霉菌發(fā)酵食品中桔霉素的免疫親和柱結(jié)合高效液相熒光法檢測

李楠，陳俊霖，顧雙，王向陽，練志峰，付蕾，程周周

(浙江工商大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，杭州　310018)

桔霉素(citrinin)，也稱桔青霉素，是一種由青霉、曲霉及紅曲霉產(chǎn)生的真菌毒素[1-4]。桔霉素主要作用的靶器官是腎臟，具有腎毒性[5]，其常用于制作紅曲色素及紅色米酒等，目前已有大量報道明確指出紅曲霉及其產(chǎn)品均能產(chǎn)生桔霉素[6-8]。米曲霉和黑曲霉常用于生產(chǎn)醬油，曲霉、紅曲霉常用于生產(chǎn)黃酒，這些菌種及其產(chǎn)品均易產(chǎn)生桔霉素[9，10]，另外米醋和腐乳也發(fā)現(xiàn)了桔霉素的存在[11，12]。受過潮的糧食容易出現(xiàn)發(fā)霉，這可能導(dǎo)致桔霉素的產(chǎn)生，土耳其50%小麥中含有桔霉素[13]；從水果、果汁、谷物中分離得到的青霉菌85%會產(chǎn)生桔霉素[14]。以往我國主要針對少數(shù)出口產(chǎn)品檢測桔霉素，市場上僅僅檢測紅曲產(chǎn)品，主要標(biāo)準(zhǔn)有 GB/T 5009.222-2008、SN/T 2426-2010和SN/T 2916-2011[15-17]。在2016年，我國推出了食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5009.222-2016《食品中桔青霉素的測定》，說明我國對食品中桔霉素可能的危害有了進(jìn)一步重視。該標(biāo)準(zhǔn)第一法采用桔青霉素免疫親和柱預(yù)純化，適用于大米、玉米、辣椒、紅曲類產(chǎn)品中桔青霉素的測定；第二法采用C18柱預(yù)純化，適用于大米、大麥、燕麥、小麥中桔青霉素的測定。但僅涉及容易長霉的谷類和辣椒以及添加紅曲發(fā)酵的產(chǎn)品，而對于其他大量食品缺少檢測標(biāo)準(zhǔn)，如醬油、黃酒等液體食品等。目前桔霉素的檢測方法主要有高效液相色譜法[18-22]，少數(shù)人使用色譜質(zhì)譜法[23-25]，另外還有免疫分析法[26-28]、毛細(xì)管電泳分析法[29]，早期還有薄層層析法[30]。

1　材料與方法

1.1　試驗材料

食品原料：2種醬油、3種黃酒、1種紅曲粉，購于杭州市場。

1.2　主要試劑和設(shè)備

桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品、桔青霉素免疫親和柱：購于北京泰樂祺科技有限公司；其他試劑：購于杭州禾德化工有限公司。

高效液相色譜儀和FD-20A熒光檢測器日本島津公司；R-220旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國Buchi公司。

1.3　實驗方法

1.3.1桔霉素的檢測

參考SNT 2916-2011和GB 5009.222-2016。高效液相色譜儀，ODS柱(Hypersil ODS 2,5 μm, 250 mm×4.6 mm)；流動相：乙腈(色譜純)∶三氟乙酸水溶液(pH 2.5)為60∶40。流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量10 μL，柱溫：25 ℃，檢測器：RF-20A 熒光檢測器，檢測波長為λex331 nm，λem500 nm。將桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇稀釋成0.01，0.1，0.2，0.5，1 μg/mL，HPLC檢測后制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

檢測波長參考GB 5009.222-2016第二法和SN/T 2916-2011的激發(fā)波長331 nm，發(fā)射波長500 nm。不同于GB 5009.222-2016第一法的激發(fā)波長350 nm，發(fā)射波長500 nm。本檢測的柱溫為25 ℃，稍低于GB 5009.222-2016第一法的30 ℃和第二法的28 ℃。

本檢測的流動相與SN/T 2916-2011的流動相相同，與GB 5009.222-2016流動相不同。GB 5009.222-2016第一法檢測大米、玉米、辣椒的流動相 A 液:乙腈，流動相 B 液: 10 mmol/L 磷酸(pH 2.5)；紅曲類產(chǎn)品的流動相A液:乙腈，流動相B液: 0.1%磷酸。采用梯度洗脫；第二法流動相為乙腈-異丙醇-磷酸溶液(35∶10∶55)。

