牧樂星對種雞雞毒支原體陽性率的防控試驗分析＊

陸彥，溫炎佳，牛志強，王雨，李新國＊＊

（1.北京農(nóng)學(xué)院動物類國家級實驗教學(xué)示范中心 北京 102206；2.中牧實業(yè)股份有限公司 北京 100070；3.焦作市農(nóng)經(jīng)管理站 河南焦作 454002）

牧樂星主要成分為酒石酸泰萬菌素，屬于大環(huán)內(nèi)酯類動物專用抗生素（圖1），該品對支原體有特效。其作用機理主要通過阻礙菌體蛋白質(zhì)的合成而發(fā)揮滅菌作用；對多種革蘭氏陽性菌有抗菌活性。雞毒支原體病也稱雞慢性呼吸道?。–hronic Respiratory Disease，CRD），是由雞毒支原體（Mycoplasma gallisepticum，MG）引起的一種接觸性、傳染性呼吸道疾病，可以通過水平傳播和垂直傳播，疾病發(fā)展緩慢，病程長，有的呈隱性感染，臨床上以咳嗽、流鼻涕、呼吸發(fā)出啰音、竇部腫脹、呼吸困難或張口呼吸等為特征長期在雞群中蔓延。雞毒支原體感染發(fā)病率極高，幾乎100%的雞場都有此病發(fā)生，雞群最高感染率達83.4%，可造成幼雛淘汰率上升和成年母雞產(chǎn)蛋率下降，是造成養(yǎng)雞業(yè)嚴(yán)重經(jīng)濟損失的疾病之一。

對于這種疫病，目前國內(nèi)外多以抗菌藥物治療為主。牧樂星（主要成分泰萬菌素）具有高效、低毒、低殘留等優(yōu)點，并且不會產(chǎn)生大環(huán)內(nèi)酯類抗生素之間的交叉耐藥，是一種較好的治療呼吸道和消化道感染的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。有文獻報道，以推薦劑量口服給藥后，泰萬菌素在豬體內(nèi)能夠被快速吸收，在雞體內(nèi)約1h 達到血漿峰濃度，能夠快速地分布到主要器官，其中膽汁、脾臟、肺臟、腎臟和肝臟中的濃度最高；泰萬菌素代謝較快，30min內(nèi)約有50%的原藥被代謝，主要代謝物為3-O-acetyltylosin（3-AT）；泰萬菌素在豬體內(nèi)排泄較快，主要的消除途徑為糞便排出，給藥后72h，使用HPLC 方法檢測，泰萬菌素的含量已低于10%。汪明等對泰萬菌素可溶性粉劑在雞毒支原體上的療效展開研究，試驗結(jié)果表明泰萬菌素對用雞毒支原體誘發(fā)雞呼吸道疾病有良好的預(yù)防和治療作用，當(dāng)飲水給藥濃度達到125μg/m L 時，預(yù)防組和治療組均能明顯減少感染雞的失重，大幅度降低氣囊的病理損傷，提高感染雞的存活率，當(dāng)治療組飲水給藥濃度達到250μg/m L 時，己完全不見氣囊損傷,對照組中泰樂菌素飲水濃度達500μg/m L 時才表現(xiàn)出一定控制雞呼吸道癥狀療效，該試驗表明泰萬菌素對雞源雞毒支原體有極好的療效。本試驗采用ELISA 方法測定草種雞雞毒支原體的抗體，通過草種雞血清中支原體抗體水平變化和支原體抗體陽性率來評價牧樂星藥物對雞毒支原體控制情況。從試驗設(shè)計和原理上分析，牧樂星對支原體有很強的殺滅作用，結(jié)果對牧樂星藥物治療草種雞雞毒支原體有一定的參考價值。

1 試驗材料及方法

1.1 試驗藥物

牧樂星（25%），由內(nèi)蒙古中牧生物藥業(yè)有限公司提供。

1.2 試驗動物及分組

某私人種雞場，117 日齡草種雞，2 棟同日齡雞舍，3,000 只/棟，一棟作為試驗組，另一棟作為對照組（表1）。

1.3 血清樣品的采集

對照組與試驗組同時分別于給藥前、停藥第1d（給藥7d 后）、停藥第7d（給藥14d 后）、停藥第14d（給藥21d 后）、停藥第21d（給藥28d 后），共5 批各組隨機抽取30 只草種雞（母雞），經(jīng)翅靜脈采血2mL/只，于4℃冷藏析出血清后分離至離心管，血清凍存待檢。

