半自動(dòng)化結(jié)核桿菌掃描儀與萋-尼法人工鏡檢對(duì)分枝桿菌的診斷價(jià)值

岳永寧，張艷，胡鈺卿，李浩，陳園園，鮑志堅(jiān)

（杭州市紅十字會(huì)醫(yī)院，浙江 杭州 310003）

痰涂片檢查一直以來(lái)都是臨床診斷結(jié)核病重要的診斷依據(jù)，涂陽(yáng)肺結(jié)核患者的檢出仍然是我國(guó)實(shí)施結(jié)核病防治規(guī)劃的重要手段。目前痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化方法為萋-尼法，此方法要求鏡檢工作人員用100倍油鏡觀察50~300個(gè)不同視野，需花費(fèi)很長(zhǎng)時(shí)間，有可能造成漏檢。而半自動(dòng)化結(jié)核桿菌掃描儀大大減輕了結(jié)核檢驗(yàn)人員的工作量，節(jié)省了人力成本。為檢驗(yàn)結(jié)核桿菌掃描儀的應(yīng)用效能，本研究通過(guò)該儀器檢測(cè)了225例疑似肺結(jié)核患者的痰標(biāo)本225張，同時(shí)與人工鏡檢法相比較，以羅氏培養(yǎng)（L-J培養(yǎng)法）為金標(biāo)準(zhǔn)，研究其對(duì)分枝桿菌檢出的敏感度和特異度，探討結(jié)核桿菌掃描儀的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源 選擇2017年4月于浙江省結(jié)核病診療中心首次住院患者，按照臨床癥狀和體征、以及系列相關(guān)檢測(cè)疑似為肺結(jié)核的患者225例。收集患者未用抗結(jié)核藥物前的痰液標(biāo)本2~5mL，制作痰涂片一張用于萋-尼染色法人工鏡檢和半自動(dòng)化結(jié)核桿菌掃描儀鏡檢。剩余痰液標(biāo)本進(jìn)行L-J培養(yǎng)法檢測(cè)。

1.2 儀器與試劑 （1）儀器：光學(xué)顯微鏡為日本奧林巴斯CX21，采用100倍油鏡觀察。結(jié)核桿菌掃描儀JHSMY （上海皓信生物技術(shù)有限公司）。（2）試劑：萋-尼染色法染色液由上海皓信生物技術(shù)有限公司提供。酸性羅氏培養(yǎng)基由珠海貝索生物技術(shù)有限公司提供。

1.3 方法

1.3.1 痰涂片抗酸染色鏡檢 （1）取痰標(biāo)本的膿性，干酪樣部分約0.05~0.10mL，于玻片正面的右側(cè)2/3中央處均勻涂抹成面積約為10mm×20mm的橢圓形痰膜。用于萋-尼抗酸染色，萋-尼染色按《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè)》的標(biāo)準(zhǔn)[1]進(jìn)行。（2）由1名經(jīng)驗(yàn)豐富的工作人員用生物顯微鏡進(jìn)行鏡檢，用100倍的油鏡從左至右觀察，每行觀察100個(gè)視野，觀察三行共300個(gè)視野。在藍(lán)色背景下分枝桿菌呈紅色桿狀。結(jié)核桿菌掃描儀每次掃描5張?zhí)灯?，掃描范圍為痰片中?00個(gè)不重復(fù)視野，篩查可疑視野，最終按《中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢質(zhì)量保證手冊(cè)》的標(biāo)準(zhǔn)[2]進(jìn)行人工確認(rèn)。

1.3.2 L-J培養(yǎng) 將1～2倍的4%氫氧化鈉（NaOH）溶液加入標(biāo)本中，用渦旋振蕩器振蕩，直至痰液標(biāo)本充分液化，室溫靜置15分鐘后，吸100mL處理好的痰液標(biāo)本于培養(yǎng)基斜面上，放入（36±1）℃的孵箱內(nèi)孵育。接種后第3和7天觀察培養(yǎng)情況，此后每周觀察1次，至第8周末后未生長(zhǎng)的判為陰性[2]。

1.4 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 萋-尼染色液和酸性羅氏培養(yǎng)基均采用分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv進(jìn)行染色和生長(zhǎng)試驗(yàn)驗(yàn)證，酸性羅氏培養(yǎng)基經(jīng)24小時(shí)無(wú)菌測(cè)試合格后使用。萋-尼染色及羅氏培養(yǎng)過(guò)程中均同時(shí)采用陰陽(yáng)性對(duì)照進(jìn)行質(zhì)量控制，其中萋-尼染色采用滅活的標(biāo)準(zhǔn)菌株H37Rv混合在陰性痰標(biāo)本中制備成涂片作陽(yáng)性對(duì)照，正常人痰液作陰性對(duì)照。羅氏培養(yǎng)則采用H37Rv結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株作陽(yáng)性、高壓后無(wú)菌去離子水作陰性對(duì)照。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0對(duì)萋-尼染色法人工鏡檢和結(jié)核桿菌掃描儀鏡檢結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料以（±s）表示，尤登指數(shù)=敏感度+特異度-1。

