鈣離子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中的作用

李 銘，鄒 穎，郭 寒，常仁旭，葛婧昕，楊 威，陳媛媛，夏 成，張洪友，張冰冰，徐 闖*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，黑龍江大慶 163319；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江大慶 163319)

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)廣泛存在于除哺乳動(dòng)物成熟紅細(xì)胞以外的各種真核細(xì)胞中，屬于真核細(xì)胞中精細(xì)的膜系統(tǒng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜系統(tǒng)是細(xì)胞加工蛋白質(zhì)、脂質(zhì)及貯存鈣離子的主要場(chǎng)所，是分泌途徑的第一步。對(duì)于大多數(shù)分泌和跨膜蛋白來說，其新翻譯的未經(jīng)折疊的蛋白經(jīng)過富有鈣離子與折疊酶環(huán)境的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進(jìn)行初步的加工形成穩(wěn)定的三級(jí)結(jié)構(gòu)，且蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中只有被正確的構(gòu)象與修飾，才能轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體內(nèi)進(jìn)一步加工[1]。而錯(cuò)誤折疊的蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中則被相應(yīng)的蛋白解體酶降解。Ca2+參與細(xì)胞內(nèi)許多重要生理過程，如轉(zhuǎn)錄因子的激活、細(xì)胞質(zhì)增殖與凋亡、蛋白質(zhì)的修飾等。Ca2+的儲(chǔ)存和信號(hào)傳導(dǎo)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)重要功能之一。Ca2+在體內(nèi)的濃度受到非常嚴(yán)密的調(diào)控時(shí)，機(jī)體才能處于較穩(wěn)定的狀態(tài)；當(dāng)Ca2+濃度紊亂，機(jī)體則會(huì)發(fā)生很多不利反應(yīng)。細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度梯度差異是Ca2+作為胞內(nèi)第二信使的前提和重要條件。而這種情況主要是由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+-ATP酶泵(sarco-endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase，SERCAs)產(chǎn)生的。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)還在脂質(zhì)生物合成中起核心作用并產(chǎn)生磷脂、膽固醇、三酰甘油和神經(jīng)酰胺等。膽固醇合成的限速酶在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。當(dāng)膽固醇水平下降時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白(sterol regulatory element binding proteins，SREBPs)被激活，從而上調(diào)膽固醇表達(dá)，硬脂酰輔酶A脫氫酶(stearoyl-CoA desaturase，SCD)催化飽和游離脂肪酸(free fatty acids，F(xiàn)FA)去飽和[1]。絲氨酸棕櫚酰轉(zhuǎn)移酶，即從頭合成神經(jīng)酰胺的限速酶，也位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。

