氣虛證動(dòng)物模型建立方法研究進(jìn)展

李 崇,王世坤,司紅彬*

(1.廣西大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,廣西南寧 530005;2.河南省鄭州市花花牛集團(tuán),河南鄭州 450000)

氣虛為中醫(yī)中常見的名詞術(shù)語，中醫(yī)氣虛在臨床中常表現(xiàn)為形體消瘦、無力、少氣、面色淡白、大便溏薄[1]等現(xiàn)象。對(duì)氣虛證的相關(guān)研究需要借助于中醫(yī)理論基礎(chǔ)建立相關(guān)氣虛證動(dòng)物模型。動(dòng)物模型的建立主要是模擬和復(fù)制人類相關(guān)疾病原型的某些特征，使其臨床狀態(tài)相似。在中醫(yī)研究中進(jìn)行動(dòng)物試驗(yàn)研究的關(guān)鍵問題就是如何建立符合中醫(yī)要求且科學(xué)的動(dòng)物模型，只有建立了科學(xué)的且符合中醫(yī)理論基礎(chǔ)的動(dòng)物模型，才能進(jìn)一步進(jìn)行中醫(yī)動(dòng)物試驗(yàn)的研究，并為其臨床研究提供經(jīng)驗(yàn)與數(shù)據(jù)支持。建立氣虛證動(dòng)物模型的方法有多篇文獻(xiàn)報(bào)道，歸納后大致可歸類為下述方法。

1 單因素氣虛證動(dòng)物模型的建立

1.1 控制日常攝食量法

在中醫(yī)的理論基礎(chǔ)中有眾多著作都介紹到谷物對(duì)機(jī)體的重要性及缺乏易引起氣不足。如《靈樞·營(yíng)衛(wèi)生會(huì)》中介紹到“人受氣于谷，谷入于胃，以傳與肺，五臟六腑，皆以受氣，其清者為營(yíng)，濁者為衛(wèi)，營(yíng)在脈中，衛(wèi)在脈外”?！鹅`樞·五味篇》中也介紹到“天地之精氣,其大數(shù)常出三入一,故谷不入,半日則氣衰,一日則氣少矣”等都有谷不足則氣虛的思想體現(xiàn)。有學(xué)者據(jù)此認(rèn)為控制日常攝食量建立氣虛證動(dòng)物模型是能在中醫(yī)理論基礎(chǔ)中找到相關(guān)理論依據(jù)且符合中醫(yī)動(dòng)物模型要求，因此有學(xué)者據(jù)此建立氣虛證模型。徐宇杰[2]采用控制日常攝食量建立小鼠氣虛證模型，將小鼠由群居生活變?yōu)閭€(gè)體生活，日常攝食量控制為每天125 g/kg，自由飲水，共需14 d建立模型，結(jié)果顯示從第2天開始，小鼠先出現(xiàn)精神委靡，逐漸精神異?？簥^，急切四處尋找食物，第7天后小鼠逐漸恢復(fù)到相對(duì)安靜狀態(tài)，第14天后，小鼠精神嚴(yán)重委靡，蜷縮不動(dòng)，被毛明顯可見枯槁脫落現(xiàn)象，尾部出現(xiàn)尾紺角化現(xiàn)象，極個(gè)別小鼠出現(xiàn)行動(dòng)困難匍匐爬行等現(xiàn)象。由此可判斷小鼠出現(xiàn)明顯氣虛癥狀模型成立。黃山鑒等[3]也采用控制日常攝食量建立氣虛證模型，結(jié)果顯示試驗(yàn)小鼠的體重、胸腺與體重的比值、脾臟與體重的比值、耐寒存活時(shí)間、負(fù)重游泳的時(shí)間都出現(xiàn)顯著下降，細(xì)胞的免疫反應(yīng)、體液的免疫反應(yīng)等也出現(xiàn)降低的現(xiàn)象。

