畜類食品中大腸菌群檢測(cè)技術(shù)介紹

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大腸菌群是一類呈革蘭氏陰性、兼性厭氧或者需氧、在37℃下經(jīng)過24小時(shí)培養(yǎng)可以發(fā)酵產(chǎn)生乳糖，并且能夠產(chǎn)酸以及產(chǎn)氣的無芽孢桿菌的統(tǒng)稱[1]。大腸菌群在自然界中分布較廣，主要存在于溫血?jiǎng)游锏募S便中。作為流行病學(xué)上安全性的指示菌，如果在水質(zhì)、食物或者藥品中大腸菌群的檢測(cè)結(jié)果呈陽性，就說明已經(jīng)受到了糞便的污染。因此食品行業(yè)迫切需要一種能夠?qū)π箢愂称分写竽c菌群進(jìn)行檢測(cè)的方法。

1 大腸菌群的MPN法

（1）乳糖發(fā)酵法。乳糖發(fā)酵法是以乳糖膽鹽作為待測(cè)樣品的主要培養(yǎng)基，經(jīng)過初發(fā)酵、平板分離以及復(fù)發(fā)酵后，根據(jù)菌落的革蘭氏染色情況以及產(chǎn)酸產(chǎn)氣情況判斷是否為大腸桿菌，接著根據(jù)MPN表計(jì)算大腸菌群數(shù)目的檢測(cè)方法。該方法技術(shù)簡(jiǎn)單，不需要復(fù)雜的儀器設(shè)備，但是操作繁瑣，測(cè)量時(shí)間較長(zhǎng)，有較多干擾因素。

（2）MPN計(jì)數(shù)法。大腸菌群MPN計(jì)數(shù)法是將待測(cè)畜類食品在月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯培養(yǎng)基中進(jìn)行初發(fā)酵和復(fù)發(fā)酵后，通過對(duì)產(chǎn)氣情況觀察及MPN表確定大腸菌群的數(shù)量。此種方法簡(jiǎn)化了乳糖發(fā)酵法的操作步驟，并且有效避免了其干擾因素，但是仍然存在操作時(shí)間過長(zhǎng)的問題。

2 直接計(jì)數(shù)法

直接計(jì)數(shù)法是一種利用大腸菌群所產(chǎn)生的β-半乳糖苷酶的顯色作用而進(jìn)行的快速檢測(cè)方法。杜茂昌通過乳糖、蛋白胨以及去氧膽酸鈉等制成的培養(yǎng)基對(duì)牛奶中大腸菌群的菌落進(jìn)行了直接計(jì)數(shù)[2]。這種方法適用性較廣，可以用來測(cè)定各種食品中的大腸菌群，但是也存在操作繁瑣及時(shí)間過長(zhǎng)的問題。

3 免疫學(xué)技術(shù)

（1）熒光免疫法。熒光免疫法是一種通過檢測(cè)抗體（抗原）與標(biāo)記了熒光素的抗原（抗體）相結(jié)合后的熒光強(qiáng)度來確定物質(zhì)濃度的測(cè)量方法。Rockabrand等發(fā)明了一種熒光物質(zhì)標(biāo)記大腸菌群包漿中特異性蛋白的單克隆抗體進(jìn)行大腸菌群檢測(cè)的熒光免疫法。熒光免疫法并不能對(duì)全部大腸菌群進(jìn)行特異性檢測(cè)，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果極容易受到其他細(xì)菌的交叉感染影響。

（2）酶聯(lián)免疫吸附法。酶聯(lián)免疫吸附法是一種通過酶標(biāo)測(cè)定儀或者肉眼觀察酶標(biāo)抗體與相應(yīng)抗原結(jié)合形成的有色不溶物顏色的深淺來判斷抗原數(shù)量的方法，王玉金等[2]利用酶聯(lián)免疫吸附法僅僅在10分鐘內(nèi)就完成了對(duì)豬肉大腸菌群的檢測(cè)。該法不僅操作簡(jiǎn)便，而且測(cè)量時(shí)間級(jí)短，但是該方法也存在容易受到其他細(xì)菌影響的缺陷。

4 分子生物學(xué)方法

（1）原位雜交法。原位雜交法是通過人工合成的探針與大腸菌群進(jìn)行原位雜交后，特異性地檢測(cè)對(duì)應(yīng)大腸菌群的方法。這種方法簡(jiǎn)便、省時(shí)，測(cè)量結(jié)果較為穩(wěn)定，可以對(duì)畜類食品中大腸菌群進(jìn)行定量分析。

（2）聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法是通過DNA聚合酶在體外對(duì)DNA進(jìn)行變性-延伸-復(fù)性的循環(huán)操作，從而實(shí)現(xiàn)NDA模板擴(kuò)增的一種克隆技術(shù)，通過對(duì)待測(cè)菌體DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物與純培養(yǎng)物DNA進(jìn)行比較，從而確定畜類食品中大腸菌群數(shù)量的檢測(cè)方法。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法不僅操作時(shí)間短，而且靈敏度高，但是對(duì)操作人員以及儀器設(shè)備的要求較高。

（3）基因芯片法?；蛐酒ㄊ峭ㄟ^PCR擴(kuò)增使熒光標(biāo)記過的分子進(jìn)入微生物樣品的DNA中，并且與基因芯片上特定的寡核酸點(diǎn)雜交，用熒光波長(zhǎng)掃描儀對(duì)雜交產(chǎn)物進(jìn)行掃描即可確定待測(cè)微生物的含量。祝儒剛等[3]通過對(duì)大腸埃希氏菌基因進(jìn)行編碼，對(duì)畜類肉制品中大腸埃希氏菌的含量進(jìn)行了檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)其檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到2pg?；蛐酒ú僮鞣奖悖哂休^高的靈敏度，同時(shí)方便快捷，甚至可以識(shí)別出死菌的DNA，但是目前并不適用于所有大腸菌群的檢測(cè)。

5 結(jié)語

傳統(tǒng)的大腸菌群MPN檢測(cè)方法操作繁瑣，費(fèi)時(shí)費(fèi)力，同時(shí)靈敏度較差。近年來隨著科學(xué)技術(shù)水平的不斷提高，出現(xiàn)了畜類食品中大腸菌群的免疫學(xué)以及分子生物檢測(cè)方法，這些方法明顯縮短了檢測(cè)的時(shí)間，提高了檢測(cè)的靈敏度，但是仍然存在著特異性以及重復(fù)性上的問題。此外，這些新技術(shù)對(duì)設(shè)備的要求較高，需要較高的檢測(cè)成本。因此要實(shí)現(xiàn)畜類食品中大腸菌群的檢測(cè)，還需要將已有方法不斷進(jìn)行改進(jìn)，并且探尋出更為合適的方法。