冬凌草甲素環(huán)糊精包合物口腔崩解片的制備工藝及質(zhì)量研究

萬　蒞，王　莉

(1.湖北省婦幼保健院藥劑科，湖北 武漢　430070；2.武漢科技大學(xué)附屬天佑醫(yī)院口腔科，湖北 武漢　430064)

*副主任藥師。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。E-mail：1027949621@qq.com

#通信作者：主管醫(yī)師。研究方向：合理用藥。E-mail：1220014244@qq.com

冬凌草甲素是從唇形科香茶菜屬植物冬凌草中提取的二萜化合物，能增強(qiáng)機(jī)體免疫功能，具有抗氧化、抗菌、抗炎和抗突變等作用，臨床上用于抗腫瘤、抗菌消炎和降壓治療[1]，但其在水、油中的溶解度均較小[2]，且味道極苦，臨床應(yīng)用受到了限制。而利用新型包合材料羥丙基-β-環(huán)糊精(HP-β-CD)作為難溶性藥物的載體，將藥物分子包合或嵌入HP-β-CD的筒狀結(jié)構(gòu)內(nèi)形成超微粒分散物，不僅可以提高難溶性藥物的水溶性和生物利用度，還可掩蓋藥物的不良?xì)馕禰3]。本研究旨在探討冬凌草甲素包合物口腔崩解片的制備工藝和質(zhì)量。

1　材料

1.1　儀器

SPD-20 A型液相色譜儀(LC-20AT，日本島津公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；真空干燥箱(上海特成機(jī)械設(shè)備有限公司)；差式掃描量熱儀(德國NETZSCH公司)；片劑硬度測試儀(天津市國銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司)；智能溶出度測定儀(天津大學(xué)無線電廠)；超聲波清洗器(江蘇昆山超聲儀器廠)；恒溫磁力攪拌器(山東青島機(jī)械設(shè)備有限公司)；單沖壓片機(jī)(江蘇泰興制藥機(jī)械工廠)。

1.2　藥品與試劑

冬凌草甲素(河南濟(jì)世藥業(yè)有限公司，純度99.5%)；冬凌草甲素標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所，純度98.5%)；冬凌草甲素包合物崩解片(自制，批號：20161212、20161213)；冬凌草甲素片(河南濟(jì)世藥業(yè)有限公司，規(guī)格：50 mg/片，批準(zhǔn)文號：國藥準(zhǔn)字Z41020014，批號：20140501)；HP-β-CD(西安德立生物化工有限公司)；微晶纖維素(MCC，上海昌為輔料公司)；羧甲基淀粉鈉(CMS-Na，美國ISP公司)；甘露醇(河北華旭藥業(yè)有限公司)；硬脂酸鎂(浙江湖州展望化學(xué)藥業(yè)有限公司)，所有試藥均為藥用級。

2　方法與結(jié)果

2.1　含量測定

參考相關(guān)文獻(xiàn)[4-5]，測定冬凌草甲素的含量。

2.1.1色譜條件：色譜柱為Diamonsil Cl8柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為甲醇-水(V∶V=60 ∶40)的混合溶液，流速為1 ml/min，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為10 μl，紫外檢測器波長為240 nm。

2.1.2溶液的制備：(1)對照品溶液：精密稱取適量冬凌草甲素對照品，加甲醇使之溶解，制成濃度為400 μg/ml的標(biāo)準(zhǔn)品儲備液。精密量取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液2 ml置于10 ml容量瓶中，加流動相至刻度，制成80 μg/ml的冬凌草甲素對照品溶液。(2)供試品溶液：取自制的包合物口腔崩解片10片研細(xì)，精密稱取適量(約相當(dāng)于冬凌草甲素40 mg)，置于100 ml容量瓶中，加甲醇20 ml，超聲處理10 min使冬凌草甲素溶解，加入流動相定容，再對溶液進(jìn)行超聲處理后濾過，精密量取續(xù)濾液10 ml，用流動相定容于50 ml容量瓶中，揺勻備用。(3)空白溶液的制備：制備出不含冬凌草甲素的包合物口腔崩解片，再按供試品溶液的制備方法制備。