1.2 中藥瀉下法

中醫(yī)理論中對(duì)大黃及番瀉葉等苦寒藥的用量及性情有詳細(xì)的描述，大黃為蓼科植物，其中含有多種有效成分[4]，具有瀉熱通腸、涼血解毒、逐瘀通經(jīng)的作用。番瀉葉為豆科植物[5]，其甘、苦、寒,歸大腸經(jīng),是一種常用的瀉下藥,具有瀉熱行滯、通便、利水之功能。但過量使用大黃及番瀉葉等苦寒藥易對(duì)脾胃造成損傷，繼而可引起氣虛證的出現(xiàn)。因此，部分學(xué)者常用大黃和番瀉葉等苦寒藥作為瀉下藥建立氣虛證模型。目前該法在建立氣虛證模型的諸多文獻(xiàn)中較為常見。賀志有等[6]研究發(fā)現(xiàn)，采用大黃水煎劑對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃能使其處于氣虛狀態(tài)。具體方法為將大黃水煎劑抽濾濃縮為濃度為1 g/mL的溶劑，并對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)7 d以上的灌胃，每只灌胃量按每天0.4 mL/10 g的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，其他方面按常規(guī)飼養(yǎng)進(jìn)行，試驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠出現(xiàn)體重下降，大便不成型呈稀溏狀，攝食量減少，懶惰不喜運(yùn)動(dòng)，毛色發(fā)黃且干燥的現(xiàn)象，由此判斷氣虛證模型建立成功。陳學(xué)習(xí)[7]通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，采用番瀉葉的水浸液對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃，也可使其處于氣虛狀態(tài)。具體方法為將番瀉葉放入煮沸的蒸餾水中按1∶20的比例進(jìn)行浸泡，過濾冷卻后備用。對(duì)小鼠按20 mL/kg的劑量，每天2次灌服，其他方面按常規(guī)飼養(yǎng)進(jìn)行，連續(xù)20 d以上模型建立成功。

1.3 疲勞法

在中醫(yī)理論著作中素有疲勞耗氣傷氣的描述。例如中醫(yī)的經(jīng)典著作《素問·舉痛論》中則有“勞則喘息汗出，外內(nèi)皆越，故氣耗矣”的描述。日常過度疲勞則能耗氣，長(zhǎng)久以往則可至氣虛。根據(jù)這一理論采用疲勞耗氣建立氣虛證模型的方法得到較多應(yīng)用。王艷梅等[8]采用水環(huán)境站臺(tái)睡眠剝奪法，將大鼠放置于高出水面的平臺(tái)之上給予充足的食物與飲水，當(dāng)大鼠疲勞進(jìn)入快速眼動(dòng)相睡眠[9]階段時(shí)，由于平臺(tái)面積較小大鼠將會(huì)掉入水中打斷其睡眠，大鼠為脫離水面會(huì)再次爬上平臺(tái)，此過程反復(fù)進(jìn)行從而得到睡眠剝奪的目的，建立模型持續(xù)進(jìn)192 h。郭偉[10]對(duì)采用睡眠剝奪至疲勞法建立大鼠氣虛證的動(dòng)物模型,進(jìn)行了血液的流變學(xué)、腸系膜微循環(huán)的檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示大鼠的血液流變學(xué)多項(xiàng)指標(biāo)均有顯著性的改變,腸系膜微循環(huán)檢測(cè)顯示血流速度變緩,血流量有下降趨勢(shì)。羅良等[11]采用大鼠負(fù)重游泳法建立氣虛證模型,具體操作為在尾部綁縛重量約為其體重15%的重物,放入水溫23℃左右、水深50 cm的水槽中進(jìn)行游泳力竭,以大鼠鼻尖沒入水面10 s為判斷力竭的標(biāo)準(zhǔn),每天1次,連續(xù)14 d。劉旭東等[12]通過游泳力竭至疲勞法建立氣虛證動(dòng)物模型，其結(jié)果顯示大鼠的爬行距離、爬行速度和垂直活動(dòng)次數(shù)顯著減少，在實(shí)驗(yàn)箱中心及其周邊停留時(shí)間顯著增加，箱角停留時(shí)間相對(duì)較短，前肢握力減弱，由此得出結(jié)論可以用行為學(xué)及前肢抓力作為評(píng)判氣虛證模型建立成功與否的依據(jù)。徐玉蓮等[13]采用將室溫控制在24℃左右，大鼠游泳水槽水溫在21℃左右，游泳水槽采用直徑為50 cm、高度為60 cm的圓形水桶，水深控制在47 cm左右，以大鼠四肢劃動(dòng)無力，身體豎立，整個(gè)頭部浸入水中10 s不能自行浮出水面為判斷力竭標(biāo)準(zhǔn)。甘加寬等[14]采用疲勞復(fù)合法建立氣虛證模型具體為睡眠剝奪加游泳力竭至疲勞，睡眠剝奪采用自制水平臺(tái)進(jìn)行，每天上午8:00至下午5:00在水平臺(tái)上飼養(yǎng)，下午5:00之后放入鼠籠飼養(yǎng)。隨后進(jìn)行力竭游泳，在小鼠尾部綁縛約為體重10%的重物，在水深19 cm，水溫30℃左右的水槽中游泳，用頭部沉入水中5 s不能浮出水面作為判斷力竭標(biāo)準(zhǔn)。

