八角茴香揮發(fā)油超聲輔助提取及抗氧化性研究

謝志新，陳琳琳，張文州，William Chandler

(1.泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校 藥學(xué)院，福建 泉州　362000；2.美國(guó)泰森食品有限公司，上海　200021)

八角茴香，別名八角大茴、大八角、大茴香等，系木蘭科八角屬植物八角茴香的干燥成熟果實(shí)，主要分布在廣西、云南等省份，為我國(guó)的特產(chǎn)辛香料和中藥[1]。八角茴香富含揮發(fā)油、糖苷類、黃酮類、莽草酸等多種天然活性成分，其中揮發(fā)油含量最高，約占5%～8%[2]，八角茴香揮發(fā)油氣味芳香持久、味甜，常作為辛香料廣泛用于牙膏、香皂、甜香酒等行業(yè)，是食品行業(yè)、化學(xué)工業(yè)的重要原料。中醫(yī)理論認(rèn)為八角茴香油具有溫陽(yáng)散寒、理氣止痛的功效，用于治療寒疝腹痛、腎虛腰痛等。近年來(lái)有研究表明八角茴香還具有廣譜的抗菌作用，抗疲勞、抗氧化等功效[3-6]。因此，八角茴香揮發(fā)油還可作為抑菌劑用于醫(yī)學(xué)或制藥行業(yè)，也可作為天然保鮮劑廣泛用于食品保鮮，避免被氧化變質(zhì)[7]。

目前，國(guó)內(nèi)外八角茴香油的提取方法主要有水蒸氣蒸餾法[8]、超臨界CO2提取法[9]、溶劑萃取法[10]、超聲波輔助萃取法等[11]，不同的提取方法得到的揮發(fā)油產(chǎn)率和質(zhì)量都不一樣。由于水蒸氣蒸餾法提取時(shí)間長(zhǎng)、提取率低，而超臨界CO2萃取法也由于設(shè)備昂貴、生產(chǎn)成本高導(dǎo)致其工業(yè)化的應(yīng)用受限。超聲波輔助提取法由于超聲波可加速中藥有效成分的溶解、擴(kuò)散，具有操作簡(jiǎn)單、提取率高和提取時(shí)間短等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)在整個(gè)提取過(guò)程中溫度升高不顯著，從而能更好地保持揮發(fā)油特有的風(fēng)味[12,13]。因此，本實(shí)驗(yàn)選取超聲波輔助乙醇提取法進(jìn)行研究，以料液比、粉碎粒徑、超聲時(shí)間3個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，以獲得提取揮發(fā)油的最佳工藝參數(shù)，同時(shí)測(cè)定其對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的清除能力，并與維生素C標(biāo)準(zhǔn)品作對(duì)照，研究其體外的抗氧化活性，從而使八角茴香應(yīng)用價(jià)值得到更有效的利用。

1　材料與儀器

1.1　材料

八角茴香：購(gòu)于泉州市東南醫(yī)藥連鎖公司，經(jīng)泉州醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校生物學(xué)專業(yè)黃秀珍教授鑒定。

1.2　主要儀器和試劑

1.2.1儀器

FA2004電子分析天平上海良平儀器儀表有限公司；VCX500超聲波細(xì)胞破碎儀美國(guó)SONICS公司；DK450B恒溫水浴箱上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；DXF-20D高速萬(wàn)能粉碎機(jī)廣州大祥電子機(jī)械設(shè)備公司；DHG-9140A鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器公司；752紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)上海光譜儀器廠。

1.2.2試劑

95%乙醇冰乙酸(AR，西隴化工有限公司)；維生素C標(biāo)準(zhǔn)品(上海江萊生物科技公司)；羥自由基測(cè)試盒、抗超氧陰離子自由基測(cè)試盒(南京建成生物研究所)；DPPH(BR，Sigma公司)。

2　試驗(yàn)方法

2.1　單因素試驗(yàn)

2.1.1料液比因素的考察

將八角茴香置于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，過(guò)60目藥篩，精確稱取未浸泡和超聲處理的藥材粉末10.000 g，共5份，裝入濾紙筒中，搭好索氏提取裝置，分別加入1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，1∶30的95%乙醇，用電熱套加熱30 min，收集乙醇提取液，濃縮得八角茴香揮發(fā)油，稱重并計(jì)算提取率,提取率(%)=m1/M2×100。式中：m1為八角茴香揮發(fā)油質(zhì)量(g)，M2為八角茴香藥材粉末質(zhì)量(g)。

