肝炎及肝硬化患者血代譜及生物標(biāo)記物相關(guān)性研究

徐　茜,張　晨

(陜西省西安市第九醫(yī)院:1.檢驗(yàn)科；2.感染性疾病科　710054 )

肝臟是人體內(nèi)重要的代謝器官，具有解毒以及吞噬等重要功能[1-2]。人體膽汁的合成主要也是由肝臟細(xì)胞完成的，肝臟通過(guò)促進(jìn)膽汁的合成與分泌進(jìn)而促進(jìn)人體對(duì)脂類的吸收。同時(shí)，肝臟與人體激素的分泌息息相關(guān)，人體內(nèi)的多種激素在肝臟中分解或轉(zhuǎn)化；當(dāng)肝臟發(fā)生病變時(shí)，激素便失去活性，從而導(dǎo)致人體出現(xiàn)多種病癥，人體的代謝過(guò)程也受到影響。代謝組學(xué)在臨床醫(yī)學(xué)方面的應(yīng)用主要集中于疾病的發(fā)病機(jī)制、預(yù)后評(píng)估以及疾病的診斷治療方面。由于原發(fā)性膽汁性肝硬化(PBC)與自身免疫性肝炎(AIH)在臨床治療方面都沒有特定的典型性關(guān)系，因此，兩種疾病經(jīng)常會(huì)同時(shí)發(fā)生，對(duì)臨床上的治療造成了極大的困擾。本試驗(yàn)在正離子模式之下應(yīng)用線性梯度超高效液相色譜飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)兩種疾病患者的血清進(jìn)行分析，尋找用于診斷AIH以及PBC的血清標(biāo)志物，現(xiàn)報(bào)道如下。

1　資料與方法

1.1一般資料選取2014年5月到2015年6月在本院治療的確診為AIH的患者42例作為AIH組，45例PBC患者作為PBC組，并選取50例健康體檢者作為對(duì)照組。本試驗(yàn)所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

1.2納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1納入標(biāo)準(zhǔn)[3]AIH診斷標(biāo)準(zhǔn)：2015年國(guó)際AIH小組制定的診斷評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)[4]。PBC診斷標(biāo)準(zhǔn)：2015年美國(guó)肝病協(xié)會(huì)制定的關(guān)于診斷PBC的相關(guān)準(zhǔn)則[5]。所有納入研究的患者均已確診為該病患者。

1.2.2排除標(biāo)準(zhǔn)(1)藥物性肝炎、病毒性肝炎或酒精性肝患者；(2)艾滋病感染者；(3)同時(shí)患有原發(fā)性肝癌的患者；(4)患有甲狀腺功能亢進(jìn)或糖尿病等代謝疾病的患者。

1.3方法參與研究的研究對(duì)象需晨起空腹采集血清標(biāo)本，在4 ℃下離心6 min左右，放在-80 ℃的恒溫冰箱中保存。在正式試驗(yàn)的前1天將樣品置于4 ℃下解凍，將血清標(biāo)本與乙腈按照1∶3的比例均勻混合。在4 ℃下離心20 min，取450 L上層清液進(jìn)行超高效液相色譜梯度分析[6]。液相色譜的柱溫為35 ℃，色譜柱為ACQUITRC18柱，見表1。

表1　　超高效液相色譜梯度洗脫程序

注：正離子模式下A為水+0.1%甲酸，B為乙腈+20%異丙醇+0.1%甲酸；負(fù)離子模式下A為水+0.1%甲酸，B為甲醇+0.1%甲酸

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS20.0軟件進(jìn)行處理分析，對(duì)研究對(duì)象進(jìn)行均衡性檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析或獨(dú)立t檢驗(yàn)。采用有監(jiān)督和無(wú)監(jiān)督兩種模式對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，無(wú)監(jiān)督模式是用線性投影法把多成新的主成分，有監(jiān)督模式則是在已有分組中進(jìn)行識(shí)別與歸類通過(guò)載荷圖以及得分圖可以直觀地觀察分析結(jié)果。

2　結(jié)　　果

2.1AIH組與PBC組患者正負(fù)離子模式下變量書及譜峰比較所有的血清標(biāo)本在經(jīng)過(guò)超高效液相色譜-質(zhì)譜分析之后，得出AIH組與PBC組患者在正負(fù)離子模式下譜峰差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.104，P<0.05)，見表2。

