酵母菌發(fā)酵法改良甘草感官品質(zhì)的研究

豆康寧,孟宏昌,張玲玲,王飛*

(1.漯河醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南 漯河　462002; 2.漯河職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南 漯河　462002)

甘草為多年生草本植物，是一種藥食兩用資源，其提取物廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、日用化工等領(lǐng)域[1]。甘草味甘甜，性平和，入心、脾、肺、胃四經(jīng)；生用偏涼，可瀉火解毒、緩急止痛；炙用偏溫，能散表寒、補(bǔ)中益氣；此外，甘草還善于調(diào)和藥性，解百藥之毒[2]。甘草中的生理活性成分主要有三萜類化合物、黃酮類化合物及甘草多糖類化合物三大類成分，具有抑菌、抗腫瘤、抗誘變、抗病毒、抗氧化等多種生理功能[3-8]。我國(guó)食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)GB 02760-2011規(guī)定，甘草、甘草酸銨、甘草酸一鉀及三鉀作為功能甜味劑可用于蜜餞涼果、糖果、餅干、肉罐頭、調(diào)味品和飲料中，使用量按生產(chǎn)需要使用。

但是，甘草具有甘草腥味，將甘草及其提取液作為調(diào)味品或食品添加劑直接添加到食品中，會(huì)影響食品的感官品質(zhì)，限制了其在食品中的應(yīng)用價(jià)值。研究發(fā)現(xiàn)，微生物發(fā)酵法是改良甘草感官品質(zhì)的良好途徑[9]。文章研究了甘草在酵母菌發(fā)酵下酒精含量的變化、感官品質(zhì)的變化、氣味成分的變化，為甘草感官品質(zhì)的改良及在食品中的應(yīng)用提供了技術(shù)參考。

1　材料與方法

1.1　材料

甘草：品種為烏拉爾甘草，生長(zhǎng)方式為種植，產(chǎn)地為寧夏鹽池，生長(zhǎng)期為3年，通過(guò)市售采購(gòu)；水：一級(jí)純凈水，實(shí)驗(yàn)室自制；酵母菌：活性面包干酵母，活菌數(shù)為1×1012個(gè)/g，安琪酵母股份有限公司；葡萄糖：食品級(jí)，山東西唐生物科技有限公司。

1.2　儀器與設(shè)備

YP3001N型電子分析天平上海精密科學(xué)儀器有限公司；SZYDW型無(wú)菌操作臺(tái)蘇州億達(dá)凈化實(shí)驗(yàn)室設(shè)備有限公司；LDZX-50KBS型高壓滅菌鍋上海申安醫(yī)療器械廠；RYC-111型搖床上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；X-22R型冷凍離心機(jī)Allegra公司；SQ456-GC型毛細(xì)管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)布魯克公司；Agilent 7890A氣相色譜儀、附氫火焰離子化檢測(cè)器(FID)。

1.3　實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1甘草提取物制備方法

將甘草用萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎成20目的粉末，稱量20 g甘草樣品，放入1000 mL錐形瓶中，再加入500 mL水，放入搖床中振蕩提取，搖床振蕩速度為120 r/min，溫度為30 ℃，提取60 min。提取結(jié)束后，用冷凍離心機(jī)分離甘草提取液，轉(zhuǎn)速為10000 r/min，時(shí)間為10 min。將離心后的上清液用提取溶劑定容至500 mL，即得甘草提取液，然后用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾甘草提取液得1 mL作為甘草提取物GC-MS試樣。

1.3.2甘草發(fā)酵方法

在250 mL錐形瓶中，加入100 mL甘草提取液，添加5%的葡萄糖，搖勻后，在高壓滅菌鍋中滅菌，待甘草溶液冷卻后，在無(wú)菌操作臺(tái)中接種甘草溶液1%的酵母菌，然后放置在恒溫?fù)u床中發(fā)酵，發(fā)酵溫度28 ℃[10]。每隔30 min，取出部分甘草發(fā)酵溶液，評(píng)價(jià)甘草溶液的感官品質(zhì)。