本檢測的進(jìn)樣量為10 μL。GB 5009.222-2016的進(jìn)樣量為50 μL；SN/T 2916-2011標(biāo)品的進(jìn)樣量為5 μL，樣品的進(jìn)樣量為100 μL。

本檢測桔霉素的出峰保留時間為6.1 min左右，標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程：y=46455x+55766，R2=0.999，線性關(guān)系良好。測得儀器的桔霉素的檢測限與定量限分別為5，20 μg/kg。

1.3.2桔霉素的分離提取

提取方法參考GB 5009.222-2016第一法和SN/T 2916-2011。粉末樣品直接稱取10.0 g，加入50 mL提取液甲醇∶水(70∶30，體積比)。液體樣品量取50 mL，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在(45±2) ℃下，濃縮至無液體滴出。加入50 mL上述提取液。超聲提取20 min，經(jīng)磁力攪拌器高速攪拌3 min后，玻璃纖維濾紙過濾，收集濾液。吸取1 mL濾液，加0.05% pH 7.5三氟乙酸水溶液(用2 mol/L NaOH調(diào)節(jié)pH)，50 mL定容，再次過濾。

紅曲粉提取與GB 5009.222-2016第一法和SN/T 2916-2011相同。GB 5009.222-2016第二法提取溶劑:乙腈-異丙醇-水(35∶10∶55)，用磷酸調(diào)pH為1.5。與本提取差異較大。

本提取的定容溶液與SN/T 2916-2011相同。GB 5009.222-2016的定容溶液與本方法差異較大。其第一法的定容溶液為10 mmol/L pH 7.5磷酸溶液(大米、玉米、辣椒)和pH 7.0 PBS (磷酸緩沖液)溶液(紅曲類)；第二法的定容溶液為pH 1.5的磷酸水。

GB 5009. 222-2016和SN/T 2916-2011沒有檢測液體樣品，因此醬油和黃酒按照自己方法提取。

1.3.3純化方法

參照國標(biāo)SN/T 2916-2011修改。樣品液體1～2滴/s流速，流過桔青霉素免疫親和柱子，加壓至無液體滴出。用5 mL 的0.05% pH 7.5三氟乙酸水溶液洗去雜質(zhì)，以1～2滴/s 的流速通過柱子，加壓至無液體流出，棄去全部流出液。以體積比為70∶30的甲醇∶0.05% pH 2.5三氟乙酸水溶液作為洗脫劑，以1～2 滴/s流速進(jìn)行洗脫。

洗脫液用量實驗：取0.01 μg/mL的桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 mL按照上述方法實驗。每隔1 mL，收集第1～10 mL洗脫液，過0.45 μm有機(jī)濾膜后，進(jìn)HPLC-FLD檢測。實驗發(fā)現(xiàn)收集至3 mL后只有微量的桔霉素。因此，本實驗選擇洗脫液用量為5 mL。而SN/T 2916-2011洗脫液用量為1 mL。

GB 5009.222-2016第一法對大米、玉米和辣椒用5 mL的10 mmol/L磷酸(pH 7.5)洗柱子，對紅曲類用10 mL的0.1%吐溫20-PBS溶液洗柱子。而洗脫液前者用1 mL洗脫液I：70% 甲醇-10 mmol/L磷酸溶液(pH 2.5)，后者用1 mL洗脫液Ⅱ:70%甲醇-0.1%磷酸溶液。而GB 5009.222-2016第二法采用C18固相萃取柱，用 5 mL水淋洗柱子，用10 mL甲醇洗脫，與本測定差異較大。

1.3.4食品檢測的精密度、檢測限和定量限實驗

取樣品紅曲粉5份，每份10.0 g，取紅曲粉提取液，經(jīng)過桔青霉素免疫親和柱純化、HPLC-FLD檢測，對所得的5次峰面積進(jìn)行統(tǒng)計分析，了解測試精密度。

上述純化后的液體，稀釋不同濃度，HPLC-FLD檢測。分別取信噪比3∶1，10∶1時的濃度作為其檢測限和定量限。

1.3.5親和免疫柱回收率實驗

分別以50 mL醬油、黃酒及10 g紅曲粉為實驗對象，分別加入4，6，8 μg桔霉素標(biāo)準(zhǔn)品，預(yù)處理和檢測方法如上，測定桔霉素回收率。