2.1.2粉碎度因素的考察

在已經(jīng)確定的最佳料液比基礎(chǔ)上，將八角茴香置于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，分別過(guò)20，40，60，80，100目的藥篩，精確稱取未浸泡和超聲處理的藥材粉末10.000 g，共5份，分別裝入濾紙筒中，搭好索氏提取裝置，按1∶20的料液比加入95%乙醇，用電熱套加熱30 min，收集乙醇提取液，濃縮得八角茴香揮發(fā)油，稱重并計(jì)算提取率,提取率(%)=m1/M2×100%。式中：m1為八角茴香揮發(fā)油質(zhì)量(g)，M2為八角茴香藥材粉末質(zhì)量(g)。

2.1.3超聲時(shí)間因素的考察

在已經(jīng)確定的最佳料液比、最佳粉碎粒徑基礎(chǔ)上，將八角茴香置于60 ℃烘箱中烘干，粉碎，藥篩，精確稱取未浸泡的藥材粉末10.000 g，共5份，分別裝入密閉容器中，加入約100 mL的95%乙醇，置于超聲波細(xì)胞破碎儀上超聲，功率為200 W，時(shí)間分別為10，20，30，40，50 min，之后分別裝入濾紙筒中，搭好索氏提取裝置，按1∶20的料液比加入95%乙醇，用電熱套加熱30 min，收集乙醇提取液，濃縮得八角茴香揮發(fā)油，稱重并計(jì)算提取率，提取率(%)=m1/M2×100。式中：m1為八角茴香揮發(fā)油質(zhì)量(g)，M2為八角茴香藥材粉末質(zhì)量(g)。

2.2　測(cè)定方法

2.2.1羥自由基清除率的測(cè)定[14]

利用羥自由基測(cè)定試劑盒，利用Fenton反應(yīng)體系，采用分光光度法對(duì)羥自由基清除率進(jìn)行測(cè)定，清除率(%)=(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照×100。式中：A對(duì)照為底物應(yīng)用液的吸光度， A樣品為樣品試驗(yàn)組的吸光度。

2.2.2超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定

利用抗超氧陰離子自由基測(cè)試盒，利用黃嘌呤-黃嘌呤氧化酶反應(yīng)系統(tǒng)，采用分光光度法對(duì)超氧陰離子自由基清除率進(jìn)行測(cè)定，清除率(%)=(A對(duì)照-A樣品)/A對(duì)照×100。式中：A對(duì)照為蒸餾水及試劑應(yīng)用液的吸光度，A樣品為樣品試驗(yàn)組的吸光度。

2.2.3DPPH自由基清除率的測(cè)定

參考Capek等[15]的試驗(yàn)方法并進(jìn)行適當(dāng)改進(jìn)， DPPH自由基清除率=[1-(As-Ab)/Ac]×100。式中：As為樣液試驗(yàn)組的吸光度，Ab為樣液本底組的吸光度，Ac為空白對(duì)照組的吸光度。

2.2.4試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007等軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析。

3　試驗(yàn)結(jié)果與分析

3.1　八角茴香揮發(fā)油提取單因素試驗(yàn)結(jié)果

3.1.1料液比對(duì)揮發(fā)油提取率的影響

表1　料液比因素考察結(jié)果Table 1 The solid-liquid ratio factor investigation results

由表1可知，隨著料液比的增加，提取率呈上升趨勢(shì)，在1∶20時(shí)揮發(fā)油提取率達(dá)到最高，當(dāng)料液比再增加時(shí)提取率不升反降。因此，綜合考慮提取效果和溶劑用量選擇料液比為1∶20。

3.1.2粉碎粒徑對(duì)揮發(fā)油提取率的影響

表2　粉碎粒徑因素考察結(jié)果Table 2 The crushing particle size factor investigation results

由表2可知，揮發(fā)油的提取率并不是隨著粉碎粒徑的增加而升高，即藥材并不是粉碎得越細(xì)越好，而是粉碎到能過(guò)60目藥篩時(shí)達(dá)到高峰，這主要是因?yàn)樗幉姆鬯檫^(guò)細(xì)可導(dǎo)致油室或油細(xì)胞破碎過(guò)多，在粉碎過(guò)程中造成揮發(fā)油的損失。因此揮發(fā)油提取的最佳藥材粉碎粒徑為60目。