1.3.3甘草溶液感官品質(zhì)評(píng)價(jià)方法

表1　甘草溶液感官品質(zhì)評(píng)價(jià)賦分標(biāo)準(zhǔn)

其中，以4%的甘草提取液的腥味等級(jí)標(biāo)定為重，將甘草液濃度依次稀釋10倍，腥味等級(jí)依次為較重、稍有甘草腥味，無(wú)甘草腥味。以4%的甘草提取液的色澤等級(jí)標(biāo)定為黃色深，將甘草液濃度依次稀釋10倍，色澤等級(jí)依次為黃色較深、黃色淡、黃色淺淡。

1.3.4甘草提取液中乙醇含量的測(cè)定

1.3.4.1乙醇含量測(cè)定方法

采用Agilent 7890A氣相色譜儀進(jìn)行測(cè)定分析乙醇含量。色譜分析條件：色譜柱：DB-FFAP色譜柱(30 m×0.25 μm×0.25 mm)，程序升溫60 ℃(保持2 min)，以5 ℃/min升至110 ℃(保持5 min)，進(jìn)樣口溫度200 ℃，檢測(cè)器(FID)溫度220 ℃，分流比5∶1，氫氣流速 40 mL/min，空氣流速400 mL/min，載氣(N2) 30 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL[12]。

1.3.4.2乙醇濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

用一級(jí)純水分別配制以下不同濃度的乙醇溶液：2%，1%，0.5%，0.25%，0.125%，0.625%。建立乙醇濃度與氣相色譜出峰面積之間的關(guān)系曲線。

1.3.5甘草提取液氣質(zhì)色譜分析

采用SQ456-GC型毛細(xì)管氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定分析。

1.3.5.1氣質(zhì)色譜方法[13]

萃取條件：CAR/PDMS復(fù)合萃取頭，溫度為50 ℃，時(shí)間為40 min。氣相色譜條件：石英毛細(xì)管柱HP-FFAP (30 m×0.25 mm，0.25 μm)，程序升溫：起始溫度40 ℃，保持3 min，然后以5 ℃/min升到90 ℃，再以12 ℃/min 升到250 ℃，保持8 min；載氣為氦氣，柱流量1.5 mL/min，進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量：固相微萃取(SPME)，進(jìn)樣方式：手動(dòng)，不分流。

1.3.5.2質(zhì)譜條件

電離方式：EI，電子能量：70 eV，接口溫度：250 ℃，離子源溫度：200 ℃。采用Wiley7n.1 標(biāo)準(zhǔn)譜庫(kù)檢索進(jìn)行定性；通過(guò)氣相色譜法按色譜峰面積計(jì)算各組分的相對(duì)含量。

2　實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論

2.1　甘草提取液在發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量的變化

乙醇溶液氣相色譜出峰圖見(jiàn)圖1。

圖1　乙醇溶液氣相色譜出峰圖

乙醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖見(jiàn)圖2。方程式為Y=12648.0299X-91.032609，相關(guān)系數(shù)R2=0.99998。

(2)宗教信仰與風(fēng)俗習(xí)慣導(dǎo)致的文化沖突.宗教和信仰是處于文化最深層的東西，它凝聚著一個(gè)民族的歷史和文化.不同的宗教代表不同的文化，有不同的傾向和禁忌，影響著各個(gè)國(guó)家人們認(rèn)識(shí)事物、觀察事物的觀念和態(tài)度[4-5]，也影響企業(yè)以及企業(yè)管理者對(duì)商機(jī)的把握、產(chǎn)品的銷售等.不同國(guó)家的人們?cè)谟^念、理念上的文化差異常常會(huì)使從事國(guó)際化經(jīng)營(yíng)的企業(yè)在經(jīng)營(yíng)過(guò)程中出現(xiàn)文化沖突，也使當(dāng)?shù)厝撕茈y容忍這類沖突，所以企業(yè)必須做好有效的管理.