1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的正常發(fā)揮是細(xì)胞存活的必要條件。不論是正常的生理變化還是對(duì)環(huán)境的適應(yīng)表現(xiàn)，蛋白質(zhì)表達(dá)量的變化大都是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的調(diào)節(jié)來實(shí)現(xiàn)的[2]。由于游離膽固醇與磷脂比率和飽和游離脂肪酸含量較低，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜是細(xì)胞膜中最流動(dòng)的膜之一[3]。由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜有序性的增加而引起膜流動(dòng)性的損失，導(dǎo)致Ca2+消耗和蛋白質(zhì)錯(cuò)誤折疊。在缺氧、藥物作用、自由基侵入、Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡等刺激下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常功能被打亂，大量蛋白質(zhì)被錯(cuò)誤的折疊，導(dǎo)致大量未折疊蛋白質(zhì)(unfolded protein，UP)堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，促使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)啟動(dòng)應(yīng)急機(jī)制來緩解未折疊蛋白產(chǎn)生的壓力，這個(gè)過程稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)[4]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是一種重要的細(xì)胞自我防御機(jī)制，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)最先啟動(dòng)生存途徑，但長(zhǎng)時(shí)間的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激將導(dǎo)致細(xì)胞啟動(dòng)凋亡途徑[5]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激也是一種病理機(jī)制，如突變體表達(dá)蛋白質(zhì)紊亂，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶水平或Ca2+含量不足，氧化還原或ATP狀態(tài)改變，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)磷脂消耗和膽固醇積累。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與帕金森病、骨質(zhì)疏松癥、癌癥、退行性神經(jīng)疾病均相關(guān)。此外，肝細(xì)胞中含有大量的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，許多肝臟疾病均與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡相關(guān)，如病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、藥物性肝病、急性肝衰竭、肝癌等[6]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是由未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein reaction，UPR)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)性凋亡和整合應(yīng)激反應(yīng)這3種反應(yīng)相互關(guān)聯(lián)的動(dòng)態(tài)過程，主要為未折疊蛋白反應(yīng)[7]。UPR的主要目的是減少未折疊的蛋白質(zhì)負(fù)荷并恢復(fù)細(xì)胞器的穩(wěn)態(tài)。為此，UPR減少蛋白質(zhì)翻譯并誘導(dǎo)參與折疊、N-糖基化、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)降解、質(zhì)量控制、氧化還原及脂質(zhì)生物發(fā)生的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的轉(zhuǎn)錄等。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上存在著3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜受體感應(yīng)蛋白分別是肌醇依賴酶1(inositol requiring enzyme1,IRE1)、RNA激活蛋白激酶的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)類似激酶(pancreatic elf-2 kinase pancreatic ER kinase，PERK)和激活轉(zhuǎn)錄因子6(activating transcription factor 6，ATF6)[8]。IRE1α具有蛋白激酶活性和位點(diǎn)特異性內(nèi)切核糖核酸酶(RNase)活性。PERK還具有蛋白激酶活性并起到磷酸化真核翻譯起始因子2α(eukaryotic Initiation Factor 2α，eIF2α)的α亞基作用。ATF6是屬于cAMP應(yīng)答元件結(jié)合蛋白(cAMP response element binding protein，CREB)和ATF家族轉(zhuǎn)錄因子的堿性亮氨酸拉鏈(basic region/leucine zipper motif，bZIP)-結(jié)構(gòu)域轉(zhuǎn)錄因子。在靜息細(xì)胞中，ERS受體通過與ER分子伴侶GRP78/Bip結(jié)合而處于未激活狀態(tài)，一旦大量的未折疊蛋白聚集，GRP78/Bip便與這3個(gè)受體解離，去結(jié)合異常的蛋白。且膜受體蛋白解離后發(fā)生專屬激活通路，IRE1與PERK發(fā)生二聚化與自身磷酸化，當(dāng)ATF6從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體后經(jīng)過特異蛋白酶裂解形成激活的ATF6，從而觸發(fā)UPR。

當(dāng)PERK從Bip釋放后，對(duì)ERS最直接的反應(yīng)是PERK的同型二聚化和反式磷酸化，同時(shí)PERK磷酸化eIF2α。eIF2α的磷酸化抑制80 S核糖體的組裝，并因此抑制蛋白質(zhì)的合成。該途徑通過阻止額外新生多肽進(jìn)入已經(jīng)飽和的ER腔而促進(jìn)細(xì)胞存活。同時(shí)IRE1α發(fā)生自磷酸化，從而激活其核糖核酸酶活性。然后從編碼X盒結(jié)合蛋白1(X box bindging protein1，XBP1)的mRNA開始除去26堿基內(nèi)含子，使XBP1具有作為轉(zhuǎn)錄因子的有效活性[9]。

當(dāng)ATF6從BiP釋放時(shí)，它轉(zhuǎn)移到高爾基體中被第1位點(diǎn)蛋白酶(site-1 protease，S1P)和第2位點(diǎn)蛋白酶(site-2 protease，S2P)切割。該過程導(dǎo)致ATF6的功能性(含bZIP)片段釋放到胞質(zhì)中。這個(gè)片段然后遷移到核并激活轉(zhuǎn)錄[10]。值得注意的是，S1P和S2P還能切割膽固醇和脂肪酸生物合成所需的ER相關(guān)甾醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白[10]。切割的ATF6和活性XBP1亞型功能相似，以誘導(dǎo)編碼ER伴侶蛋白和促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊、成熟、分泌及ER相關(guān)蛋白降解酶基因的轉(zhuǎn)錄。然而，如果細(xì)胞不能解決蛋白質(zhì)折疊缺陷并恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的穩(wěn)態(tài)，則UPR將啟動(dòng)凋亡，通過去除產(chǎn)生錯(cuò)誤折疊或功能障礙蛋白質(zhì)的應(yīng)激細(xì)胞來保護(hù)機(jī)體[11]。

ERS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡主要由C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)介導(dǎo)，但是CHOP誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的機(jī)制仍然不清楚。然而，已經(jīng)顯示CHOP誘導(dǎo)促進(jìn)應(yīng)激細(xì)胞中的蛋白質(zhì)合成和氧化應(yīng)激的許多促凋亡因子(如TRB3，BIM和GADD34)的表達(dá)[12-13]。