3.1.3超聲時(shí)間對(duì)揮發(fā)油提取率的影響

表3　超聲時(shí)間因素考察結(jié)果Table 3 The ultrasonic time factor investigation results

由表3可知，揮發(fā)油的提取率在超聲30 min時(shí)達(dá)到高峰，隨著超聲時(shí)間的延長(zhǎng)，提取率時(shí)高時(shí)低，但均未超過(guò)30 min時(shí)的高峰值。因此揮發(fā)油提取的最佳超聲時(shí)間為30 min。

3.1.4超聲波輔助提取揮發(fā)油的工藝優(yōu)化

根據(jù)料液比、粉碎粒徑、超聲時(shí)間單因素的試驗(yàn)結(jié)果，選取3個(gè)水平，進(jìn)行正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，正交試驗(yàn)因素水平表及試驗(yàn)結(jié)果分別見(jiàn)表4和表5，以提取率為考察指標(biāo)，研究各因素對(duì)提取率的影響，從而確定最佳提取工藝參數(shù)。

表4　超聲波輔助法提取因素水平表Table 4 The factors and levels of ultrasonic-assisted extraction method

表5　超聲波輔助提取法正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 5 The orthogonal experiment design and results of ultrasonic-assisted extraction method

由表5可知，極差RA>RB>RC，即各因素對(duì)揮發(fā)油提取的影響程度為藥材的料液比>粉碎粒徑>超聲時(shí)間；再通過(guò)K值的比較分析可知：KA1>KA3>KA2，KB2>KB1>KB3，KC2>KC3>KC1，即A1B2C2是揮發(fā)油提取的最優(yōu)組合。因此，基于以上的分析可確定超聲波輔助乙醇提取法的最佳提取工藝條件為料液比1∶15、粉碎粒徑60目、超聲時(shí)間30 min、提取率28.501%，得到的揮發(fā)油為淺褐色的膏狀物，略帶粘稠，具有八角茴香芳香氣味。

按正交試驗(yàn)表所得的最佳提取工藝條件，平行提取3次，提取率分別為28.316%，28.487%，28.512%，均值為(28.438±0.11)%。

3.2　清除羥自由基的能力

圖1　維生素C標(biāo)準(zhǔn)品與八角茴香揮發(fā)油對(duì)羥自由基的清除能力Fig.1 The scavenging abilities of vitamin C standard and star anise volatile oil to hydroxyl free radical

由圖1可知，八角茴香揮發(fā)油和維生素C標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)羥自由基均有較好的清除效果，且清除能力隨著濃度的增加而逐漸加強(qiáng)，同時(shí)在一定濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，線性方程分別為y=3.7119x+31.655，R2=0.9818；y=316.99x+43.496，R2=0.9924，其半數(shù)清除率IC50分別為4.9422，0.0205 mg/mL，當(dāng)八角茴香揮發(fā)油濃度為12.00 mg/mL時(shí)清除率與維生素C標(biāo)準(zhǔn)品0.12 mg/mL的清除率相當(dāng)，可達(dá)78.56%。羥自由基是高反應(yīng)性的自由基，其反應(yīng)距離短、速度快、攻擊力強(qiáng)，是組織細(xì)胞衰老、炎癥、心腦血管疾病的重要誘導(dǎo)因素之一。八角茴香揮發(fā)油對(duì)羥自由基的高清除效果能起到很好的抗氧化、抗炎作用。

3.3　清除超氧陰離子自由基的能力

圖2　維生素C標(biāo)準(zhǔn)品與八角茴香揮發(fā)油對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力Fig.2 The scavenging abilities of vitamin C standard and star anise volatile oil to superoxide anion free radical

由圖2可知，八角茴香揮發(fā)油和維生素C標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)超氧陰離子自由基的清除能力隨著濃度的增加而呈上升趨勢(shì)，在測(cè)定的濃度范圍內(nèi)兩者均有較好的線性關(guān)系，線性方程分別為y=4.7792x+12.487，R2=0.9914；y=164.3x+10.058，R2=0.9934，其IC50分別為7.8492，0.2408 mg/mL。超氧陰離子自由基本身雖不直接誘導(dǎo)生物和食品體系的脂類氧化，但可以通過(guò)連鎖反應(yīng)產(chǎn)生高活性的羥自由基，因此，通過(guò)對(duì)超氧陰離子自由基的清除也能達(dá)到抗氧化作用。