圖2　乙醇溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線圖

甘草提取液在酵母菌發(fā)酵的過(guò)程中，乙醇含量的變化見(jiàn)圖3。

圖3　甘草提取液發(fā)酵過(guò)程中乙醇含量的變化

由圖3可知，甘草提取液在酵母發(fā)酵的過(guò)程中，開(kāi)始發(fā)酵時(shí)，乙醇含量增加幅度較小，發(fā)酵1 h后，乙醇含量增加幅度較大。這是由于酵母在前期發(fā)酵主要以有氧發(fā)酵為主，產(chǎn)生氧氣和二氧化碳。發(fā)酵后期，溶液中氧氣消失，酵母菌以無(wú)氧發(fā)酵為主，產(chǎn)生乙醇和二氧化碳[14]。

2.2　甘草提取液在發(fā)酵過(guò)程中感官品質(zhì)的變化

酵母菌發(fā)酵甘草提取液0，0.5，1，1.5，2，2.5，3 h，其感官品質(zhì)的變化見(jiàn)圖4。

圖4　甘草提取液在酵母菌發(fā)酵過(guò)程中感官品質(zhì)的變化

由圖4可知，甘草提取液感官品質(zhì)隨著酵母菌發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)先上升后下降，發(fā)酵2 h時(shí)，甘草提取液感官品質(zhì)最好。不發(fā)酵的甘草提取液色澤為深黃色，具有較重的腥氣味道。隨著酵母菌的發(fā)酵，會(huì)產(chǎn)生醇類、酯類等物質(zhì)，使甘草提取液的腥味下降。發(fā)酵2 h時(shí)，甘草提取液的腥味消失，變成具有乙醇的殺口感[15]，腥氣味消失，變成酒香味。發(fā)酵時(shí)間超過(guò)2 h后，口感中乙醇味比較明顯，具有一定的刺激感，這是由于乙醇含量較高造成的，氣味中帶有異味，酒香味變得不純正。因此，甘草提取液在28 ℃下，酵母菌發(fā)酵2 h時(shí)，感官品質(zhì)最佳。此時(shí)感官品質(zhì)得分為89分。

2.3　甘草提取液發(fā)酵前后風(fēng)味物質(zhì)的變化

2.3.1甘草水提取物氣味成分分析

甘草水提取物氣味成分GC-MS總離子流圖見(jiàn)圖5，氣質(zhì)色譜出峰物質(zhì)信息見(jiàn)表2。

圖5　甘草提取液氣味成分GC-MS總離子流圖

表2　甘草水提取物氣質(zhì)色譜出峰物質(zhì)信息

續(xù)　表

由表2可知，共有59種物質(zhì)，其中含量較高的物質(zhì)為正己醇(48.2%)、1-辛稀-3-醇(4.26%)、E-2-己烯-1-醇(3.53%)、檸檬烯(3.14%)。甘草水提取物氣味成分中，有烴類、醇類、酮類、醛類、胺類、酚類、酯類等多類有機(jī)化合物。因此，甘草水提取物氣味成分比較復(fù)雜。