1.4 試驗材料及設(shè)備

M G 抗 原（E L I S A）：Biostone Animal Health LLC；MG 標(biāo)準(zhǔn)陽性血清：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號：201101；MG 標(biāo)準(zhǔn)陰性血清：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，批號：207401；試驗儀器：待檢血清，酶標(biāo)板，移液器，采血管，離心管，槍頭等；酶標(biāo)儀：BIORED-680；生化培養(yǎng)箱：BSP-150

1.5 檢測方法

1.5.1 試劑盒采用間接ELISA方法 在酶標(biāo)板微孔上預(yù)包被雞毒支原體抗原。在試驗中，加入稀釋后的待檢血清，經(jīng)過溫育后，若樣品中含有雞毒支原體特異性抗體，則與包被板上的抗原結(jié)合，經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的抗體和其他成分后再加入酶標(biāo)二抗，與檢測板上的抗原抗體復(fù)合物發(fā)生特異性結(jié)合；再經(jīng)洗滌除去未結(jié)合的酶結(jié)合物；在微孔中加入TMB 底物液，經(jīng)酶催化形成藍色產(chǎn)物，加入終止液終止反應(yīng)后，用酶標(biāo)儀450nm 波長測定反應(yīng)孔中的吸光度值。顯色深度與樣品中的抗體含量成正相關(guān)。

1.5.2 試劑盒規(guī)格及組分

圖1 泰萬菌素化學(xué)結(jié)構(gòu)式

表1 試驗分組

表2 ELISA 檢測試劑組分

1.5.3 數(shù)據(jù)分析與結(jié)果判定 判定標(biāo)準(zhǔn)：顯色深度（OD 值）與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清稀釋倍數(shù)成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為99.78%，因此采用樣品的OD 值大小表示樣品血清中雞毒支原體抗體水平的高低；根據(jù)樣品OD 值，樣品血清與陰性血清吸光度值之比P/N 值≥2 判定為陽性，計算不同批次的雞毒支原體抗體陽性率。經(jīng)ELISA 方法檢測給藥前測試組與對照組OD 值差異較小，表明給藥前測試組與對照組來源場所雞毒支原體抗體水平基本一致，具備對照參考的依據(jù)，下一步進行給藥后的樣品測試。

2 試驗結(jié)果

2.1 各個采樣點對照組與試驗組檢測結(jié)果

在試驗過程中OD 值偏高，體現(xiàn)出樣品的抗體水平比較高，其結(jié)果采用各組30 個樣品OD 總值進行比較分析。結(jié)果見表3 和圖2，以上結(jié)果表明，停藥后第1d 與停藥后第7d 試驗組相比對照組雞毒支原體抗體水平下降明顯；停藥后第14d 試驗組相比對照組雞毒支原體抗體水平略有下降，但不明顯；停藥后第21d 試驗組相比對照組雞毒支原體抗體水平恢復(fù)沒有明顯的變化。表明給藥后雞毒支原體抗體水平先降低后逐漸恢復(fù)，反映出藥物對雞毒支原體的控制在停藥后第14d 后由強轉(zhuǎn)弱。

2.2 試驗組給藥前后抗體水平及陽性率分析

為了重復(fù)驗證上述試驗結(jié)果的準(zhǔn)確性，在上述試驗OD 值過高的基礎(chǔ)上，降低了包被原的濃度（從200X 降至2000X），降低了樣品濃度（由200X 降至800X），對試驗組各組血清又進行了同批試驗（表4）。

為了更直觀地看到給藥前后五批樣品OD 值和陽性率的變化（表5），將數(shù)據(jù)分析做圖來表示（圖3和圖4）。從圖3 結(jié)果分析后看出，OD 值的曲線呈V 型，就是停藥后第1d 到停藥后第7d，OD 值在不斷降低；停藥后第14d 到停藥后第21d，OD 值逐步回升。表明給藥后雞毒支原體抗體水平在給藥前兩周在降低，后兩周升高趨向于未給藥的正常水平。同時驗證了前述的縱向?qū)Ρ鹊贸龅慕Y(jié)果。