2.1.3系統(tǒng)適應(yīng)性試驗：取對照品溶液、供試品溶液和空白溶液各10 μl，進(jìn)樣分析，冬凌草甲素的保留時間約為10.7 min，空白溶液無色譜峰，對冬凌草甲素?zé)o干擾，結(jié)果見圖1。

A.空白溶液；B.對照品溶液；C.供試品溶液；1.冬凌草甲素 A.blank solution; B. reference solution; C. sample solution；1 oridonin 圖1　高效液相色譜圖Fig 1　HPLC chromatogram

2.1.4線性關(guān)系考察：分別精密量取標(biāo)準(zhǔn)品儲備液0.05、0.10、0.20、0.40、1.00、2.00和5.00 ml，置于10 ml容量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻，得到質(zhì)量濃度為2、4、8、16、40、80和200 μg/ml的系列溶液，分別吸取10 μl，進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以冬凌草甲素質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程為Y=15.185X+28.701(r=0.999 5)。結(jié)果表明，冬凌草甲素在2.00～200.00 μg/ml范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度試驗：取濃度為4、16和80 μg/ml的對照品溶液，l日內(nèi)測定5次，計算日內(nèi)精密度；每日測定1次，連續(xù)測定5日，計算日間精密度，結(jié)果日內(nèi)和日間RSD均<1.5%，表明儀器的精密度良好。

2.1.6穩(wěn)定性試驗：取“2.1.2”項下供試品溶液放置0、1、2、3、4、8、12及24 h時進(jìn)樣測定。結(jié)果顯示RSD為0.75%(n=6)，表明供試品溶液在24 h內(nèi)是穩(wěn)定的。

2.1.7重復(fù)性試驗：分別精密稱取同一批樣品6份，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)行重復(fù)性試驗。結(jié)果顯示，RSD為1.14%(n=6)，表明重復(fù)性較好。

2.1.8加樣回收率試驗：分別精密吸取“2.1.2”項下供試品溶液3份，加入空白溶液0.5 ml中制得4、16及80 μg/ml的低、中及高3個質(zhì)量濃度的溶液，每個質(zhì)量濃度平行3份，按照“2.1.1”項下方法進(jìn)樣測定，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線得到實測濃度，計算加樣回收率，加樣回收率=(C測得/C加入)×100%。結(jié)果顯示，低、中及高濃度的加樣回收率分別為101.3%、97.8%及98.7%，RSD分別為1.22%、1.56%及1.37%，符合要求。

2.2　包合物的制備與鑒定

2.2.1包合物的制備：參考相關(guān)文獻(xiàn)[6]，稱取HP-β-CD 1 562.1 mg溶于蒸餾水50 ml中，加入含冬凌草甲素55 mg的甲醇溶液混合均勻，于60 ℃下用恒溫磁力攪拌器攪拌,反應(yīng)4 h后置入冰箱冷藏室，5 ℃下放置2 d，使沉淀完全，抽濾，所得沉淀物用蒸餾水及甲醇沖洗，所得白色固體干燥后研細(xì)并過80目篩，儲存于干燥器內(nèi)，即得冬凌草甲素HP-β-CD包合物。

2.2.2包合物的鑒定：分別取冬凌草甲素原料藥、HP-β-CD、二者的物理混合物和冬凌草甲素HP-β-CD包合物進(jìn)行差示掃描量熱分析[7]。結(jié)果顯示，冬凌草甲素在258.8 ℃有1個吸熱峰，HP-β-CD曲線平直無明顯吸熱峰，物理混合物的曲線基本上是冬凌草甲素和HP-β-CD的疊加，包合物曲線中無吸熱峰出現(xiàn)，說明包合物中已不存在冬凌草甲素的單體, 而是形成了一種新的物質(zhì)，包合物已形成，見圖2。

a.冬凌草甲素；b.HP-β-CD；c.物理混合物；d.包合物 a. oridonin；b. HP-β-CD; c. physical mixture; d. inclusion complexes 圖2　差示掃描量熱圖譜Fig 2　Differential scanning calorimetry spectrum