2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中鈣離子的作用

Ca2+的動(dòng)態(tài)平衡是細(xì)胞保持正常結(jié)構(gòu)和功能的前提與基礎(chǔ)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞內(nèi)的重要鈣庫，通過維持細(xì)胞內(nèi)外Ca2+濃度的平衡來調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能、膜轉(zhuǎn)運(yùn)及保持內(nèi)部環(huán)境穩(wěn)態(tài)。細(xì)胞內(nèi)Ca2+水平是由鈣庫內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放介導(dǎo)的。Ca2+作為細(xì)胞內(nèi)重要的第2信使分子，參與了細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)、肌肉收縮、激素的分泌糖原代謝及神經(jīng)元興奮性等生理活動(dòng)，進(jìn)而調(diào)節(jié)基因和蛋白的表達(dá)、分泌、代謝和凋亡[14]。雖然目前對(duì)細(xì)胞凋亡有很多機(jī)制尚不明確，但是研究顯示當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+穩(wěn)態(tài)遭受破壞時(shí)，可以啟動(dòng)細(xì)胞早期凋亡信號(hào)。在靜息狀態(tài)下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+濃度高于細(xì)胞質(zhì)中Ca2+濃度，藍(lán)尼啶受體(ryanodinereceptor，RyR)、1，4，5-三磷酸肌醇受體(inositol-1，4，5-triphosphatereceptor，IP3R)和鈣泵3種位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與Ca2+的釋放和攝取密切相關(guān)的通道是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)維持Ca2+穩(wěn)態(tài)的主要因素，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+動(dòng)態(tài)平衡有著重要的作用[15]。在生理狀態(tài)下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+大部分呈游離狀態(tài)，由RyR和IP3R兩種受體負(fù)責(zé)將Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，然后鈣泵又將胞質(zhì)中的Ca2+攝取回到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，該過程持續(xù)進(jìn)行，使Ca2+保持著動(dòng)態(tài)平衡[15]。游離的Ca2+在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中具有較高的作用，它的變化幾乎關(guān)系到細(xì)胞內(nèi)所有的反應(yīng)，小到細(xì)胞收縮、胞吐，大到基因、蛋白表達(dá)和細(xì)胞死亡。當(dāng)大量Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中釋放出來后可以激活鈣調(diào)蛋白分解酶、死亡相關(guān)蛋白激酶，最終可以導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生凋亡。

3 鈣池引發(fā)鈣離子的內(nèi)流

細(xì)胞內(nèi)主要儲(chǔ)存Ca2+的細(xì)胞器為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，濃度約為400 μmol/L[16]。參與Ca2+濃度調(diào)控的通道蛋白主要有兩種功能：①誘導(dǎo)細(xì)胞外鈣離子進(jìn)入細(xì)胞內(nèi);②誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)Ca2+的釋放[17]。而胞內(nèi)鈣池引發(fā)鈣離子內(nèi)流(store-operated Ca2+entry，SOCE)廣泛存在于興奮細(xì)胞與非興奮細(xì)胞之間，是細(xì)胞攝取外源Ca2+的主要方式之一，相對(duì)的在非興奮細(xì)胞中起著更重要的作用。Ca2+通透性受體調(diào)節(jié)通道(ROCs)和鈣池引發(fā)的鈣離子進(jìn)入(SOCE)是調(diào)控其細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度Ca2+的主要通道。目前認(rèn)為ROCs引起的Ca2+升高是一個(gè)瞬時(shí)變化，不足以維持細(xì)胞的長(zhǎng)期反應(yīng)，SOCE則可持續(xù)升高Ca2+，而Ca2+持續(xù)升高是胞內(nèi)多種激酶激活的必要條件[18]。SOCE被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔Ca2+濃度降低激活而開放，生理作用在于補(bǔ)充內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的Ca2+而避免鈣庫Ca2+耗竭。間質(zhì)相互作用因子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)和鈣釋放激活鈣通道蛋白1(calcium release-activated calci-umchannel protein 1，Orai1)是目前已確定的SOCE組成蛋白，STIM1為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上Ca2+濃度感受器，Orai1是SOCE在細(xì)胞膜上的孔蛋白[19]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣池消耗后，STIM蛋白偶聯(lián)并活化Orai蛋白，SOCE通路開放形成內(nèi)向的Ca2+流以補(bǔ)充消耗的Ca2+。這對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)的鈣穩(wěn)態(tài)起著至關(guān)重要的作用，也保證了細(xì)胞內(nèi)Ca2+傳遞的準(zhǔn)確性。