表2　　AIH組與PBC組患者正負(fù)離子模式下變量數(shù)及譜峰比較

2.2兩種疾病診斷模型的建立對(duì)AIH組與PBC組的血清標(biāo)本色譜-質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)這兩組正離子模式下與負(fù)離子模式下與對(duì)照組血清標(biāo)本都可以明顯分開。除此之外，在正離子模式下AIH組與PBC組患者數(shù)據(jù)的區(qū)分不明顯，但在負(fù)離子模式下兩組患者區(qū)分明顯。為了更好地找到并鑒定潛在的生物標(biāo)記物，又釆用了有監(jiān)督的模式識(shí)別方法對(duì)標(biāo)本數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在負(fù)離子模式下兩組得到了很好的區(qū)分。負(fù)離子模式下模型的解釋率和預(yù)測(cè)率為R2Y=0.991，Q2Y=0.943。對(duì)該模型進(jìn)行交叉驗(yàn)證。

2.3生物標(biāo)記物的鑒定保留時(shí)間、質(zhì)量數(shù)與串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)是鑒定生物標(biāo)志物的3條準(zhǔn)則。首先，根據(jù)生物標(biāo)志物的精確質(zhì)荷比到數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)比査找可能物質(zhì)，并購(gòu)買可能性大的物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)品分析，在相同的色譜條件之下物質(zhì)的保留時(shí)間相同，之后進(jìn)行串聯(lián)質(zhì)譜分析，并將獲得的生物標(biāo)志物的二級(jí)質(zhì)譜圖與標(biāo)準(zhǔn)品的二級(jí)譜圖比較，二者譜圖如果完全匹配就能鑒定二者是同一物質(zhì)。如標(biāo)本血清中物質(zhì)的譜圖與溶血卵磷脂的圖譜譜圖完全匹配，則鑒定為溶血卵磷脂。本試驗(yàn)便是按照這3條準(zhǔn)則對(duì)脂肪酸、膽汁酸、溶血卵磷脂、卵磷脂、鞘磷脂5類20種生物標(biāo)記物進(jìn)行了鑒定分析。分析結(jié)果顯示，AIH組與PBC組患者體內(nèi)膽汁酸的水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.102，P<0.05)，其他4種酯類物質(zhì)水平較低。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)PBC患者血清代謝產(chǎn)物改變程度比AIH患者更重。除此之外，在正離子模式之下發(fā)現(xiàn)血清代謝物中苯丙氨酸在AIH組中水平高于對(duì)照組，但與PBC組患者相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3　討　　論

代謝組學(xué)是一門新興的生物學(xué)技術(shù),它主要是對(duì)人體細(xì)胞內(nèi)代謝層面的若干生命活動(dòng)進(jìn)行探索[7]。并且代謝組學(xué)的優(yōu)越之處在于它位于人體代謝活動(dòng)的最末端，更接近于機(jī)體的表面。除此之外，代謝組學(xué)還可以放大蛋白質(zhì)或者基因的微小變化，并且代謝產(chǎn)物的數(shù)量和種類也遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于之前的蛋白質(zhì)組與基因組[8-9]。由于人體各個(gè)組織中的代謝產(chǎn)物都基本相同，故代謝組學(xué)的應(yīng)用也更加廣泛。因此，本試驗(yàn)便應(yīng)用代謝組學(xué)的方法來(lái)對(duì)AIH與PBC的發(fā)病機(jī)制以及診斷方法進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)采用了超高效液相色譜-質(zhì)譜研究的方法對(duì)AIH組、PBC組與對(duì)照組的血清標(biāo)本進(jìn)行代謝組學(xué)分析，分別將AIH組和PBC組患者的血清標(biāo)本與對(duì)照組進(jìn)行對(duì)比分析，結(jié)果顯示，在負(fù)離子條件下的區(qū)別較為明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.104，P<0.05)。由此可見，這兩種疾病的代謝產(chǎn)物有所差別，產(chǎn)生這種差別的原因可能是兩種疾病的發(fā)病機(jī)制存在差異[10-11]。膽汁酸是在肝臟中合成的合成并在人體腸道之中發(fā)揮作用的物質(zhì)。健康人體內(nèi)的膽汁酸基本不會(huì)出現(xiàn)在血液循環(huán)中，但絕大多數(shù)肝膽疾病患者體內(nèi)膽汁酸水平明顯上升[12]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，AIH組與PBC組患者血清中膽汁酸水平明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.102，P<0.05)，其他4種脂類物質(zhì)水平較低。除此之外，在正離子模式下發(fā)現(xiàn)，血清代謝物中苯丙氨酸在AIH組水平高于對(duì)照組，但與PBC組患者體內(nèi)代謝該物質(zhì)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

綜上所述，本試驗(yàn)對(duì)PBC及AIH患者血清進(jìn)行代謝組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)其重要臨床意義，并確定了5類生物標(biāo)記物，血清代謝譜分析技術(shù)可以為臨床提供一個(gè)新的思路。但由于本試驗(yàn)取用的標(biāo)本例數(shù)比較少，研究也不夠深入，故需進(jìn)行更深一步的探討。

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