2 結(jié)果

檢測(cè)時(shí)間儀器鏡檢組為（2.0±0.0）分鐘，人工鏡檢為（4.8±0.8）分鐘，兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。以羅氏培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果為診斷結(jié)核病的金標(biāo)準(zhǔn)，儀器鏡檢與人工鏡檢的敏感度分別為55.31%（26/47） 和 42.55%（20/47）， 特異度分別為95.51% （170/178）和 99.44%（177/178），尤登指數(shù)分別為0.51和0.42。詳見(jiàn)表1。

表1 儀器鏡檢與人工鏡檢結(jié)果比較（n）

3 討論

萋-尼染色鏡檢法作為診斷結(jié)核病不可缺少的基本實(shí)驗(yàn)室檢查，可將桿菌分為抗酸陽(yáng)性桿菌和抗酸陰性桿菌。抗酸陽(yáng)性桿菌是診斷分枝桿菌的有力證據(jù)。所以萋-尼染色鏡檢法廣泛應(yīng)用于結(jié)核病的診斷[3]。傳統(tǒng)的萋-尼染色鏡檢法為人工顯微鏡檢查，存在費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、陽(yáng)性率低等缺點(diǎn)，而作為分枝桿菌金標(biāo)準(zhǔn)的羅氏培養(yǎng)法其檢測(cè)周期較長(zhǎng)。半自動(dòng)化結(jié)核桿菌掃描儀在縮短鏡檢時(shí)間方面具有很大的優(yōu)勢(shì)，按規(guī)程要求，人工鏡檢每個(gè)工作日讀片不能超過(guò)25張，且連續(xù)讀片10~12張后應(yīng)休息20分鐘左右，故每天讀片量受到限制。半自動(dòng)化結(jié)核桿菌掃描儀可以不間斷進(jìn)行鏡檢，大大提高了讀片量和工作效率。

以羅氏培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)一步分析萋-尼染色法人工鏡檢與半自動(dòng)化結(jié)核桿菌掃描儀的診斷效能，儀器鏡檢與人工鏡檢的敏感度分別為55.31%和42.55%，特異度分別為95.51%和99.44%，尤登指數(shù)分別為0.51和0.42，儀器鏡檢的診斷效能均高于人工鏡檢。但與羅氏培養(yǎng)檢測(cè)結(jié)果比較，萋-尼染色法檢測(cè)的敏感度較低[4]，特異度則較高。

本文225例中有14例兩種鏡檢方法檢測(cè)結(jié)果不一致，其中1例人工鏡檢為陽(yáng)性而半自動(dòng)化結(jié)核桿菌掃描儀鏡檢為陰性，13例人工鏡檢為陰性而半自動(dòng)化結(jié)核桿菌掃描儀鏡檢陽(yáng)性。分析其原因發(fā)現(xiàn)，14例鏡檢結(jié)果陽(yáng)性級(jí)別較低（1~3條）。半自動(dòng)化結(jié)核桿菌掃描儀只對(duì)涂片中心位置進(jìn)行300視野的鏡檢，所以陽(yáng)性級(jí)別較低的涂片可能會(huì)因?yàn)橐曇暗拿^(qū)而導(dǎo)致漏檢。如果改進(jìn)技術(shù)，對(duì)痰涂片做全片掃描鏡檢，就完全可以降低其漏診率，提高診斷分枝桿菌的準(zhǔn)確率。人工鏡檢未檢出原因可能是鏡檢人員出現(xiàn)視覺(jué)疲勞，導(dǎo)致漏檢。

綜上所述，半自動(dòng)化結(jié)核桿菌掃描儀鏡檢比人工鏡檢有優(yōu)勢(shì)，該技術(shù)大大縮短了鏡檢的時(shí)間，減輕了工作量，最重要的是，此法較人工鏡檢有更高的敏感度和特異度。故半自動(dòng)化結(jié)核桿菌掃描儀可用于結(jié)核實(shí)驗(yàn)室對(duì)痰涂片的篩查，對(duì)分枝桿菌的診斷比萋-尼染色法人工鏡檢更有價(jià)值。

[1]中國(guó)疾病預(yù)防控制中心.中國(guó)結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標(biāo)準(zhǔn)化操作及質(zhì)量保證手冊(cè).北京：中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)出版社，2009：7

[2]趙雁林.分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè).北京：人民衛(wèi)生出版社，2013：4

[3]張登才，劉斌，張麗華.等.抗酸染色在結(jié)核病病理診斷中的價(jià)值.中國(guó)防癆雜志，2014，36（4）：274

[4]Van Deun A，Hamid Salim A，Aung KJ，et al.Performance ofvariations of carbolfuchsin staining of sputum smears for AFBunderfieldeonditions.IntJTubercLungDis，2005，9（10）：1127