3.4　清除DPPH自由基的能力

圖3　維生素C標(biāo)準(zhǔn)品與八角茴香揮發(fā)油DPPH自由基的清除能力Fig.3 The scavenging abilities of vitamin C standard and star anise volatile oil to DPPH free radical

由圖3可知，八角茴香揮發(fā)油和維生素C標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)DPPH自由基也表現(xiàn)出一定的清除能力，但是清除效果均不理想，八角茴香揮發(fā)油濃度為6.00 mg/mL時(shí)清除率與維生素C標(biāo)準(zhǔn)品0.200 mg/mL的清除率相當(dāng)，僅為49.46%左右；在低濃度范圍內(nèi)八角茴香揮發(fā)油的清除效果甚至優(yōu)于維生素C標(biāo)準(zhǔn)品。在測(cè)定濃度間兩者均具有明顯的劑量效應(yīng)，線性方程分別為y=4.5894x+21.555，R2=0.9914；y=187.46x+7.8784，R2=0.9897其IC50分別為6.1980，0.2247 mg/mL。

3.5　八角茴香揮發(fā)油與維生素C標(biāo)準(zhǔn)品的抗氧化性比較

圖4　八角茴香揮發(fā)油與維生素C標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)自由基半數(shù)清除率的對(duì)比圖Fig.4 The comparison of IC50 of star anise volatile oil and vitamin C standard

由圖4可知，通過(guò)比較八角茴香揮發(fā)油及維生素C標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基的IC50，八角茴香揮發(fā)油雖然對(duì)各種自由基均有較好的清除作用，但是其IC50均低于維生素C標(biāo)準(zhǔn)品，這可能跟揮發(fā)油未經(jīng)過(guò)分離純化，里面含有一些沒(méi)有抗氧化活性的物資有關(guān)，如果經(jīng)過(guò)純化后，可能表現(xiàn)出更好的抗氧化效果。通過(guò)比較IC50可知，八角茴香揮發(fā)油對(duì)3種自由基的清除能力大小依次為羥自由基>DPPH自由基>超氧陰離子自由基。

4　結(jié)論

超聲波輔助法的最佳提取工藝參數(shù)為料液比1∶15、粉碎粒徑60目、超聲時(shí)間30 min、提取率(28.438±0.11)%，所得到的揮發(fā)油為淺褐色的膏狀物，略帶粘稠，味濃厚。八角茴香油是重要的藥食同源物資原料，在醫(yī)藥、化工及食品加工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景，因此其提取工藝及優(yōu)化也將受到人們更多的關(guān)注。由于中藥材的提取受到諸多因素的影響，如藥材與溶劑的比例(即料液比)、藥材粉碎粒徑、浸泡時(shí)間、提取時(shí)間、溫度和提取工藝等。因此加強(qiáng)這些方面的研究，可以對(duì)其有效成分進(jìn)行更好的提取、分離、純化，從而提高揮發(fā)油的純度。

八角茴香揮發(fā)油在測(cè)定濃度范圍內(nèi)對(duì)羥自由基、超氧陰離子自由基、DPPH自由基均具有良好的清除作用，且其清除能力與樣品的濃度呈現(xiàn)明顯的劑量-效應(yīng)關(guān)系。趙秀玲[16]的研究表明八角茴香油的抗氧化性可能與大茴香醛、大茴香腦有關(guān)，提取物可能通過(guò)清除油脂氧化反應(yīng)生成的自由基來(lái)抑制鏈?zhǔn)椒磻?yīng)以實(shí)現(xiàn)抗氧化作用。本試驗(yàn)僅是從體外通過(guò)IC50來(lái)初步判斷八角茴香揮發(fā)油對(duì)3種自由基的清除能力，結(jié)果表明均具有一定的清除效果，而自由基的清除是抗氧化劑發(fā)揮抗氧化作用的主要機(jī)制[17]。因此，八角茴香可作為一種較好的天然抗氧化劑、抑菌劑和保鮮劑的重要原料。今后將加強(qiáng)其在抗氧化、抑菌作用等方面的研究，從而為八角茴香的深加工和系列產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供一定的理論基礎(chǔ)，最終提高產(chǎn)品的附加值。

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