2.2.3包封率和載藥量的測定[8-9]：精密稱取冬凌草甲素包合物(3批)各20 mg，置于50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻后按“2.1”項下方法測定冬凌草甲素的含量，計算包合物的載藥量和包封率。載藥量(%)=包合物中藥物質(zhì)量/包合物總質(zhì)量×100%。包封率(%)=包合物中藥物質(zhì)量/藥物的總投入量×100%。結(jié)果表明，包封率和載藥量分別為75.53%、37.03%(n=3)。

2.3　包合物口腔崩解片的制備工藝研究

2.3.1包合物口腔崩解片的處方篩選：崩解劑和填充劑是制備口腔崩解片的主要輔料，常用的有MCC、羥丙甲基纖維素、CMS-Na、甘露醇、淀粉、乙醇、乳糖和交聯(lián)聚維酮等[10]。通過預(yù)試驗，結(jié)合濕法壓片的特點和藥物性質(zhì)，選用甘露醇為填充劑，CMS-Na+MCC為崩解劑，50%乙醇為黏合劑，進(jìn)行單因素實驗。以體外崩解時間和10 min體外溶出度為考察指標(biāo)，采用正交設(shè)計法篩選3種輔料MCC(A)、CMC-Na(B)及甘露醇(C)的用量，按L9(34)設(shè)計正交表，見表1。正交試驗結(jié)果表明，因素A對崩解片的崩解時間和溶出度影響最大，B次之，C最小，故選擇最佳崩解條件是A2B3C3(見表2—3)，即MCC 90 mg，CMC-Na 48 mg，甘露醇25 mg，并添加適量的硬脂酸鎂作潤滑劑。冬凌草甲素包合物口腔崩解片(0.3 g/片)處方組成為：冬凌草甲素包合物135 mg(含冬凌草甲素50 mg)，MCC 90 mg，CMS-Na 48 mg，甘露醇25 mg，硬脂酸鎂2 mg。

表1　因素與水平Tab 1　Factors and levels

表2　正交試驗結(jié)果Tab 2　Design and results of orthogonal test

表3　方差分析結(jié)果Tab 3　Results of variance analysis

2.3.2包合物口腔崩解片的制備：將過80目篩的70%崩解劑(MCC、CMS-Na)與處方量的冬凌草甲素包合物混合均勻，用50%乙醇溶液制濕顆粒，過20目篩，40 ℃干燥2 h，過18目篩整粒，加入甘露醇、剩余崩解劑和硬脂酸鎂混勻，壓片，即得包合物口腔崩解片。每片質(zhì)量0.3 g，含冬凌草甲素50 mg。

2.3.3驗證實驗：依照處方工藝制備5批冬凌草甲素包合物口腔崩解片，對篩選的處方進(jìn)行驗證實驗。結(jié)果顯示，5批自制包合物崩解片各項驗證指標(biāo)均符合要求，志愿者口感良好，口服無苦味，篩選出的處方及工藝是穩(wěn)定可行的，見表4。

表4　驗證試驗結(jié)果(n=5)Tab 4　Results of validation test (n=5)

2.3.4主藥的含量測定：取3批自制的包合物口腔崩解片，按照“2.1”項下方法測定主藥含量。結(jié)果顯示，冬凌草甲素平均含量分別為標(biāo)示量的97.91%、99.22%及98.86%(n=3)。

2.4　溶出度的測定

按轉(zhuǎn)籃法測定和比較包合物崩解片和普通片劑的溶出度[11]。測定條件：轉(zhuǎn)速100 r/min，溫度(37±0.5)℃, 溶出介質(zhì)蒸餾水500 ml，取包合物崩解片和普通片各6片進(jìn)行測定，取樣時間為5、10、15、20、30和60 s，2、3、4、5、6、7和8 min，取樣5 ml，并在30 s內(nèi)補(bǔ)液5 ml，取得的樣品用0.45 μm濾膜濾過，測定兩種片劑中冬凌草甲素的百分含量，計算兩種片劑的累積溶出度。結(jié)果顯示，根據(jù)溶出度曲線圖，冬凌草甲素包合物口腔崩解片累積溶出度在2 min時達(dá)到了98.2%(RSD=1.7%，n=6)，明顯高于普通片；普通片2 min時為21.1%(RSD=1.6%，n=6)，8 min時為50.6%(RSD=1.5%，n=6)，溶出度明顯低于包合物口腔崩解片，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖3。表明包合物崩解片中冬凌草甲素的溶解性得到了明顯增加，相同時間內(nèi)包合物崩解片的累積溶出量顯著高于市售普通片，包合物崩解片更易于在體內(nèi)吸收、起效。

