包涵體蛋白的純化層析復(fù)性技術(shù)研究進(jìn)展

付強(qiáng) 吳全明 岳林濤

山西康寶生物制品股份有限公司 山西長(zhǎng)治 046000

原核細(xì)胞表達(dá)外源基因時(shí)，其表達(dá)蛋白多會(huì)在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)聚集形成包涵體，以包涵體為形態(tài)存在的蛋白質(zhì)分子一般不具有正確的天然三維結(jié)構(gòu)以及生物活性，因此臨床在進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)和研究的過程中必須通過復(fù)性操作技術(shù)對(duì)其進(jìn)行復(fù)性。層析復(fù)性技術(shù)是一種蛋白質(zhì)分離純化的方法并且得到了相對(duì)廣泛的應(yīng)用；按照目前純化實(shí)驗(yàn)中機(jī)制的不同，可將層析技術(shù)大致分為凝膠過濾層析、吸附性層析，本次研究則主要分析以上兩類包涵體蛋白的層析復(fù)性技術(shù)詳情（如下表1），現(xiàn)將研究概況做出整理報(bào)道。

表1 層析復(fù)性技術(shù)

1 凝膠過濾層析復(fù)性

凝膠過濾層析復(fù)性也稱體積排阻復(fù)性或分子篩復(fù)性。和常用的稀釋復(fù)性法（或透析法）比較，凝膠過濾層析復(fù)性能在較高的起始蛋白濃度下對(duì)蛋白進(jìn)行復(fù)性，其具有較高的活性回收率，因此使得目標(biāo)蛋白得到較高程度的純化[1]。因?yàn)閺?fù)性過程始終在溶液中完成，這對(duì)于蛋白質(zhì)的復(fù)性有利，此外在復(fù)性過程中合理選擇添加劑，會(huì)使得某些蛋白質(zhì)的復(fù)性效率提高，同時(shí)降低應(yīng)用成本，因此還需進(jìn)一步研究總結(jié)。

2 吸附性層析復(fù)性

吸附性層析復(fù)性包括離子交換層析、疏水層析、擴(kuò)張床層析以及親和層析等方法。

2.1 離子交換層析

變性蛋白質(zhì)和固定相之間所帶的電荷存在不同，因此變性蛋白質(zhì)多吸附在固定相的表面，這使得復(fù)性過程中蛋白質(zhì)的聚集作用得到避免，逐步提高洗脫液的鹽濃度，變性蛋白質(zhì)可洗脫出來。在進(jìn)行離子交換層析復(fù)性實(shí)驗(yàn)時(shí)，變性劑濃度的線性減少能有效抑制聚集體的形成，并且低濃度的變性劑能有效抑制復(fù)性中間體的聚集，增加復(fù)性的收率[2]。

2.2 疏水相互作用層析

疏水相互作用層析復(fù)性是利用蛋白疏水性基團(tuán)與固定相表面疏水基團(tuán)之間的疏水相互作用，使蛋白疏水區(qū)被結(jié)合，降低蛋白聚集，有利于從疏水核心開始的折疊并在柱上完成復(fù)性[3]。疏水層析復(fù)性常采用高濃度鹽上樣及平衡，因?yàn)楦啕}環(huán)境會(huì)增強(qiáng)疏水作用而有利于吸附蛋白，但高鹽環(huán)境同樣會(huì)引起蛋白鹽析，因此疏水層析復(fù)性前需對(duì)蛋白的鹽溶液進(jìn)行測(cè)試，避免堵塞層析柱。和其他的層析復(fù)性法相比較，疏水層析的固定相可促進(jìn)變性蛋白質(zhì)疏水核心的形成，因此疏水層析和其他層析法相比更利于復(fù)性，并能夠在最終實(shí)驗(yàn)中獲得較高的活性回收率。

2.3 擴(kuò)張床吸附層析

擴(kuò)張床吸附層析最早主要是直接從細(xì)菌裂解變性液中捕獲并復(fù)性對(duì)應(yīng)的目標(biāo)蛋白，將細(xì)菌破碎液直接加入到高濃度的變性劑中，然后將其上樣到擴(kuò)張好的柱床上，細(xì)胞碎片和不吸附的雜質(zhì)會(huì)流穿掉，而變性蛋白則被吸附在固相上，此后通過逐漸降低變性劑的濃度誘使變性蛋白質(zhì)折疊復(fù)性，將擴(kuò)張床沉降后使用洗脫緩沖液將目標(biāo)的蛋白洗脫下來，通過吸附、復(fù)性和洗脫，使變性蛋白得到復(fù)性，并獲得初步的純化。在此過程中細(xì)菌破碎液的清洗、復(fù)性和純化等結(jié)合為一體，實(shí)現(xiàn)了集成化操作，因此該復(fù)性技術(shù)的應(yīng)用前景廣闊[4]。

2.4 親和層析

親和層析技術(shù)，充分運(yùn)用固定相和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的特異性吸附作用，使得目標(biāo)蛋白質(zhì)可以在固定相中保留，從而導(dǎo)致變性劑和蛋白質(zhì)分離，而后在洗脫過程中進(jìn)行復(fù)性，依據(jù)親和層析復(fù)性的柱基成分不同，可以將親和層析復(fù)性分為脂質(zhì)體親和層析、分子伴侶親和層析和固定化金屬親和層析等方法；因?yàn)榕潴w和目標(biāo)蛋白質(zhì)之間的作用特異性強(qiáng)，因此不同配體和蛋白質(zhì)間的作用差別較大，故而親和層析復(fù)性的整體機(jī)理相對(duì)較為復(fù)雜[5]。

3 結(jié)語

包涵體蛋白的純化層析復(fù)性技術(shù)眾多，本文所闡述的幾種方法具有共同之處，即能夠通過線性洗脫，在溫和的條件下實(shí)現(xiàn)復(fù)性和層析介質(zhì)的隔離，降低了蛋白互相作用而產(chǎn)生的聚集，最終能夠在耗時(shí)較短的情況下實(shí)現(xiàn)蛋白的純化和復(fù)性。但是目前蛋白質(zhì)的折疊和聚集機(jī)制尚未被準(zhǔn)確做出解釋，因此對(duì)于不同蛋白質(zhì)的詳細(xì)情況還需反復(fù)試驗(yàn)證實(shí)，最終為臨床提供更優(yōu)的復(fù)性方法選擇途徑。