2　結(jié)果與分析

2.1　紅曲粉中桔霉素檢測精密度、檢測限和定量限

紅曲粉樣品經(jīng)免疫親和柱凈化處理后能夠與其他雜質(zhì)分開，見圖1。

圖1　紅曲粉樣品經(jīng)免疫柱凈化后的色譜圖Fig.1 HPLC chromatography of Monascus powder after purified by immunoaffinity column

樣品所得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.823%，GB 5009.222-2016對精密度的要求是在重復(fù)條件下獲得的2次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的 10%，顯然該方法具有良好的平行性精密度，符合實驗要求，見表1。紅曲粉經(jīng)過免疫親和柱處理的檢測限和定量限分別為16，54 μg/kg，不過柱處理的檢測限為195，649 μg/kg。經(jīng)過純化后，桔霉素檢測限和定量限下降10倍多，見表2。GB 5009.222-2016紅曲及其制品的檢出限和定量限分別為 25，80 μg/kg。顯然檢出限和定量限也符合要求。

表1　方法平行性精密度實驗Table 1 Precision of parallelity of the method

表2　樣品經(jīng)免疫親和柱處理后桔霉素檢出限和定量限(n=3)Table 2 Citrinin detection limit and quantitation limit in samples treated with purification column(n=3)

國標(biāo)中第一種檢測方法采用桔青霉素免疫親和柱預(yù)純化方法的紅曲及其制品的檢出限25 μg/kg、定量限80 μg/kg，比大米、玉米、辣椒粉樣品的檢出限8 μg/kg、定量限25 μg/kg高。紅曲及其制品中對桔霉素檢測的干擾物質(zhì)可能較多。而國標(biāo)中第二種檢測方法采用C18柱預(yù)純化大米、大麥、燕麥、小麥，其檢出限為3 μg/kg、定量限為10 μg/kg，與大米相比較，顯然后者方法更好?？赡芘c凈化方法，或者檢測激發(fā)波長不同有關(guān)。我們采用后者激發(fā)波長，采用前者預(yù)純化方法，但是純化的洗雜液和洗脫液與國標(biāo)不同。

2.2　免疫親和柱純化的回收率

GB 5009.222-2016對桔霉素檢測回收率沒有要求。已經(jīng)作廢的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2916-2011對利用免疫親和柱檢測紅曲粉、大米、玉米、辣椒粉的桔霉素的回收率要求在70.25%～88.65%。本方法紅曲粉、黃酒、醬油經(jīng)免疫親和柱純化處理后其平均回收率分別為84.72%，86.22%，80.34%。醬油雜質(zhì)多，回收率相對較低，見表3。

表3　免疫吸附法桔霉素回收率Table 3 Citrinin recoveries after immunoaffinity column

續(xù)　表

2.3　食品樣品中桔霉素的含量

三類食品中桔霉素含量最高的是醬油，為2.45～2.52 μg/mL，其次是黃酒，為0.63～1.91 μg/mL，這與它們均是由曲霉發(fā)酵而來的有關(guān)。紅曲粉的桔霉素為0.64 μg/g，這與紅曲霉具有產(chǎn)生桔霉素基因有關(guān)，見表4。表4由于抽樣比例較少，初步了解這些產(chǎn)品可能含有桔霉素，尚不能反映這些產(chǎn)品的桔霉素的整體情況。

表4　食品樣品的桔霉素含量表 (n=3)Table 4 The content of citrinin in food (n=3)

3　結(jié)論

紅曲采用70% 甲醇-水(V/V)提取，0.05% pH 7.5三氟乙酸水溶液定容。樣品用桔青霉素免疫親和柱子純化，用5 mL 的0.05% pH 7.5三氟乙酸水溶液洗去雜質(zhì)，再以55 mL體積比為70∶30的甲醇∶0.05% pH 2.5三氟乙酸水溶液作為洗脫劑洗脫。純化后的樣品采用高效液相色譜儀、ODS柱。流動相：乙腈∶三氟乙酸水溶液(pH 2.5)為60∶40。流速為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為10 μL，柱溫為25 ℃，熒光檢測器的檢測波長為λex331 nm，λem500 nm。紅曲粉經(jīng)過免疫親和柱處理的檢測限和定量限分別為16，54 μg/kg，樣品所得相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為0.823%。紅曲粉、黃酒、醬油的平均回收率分別為84.72%，86.22%，80.34%。利用該測定方法，測得市售醬油、黃酒、紅曲粉的桔霉素的含量分別為2.45～2.52 μg/mL，0.63～1.91 μg/mL和0.64 μg/g。

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