(jié)核分枝桿菌抗體檢測試劑盒(購自福建省明溪海天藍波生物技術(shù)有限公司)操作說明，按照判斷標準進行結(jié)核分枝桿菌抗體檢測。結(jié)果顯示結(jié)核分支桿菌檢測呈陽性。

圖5 黑葉猴支原體PCR檢測

4 確診

根據(jù)臨床癥狀、病理剖檢診斷及實驗室檢驗，確診該動物園黑葉猴為支原體、鏈球菌及結(jié)核分支桿菌混合感染。

5 防治

首先對有臨床癥狀的黑葉猴立即進行隔離飼養(yǎng)，并進行針對性治療。由于支原體無細胞壁，因此應選擇作用于細菌蛋白質(zhì)合成的相關藥物治療效果較好。所以本次對該動物園黑葉猴支原體及鏈球菌混合感染的具體治療方法為：左氧氟沙星1片/次，2次/d；卡那霉素，3～5 mL/次，2次/d；連用5 d；并結(jié)合中藥處方白礬散加減：白礬5 g、白芷5 g、浙貝母5 g、葶藶子5 g、黃連5 g、黃芩5 g、大黃4 g、郁金5 g、甘草5 g、桔梗5 g、紫苑5 g、冬花5 g、水煎后加蜂蜜25 g，每天3次灌服，連用3劑，用藥時應使用足夠劑量與療程。而針對結(jié)核分支桿菌的感染主要是以預防為主，加強引進檢疫制度，并用卡介苗進行預防接種后，隔離觀察；由于結(jié)核病為人獸共患病，因此加強養(yǎng)殖人員的自身防護也應引起高度重視。此外，患病黑葉猴群除隔離治療以外還需帶猴消毒，并對被糞便、血液等的污染物及棄尸地、圈舍、用具等用10%漂白粉嚴格消毒，病死黑葉猴及污染物則徹底焚燒或深埋。糞便堆積后用5%氫氧化鈉液表面消毒后生物熱處理，并對水源、圈舍等黑葉猴活動過的地方用0.5%消特靈進行噴灑消毒，1次/d，連續(xù)消毒3 d。

其次對黑葉猴進行免疫接種，能有效的預防和控制支原體肺炎的發(fā)生；在幼猴1月齡時進行滅活苗的免疫，肌肉注射，每頭接種0.5 mL，2周后加強免疫1 mL，能起到很好的防治效果。