STIM蛋白是存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的Ⅰ型跨膜蛋白，目前研究發(fā)現(xiàn)其存在STIM1和STIM2蛋白2種亞型，其在氨基酸序列上存在著高度的同源性[20]。STIM1和STIM2蛋白在細(xì)胞之中存在著通過與Orai蛋白競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合來發(fā)揮其各自的功能的競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系。研究顯示在大多數(shù)細(xì)胞中，STIM1蛋白的表達(dá)量高于STIM2蛋白，且STIM2蛋白與STIM1蛋白相比較對(duì)Orai蛋白的激活能力較弱[21-22]。因此STIM1蛋白在Ca2+的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中起著重要的作用。STIM1蛋白N端含有EF手性結(jié)構(gòu)域和SAM(sterile α- motif)結(jié)構(gòu)域組成的區(qū)域能夠感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)鈣池Ca2+濃度的微小變化并引發(fā)分子間的相互作用[23]。STIM1蛋白C端結(jié)構(gòu)域能夠跨過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和細(xì)胞膜。也包含具有活化功能的SOAR(STIM-Orai activating region)結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域可介導(dǎo)Orai蛋白與STIM1蛋白結(jié)合使SOCE通路開放[24]。靜息狀態(tài)下，STIM蛋白可能以二聚體的形式廣泛分散在整個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。在鈣池消耗后數(shù)秒內(nèi)，STIM1蛋白快速聚合化并移動(dòng)至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)近細(xì)胞膜區(qū)以結(jié)合并活化Orai蛋白。

Orai蛋白廣泛表達(dá)于多種細(xì)胞中。在哺乳動(dòng)物中，它有3種同源蛋白Orai1、Orai2及Orai3，3種蛋白的一級(jí)結(jié)構(gòu)非常相似，是一個(gè)定位于細(xì)胞膜的4次跨膜蛋白，且其N端和C端均位于胞漿一側(cè)。靜息狀態(tài)下Orai蛋白多以二聚體的形式存在于細(xì)胞膜表上，當(dāng)鈣池耗竭時(shí)，由于STIM1蛋白的激活使得Orai1由二聚體聚合為四聚體形成CRAC通道。Orai1、Orai2和Orai3都有mRNA表達(dá)，3種Orai以同源二聚體、同源多聚體、異源多聚體形式存在于細(xì)胞膜上[25]。研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)Orai2蛋白和Orai3蛋白與STIM1共同表達(dá)時(shí)均能形成Ca2+通道并且顯示出類似于Orai1與STIM1的共表達(dá)產(chǎn)生的Ca2+釋放激活的鈣電流(calcium release-activated calcium current，ICRAC)的電生理特性[26]。所有Orai蛋白均可增加SOCE，Orai增強(qiáng)SOC的作用由高至底依次為Orai1、Orai2、Orai3，其中Orai3能補(bǔ)償Orai1缺乏時(shí)的功能[27]；STIM1并不進(jìn)入細(xì)胞膜中，而是在距離細(xì)胞膜約10 nm～25 nm范圍內(nèi)與Orai蛋白相互作用。

SOCE的過程具體步驟為：細(xì)胞在靜息狀態(tài)下，STIM1蛋白在均勻的分布在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜表面，STIM1蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的cEF手性結(jié)構(gòu)域結(jié)合充足的Ca2+形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域[28]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)的Ca2+濃度較低時(shí)Ca2+從cEF手性結(jié)構(gòu)域中解離引起穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)域的展開從而使STIM1蛋白構(gòu)象變化并發(fā)生多聚化，并激活Orai1蛋白，引發(fā)鈣內(nèi)流從而補(bǔ)充鈣池，當(dāng)鈣池內(nèi)的Ca2+濃度恢復(fù)后STIM1蛋白迅速的與Orai1蛋白分離，Orai1通道也相應(yīng)的關(guān)閉。

4 展望

鈣離子是重要的細(xì)胞內(nèi)第二信使，參與細(xì)胞的多種生理病理過程，肝細(xì)胞在生理濃度的激素作用下可引起Ca2+持續(xù)升高，在生理狀態(tài)下，鈣離子信號(hào)調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的多種生理功能。研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡與肝病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用機(jī)理的研究，既可以進(jìn)一步了解細(xì)胞在應(yīng)激狀態(tài)下的自我調(diào)控能力，還可以進(jìn)一步了解肝病的發(fā)生機(jī)制，從而對(duì)疾病采取一些新的干預(yù)、治療措施，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。如通過應(yīng)用一些細(xì)胞毒性藥物誘發(fā)Ca2+升高導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，加速癌細(xì)胞的凋亡來治療癌癥，也可以應(yīng)用一些藥物或者細(xì)胞因子來阻斷疾病，減少甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)胞的凋亡，達(dá)到保護(hù)作用，但是Ca2+誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的細(xì)胞損傷在疾病中扮演了多大的作用尚不清楚，干擾藥物的研究也僅僅處于起步階段，有關(guān)Ca2+誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用需要更多的研究予以證實(shí)。