2.3.2甘草提取物酵母發(fā)酵后氣味成分分析

甘草提取液酵母菌發(fā)酵2 h后，氣味成分GC-MS總離子流圖見(jiàn)圖6，氣質(zhì)色譜出峰物質(zhì)信息見(jiàn)表3。

圖6　甘草提取液酵母發(fā)酵物氣味成分GC-MS總離子流圖

表3　甘草提取液酵母菌發(fā)酵溶氣質(zhì)色譜出峰物質(zhì)分析

續(xù)　表

由表3可知，共有52種物質(zhì)，其中含量較高的有異戊醇(36.02%)、苯乙醇(15.05%)、辛酸(7.58%)、癸酸(6.68%)、正己醇(2.95%)、乙酸(2.66%)、辛酸乙酯(2.66%)。甘草提取液發(fā)酵后的氣味成分中，有烴類、醇類、酮類、醛類、酚類、酯類等多類有機(jī)化合物。因此，甘草提取液酵母發(fā)酵后氣味成分仍然比較復(fù)雜多樣，但是主要成分都發(fā)生了變化。甘草提取液發(fā)酵后的主要?dú)馕冻煞治镔|(zhì)主要是醇類、酸類和酯類物質(zhì)，因此，甘草提取液發(fā)酵后的物質(zhì)氣味呈酒香味。

3　結(jié)論

在4%的甘草提取液中，添加1%的酵母菌，在28 ℃下發(fā)酵2 h時(shí)，甘草提取液的感官品質(zhì)最佳。甘草提取液在酵母菌發(fā)酵的過(guò)程中，乙醇含量不斷增加，甘草腥味消失，氣味由腥味變成酒香味，色澤變淺，甘草提取液的感官品質(zhì)得到很大改善。因此，酵母菌發(fā)酵法是甘草感官品質(zhì)改良的有效途徑。發(fā)酵后的甘草提取液感官品質(zhì)良好，無(wú)甘草腥味，可以作為調(diào)味品或者食品添加劑應(yīng)用到食品中。

參考文獻(xiàn)：

[1]劉洋洋,劉春生,曾斌芳,等.甘草種質(zhì)資源研究進(jìn)展[J].中草藥,2013,44(24):3593-3596.

[2]張玉龍,王夢(mèng)月,楊靜玉,等.炙甘草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2015,29(3):99-102.

[3]Ogiku M,Kono H,Hara M,et al.Glycyrrhizin prevents liver injury by inhibition of high-mobility group box 1 production by Kupffer cells after ischemia-reperfusionin rats[J].J Pharmacol Exp Ther,2011,339(1):93.

[4]Marjan N A,Hosseinzadeh H.Review of pharmacological effects ofGlycyrrhizasp.and its bioactive compounds[J].Phytother Res,2008,22(6):709.

[5]Ashfaq U A,Masoud M S,Nawaz Z,et al.Glycyrrhizin as antiviral agent against hepatitis C virus[J].J Transl Med,2011,9(1):112.

[6]Li W,Yoshihisa A,Takafumi Y.Flavonoid constituents fromGlycyrrhizaglabrahairy root cultures[J].Phyto Chem,2000,55(5):447-456.

[7]Toshi F,Ai M,Kiyoshi K,et al.Antimicrobial activity of licorice flavonoids against methicillin-resistantStaphylococcusaureus[J].Fitoterapia,2002,73:536-539.

[8]劉三俠,吳俊偉,林永樂(lè).甘草多糖藥理作用研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸藥雜志,2013,47(1):64-67.

[9]王飛.一種甘草發(fā)酵飲料的制備方法[P].中國(guó)專利：CN104544439A，2017-02-22.

[10]葛磊.燕麥發(fā)酵飲料的研制[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2012.

[11]趙剪，方婷，陳梅英，等.模糊數(shù)學(xué)在不同處理橙汁感官評(píng)定中的應(yīng)用[J].河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008(1)：72-75.

[12]陳霞.葡萄酒中乙醇含量的氣相色譜法測(cè)定[J].中國(guó)釀造，2010(9):152-153.

[13]李運(yùn)冉.果汁豆奶飲料關(guān)鍵技術(shù)研究[D].無(wú)錫：江南大學(xué)，2010.

[14]李里特，江正強(qiáng)．焙烤食品工藝學(xué)[M]．北京：中國(guó)輕工業(yè)出版社，2010.

[15]尹卓容，韓玉亮，管桂坤，等.提高食用酒精的感官質(zhì)量[J].釀酒科技，1995(4):37-41.