圖3　冬凌草甲素包合物口腔崩解片與普通 片劑的溶出度曲線圖(n=6)Fig 3　Dissolution curve of oridonin hydroxypropyl-β- cyclodextrin inclusion complexes Orally disintegrating tablets and common tablets(n=6)

3　討論

HP-β-CD為環(huán)狀低聚糖，具有內(nèi)疏水、外親水的結(jié)構(gòu)，在水溶液中能與多種疏水化合物結(jié)合形成主/客體或超分子包合物，提高疏水化合物的水溶性[12]。制成HP-β-CD包合物后，不僅可以提高冬凌草甲素的溶解度，還可掩蓋其苦味，降低其刺激性、毒性和副作用等[13]。

口腔崩解片是在口腔內(nèi)不需水即能崩解或溶解的片劑，具有良好的臨床應(yīng)用前景。將冬凌草甲素包合物進(jìn)一步制成口腔崩解片后，藥物在到達(dá)胃腸道前就能迅速崩解并分散成細(xì)微的顆粒，使藥物大面積分布，吸收點增多而胃腸道殘留少，從而進(jìn)一步減少其對胃黏膜的刺激性。

本研究分別采用沉淀法和正交試驗法，將冬凌草甲素高度分散在HP-β-CD載體中，以MCC、CMS-Na和甘露醇為賦形劑制備了包合物口腔崩解片，提高了冬凌草甲素的溶解度和體外溶出度，制備工藝可行，質(zhì)量可控，為冬凌草甲素新型藥物載體研究提供了依據(jù)。

[1]劉建群，高俊博，劉小紅.冬凌草的化學(xué)成份研究[J].中國藥房，2015，26(33)：4724-4726.

[2]尚校軍，董若怡，馬素英，等.冬凌草甲素固體分散體的制備及溶解性能研究[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2010，27(5)：418-421.

[3]王娜，車曉俠，李楠.相溶解度法研究羥丙基-β-環(huán)糊精對淫羊藿苷的增溶作用[J].西北藥學(xué)雜志，2013，28(6)：617-618.

[4]郭波紅，李曉芳，廖裕威，等.冬凌草甲素納米粒中主藥含量及包封率的測定[J].佛山科學(xué)技術(shù)學(xué)院學(xué)報：自然科學(xué)版，2015，33(1)：1-4.

[5]龔素娟，蔣艷博，楊琳琳，等.冬凌草甲素脂質(zhì)體的制備及影響因素考察[J].沈陽藥科大學(xué)學(xué)報，2010，27(2)：87-92.

[6]張雁冰，薛華珍，寇嫻，等.信陽冬凌草甲素和乙素β-環(huán)糊精包合物的研究[J].中藥材，2001，24(2)：131-132.

[7]崔穎，耿立堅，趙瑛.氯氮平HP-β-環(huán)糊精包合物及其口腔崩解片的制備與評價[J].中南藥學(xué)，2015，13(12)：1277-1281.

[8]周潔，蔣曙光，周建平.卡維地洛羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的制備與評價[J].中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)，2012，29(6)：516-519.

[9]王璐璐，鄭穩(wěn)生，陳少華，等.棓丙酯-羥丙基-β-環(huán)糊精包合物的研制[J].中國新藥雜志，2013，22(11)：1337-1340.

[10]易蕾，程德珍.硫辛酸口腔崩解片的制備及質(zhì)量研究[J].中國藥房，2015，26(28)：3983-3985.

[11]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：四部[S].2015年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015：121-124.

[12]尤靜，余麗麗，楊黎燕.鹽酸小檗堿盧-環(huán)糊精微球的制備及體外釋藥研究[J].應(yīng)用化工，2013，42(3)：447-449.

[13]李進(jìn)，邵大釗，張釗華，等.萜類化合物與環(huán)糊精包合物的研究進(jìn)展[J].云南師范大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2014，34(6)：19-24.