圖2 試驗停藥后第1d 到第21d 的變化

表3 對照組與試驗組雞毒支原體抗體水平比較

表4 給藥前后試驗組樣品吸光度值（OD 值）比較

從圖4 可以明顯看到，給藥前后五批樣品的抗體陽性率趨勢呈U型，變化接近于OD 值曲線的變化，也是前兩周在不斷降低，后兩周恢復(fù)至未給藥的正常水平，表明藥物對雞毒支原體在前兩周有良好的控制率。

3 試驗結(jié)論

1）給藥后測試組樣品的雞毒支原體抗體水平在1～14d 呈現(xiàn)下降狀態(tài)，15～28d 逐漸恢復(fù)至正常水平。

2）給藥后測試組樣品的雞毒支原體抗體陽性率與抗體水平趨勢表現(xiàn)一致，牧樂星對草種雞雞毒支原體抗體陽性率在給藥后兩周表現(xiàn)出明顯的抑制，從第三周起雞毒支原體抗體陽性率逐漸增高。

3）根據(jù)本試驗草種雞養(yǎng)殖條件及雞毒支原體抗體檢測結(jié)果，建議其用藥方法為：按泰萬菌素計250ppm 濃度集中飲水給藥7d，停藥14d，為1 個療程，如果雞毒支原體控制無改善，可考慮再給藥1個療程。

4 討論

本試驗采用ELISA 方法測定草種雞雞毒支原體的抗體，通過草種雞血清中支原體抗體水平變化和支原體抗體陽性率來評價牧樂星藥物對雞毒支原體控制情況。從試驗設(shè)計和原理上分析，牧樂星對支原體有很強的殺滅作用，最好的評價方法是檢測雞的支原體攜帶情況，由于分離支原體抗原存在技術(shù)上和數(shù)量上的難度，本試驗選擇檢測支原體抗體水平以及陽性率來間接反映藥物的作用。這種評價方法可能會受到抗原水平和抗體水平相關(guān)性的影響，有一些滯后性，但本試驗得出的結(jié)果也能反映出一定的趨勢。因此本試驗的結(jié)果對牧樂星藥物治療草種雞雞毒支原體有一定的參考價值。

表5 試驗組雞毒支原體抗體水平與陽性率

圖3 試驗組抗體水平比較

圖4 給藥前后樣品雞毒支原體抗體陽性率

試驗動物來源于江蘇某私人草種雞場，養(yǎng)殖條件較差，對照組與試驗組選擇2 棟同日齡且距離相近的雞舍，3,000 只/棟。采集的血清樣品中雞毒支原體抗體經(jīng)ELISA 方法檢測陽性水平很高，給藥前測試組與對照組血清稀釋200 倍后陽性率100%，經(jīng)過血清稀釋800 倍后陽性率為60%，表明本試驗動物來源場所雞毒支原體的攜帶率及血清抗體水平非常高，可能動物飼養(yǎng)環(huán)境較差，隔代消毒不完全，造成雞群與環(huán)境中雞毒支原體的廣泛傳播與反復(fù)感染。

在雞血的采集和樣品保存方面，為了保證待測血清充足，本試驗盡量采集2m L 以上的全血，在實驗室離心后得到100μL 以上的血清用于檢測以及重復(fù)驗證；但由于運送路途比較遠，加上保存時間有點長，每批樣品總會有幾個血樣完全凝固，造成采集血清困難，可能對提取血清的抗體水平會有一定的影響。

本試驗的試劑和溶液配制時間不應(yīng)該過長，比如牛清蛋白溶液時間長了會有絮狀沉淀，在封閉完了后可能會難以洗干凈而對試驗結(jié)果造成誤差；硫酸濃度不能太高，否則在終止一段時間后測出OD 值偏小，所以終止后應(yīng)該盡快測出OD 值。

5 結(jié)論

試驗通過草種雞血清中支原體抗體水平變化和支原體抗體陽性率來評價牧樂星藥物對雞毒支原體控制情況。從試驗結(jié)果可以看出牧樂星具有良好的防治效果，未見不良反應(yīng)，是一種較好的治療雞毒支原體感染的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素。■