1.4 其他方法

除上述幾種建立氣虛證模型的方法外，常用的單因素建立氣虛證模型的方法還有失血法、食醋法、煙熏法等。張芳梅等[15]采用失血法成功建立氣虛證模型，具體操作為將大鼠放于室溫為30℃環(huán)境中，讓其適應(yīng)1 h后，將大鼠尾剪去0.3 cm～0.5 cm，并將鼠尾放于37℃的溫水中，讓其持續(xù)失血使失血量達(dá)到5 mL，以量筒進(jìn)行準(zhǔn)確定量，每周需進(jìn)行2次放血，共需5周。杜全宇等[16]采用把小鼠放在靜態(tài)染毒柜內(nèi)，每天呼吸2支煙，每支煙燃燒10 min左右，每周進(jìn)行6次，到第4周可建立氣虛證模型。梁俊清等[17]采用給大鼠用食醋按每天10 mL/kg進(jìn)行灌胃飼養(yǎng)，共進(jìn)行10 d可建立氣虛證模型。

2 多因素氣虛證動(dòng)物模型的建立

2.1 疲勞加中藥瀉下法

過度勞累可引起氣虛，大黃及番瀉葉等瀉下苦寒中藥過量服用亦可造成氣虛，兩種方法結(jié)合使用可加劇氣虛的形成。施旭光等[18]采取使大鼠游泳力竭至疲勞加大黃水煎劑灌胃瀉下的方法建立氣虛證模型。具體操作為取大黃放入煮沸后的蒸餾水中按1∶1的比例進(jìn)行煎煮，煎煮2次，過濾后合并濾液，放入冰箱進(jìn)行保存?zhèn)溆?。每天上午大黃水煎劑灌胃按每天20 mL/kg灌服，下午在大鼠尾部捆綁質(zhì)量為其本身體重10%的重物進(jìn)行負(fù)重游泳力竭至疲勞，水槽水深應(yīng)在50 cm以上、水溫控制在20℃左右的，以鼻尖沒入水中10 s，且不能自由上浮為判斷力竭的標(biāo)準(zhǔn)，共進(jìn)行15 d。結(jié)果顯示，試驗(yàn)大鼠胸腺與體重的比值、脾臟與體重的比值都有所下降，但胸腺與體重的比值下降更為明顯且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。王穎等[19]也通過相同的辦法建立氣虛證模型，其結(jié)果顯示大鼠隨著試驗(yàn)的進(jìn)程糞便出現(xiàn)變軟甚至呈稀溏狀，大鼠逐漸出現(xiàn)蜷縮倦怠懶動(dòng)，被毛干燥枯槁，反應(yīng)遲鈍等現(xiàn)象。

2.2 疲勞加控制日常攝食量法

在多因素建立氣虛證模型的方法中，疲勞加控日常攝食量法是較為常用的方法，在中醫(yī)理論中也易找到相關(guān)理論依據(jù)。王懿萍等[20]采用控制小鼠日常攝食量及強(qiáng)迫運(yùn)動(dòng)法建立氣虛證模型，小鼠日常攝食量按每天75 g/kg的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，并每天強(qiáng)迫其負(fù)重自身重量5%進(jìn)行游泳10 min，造模24 d后發(fā)現(xiàn)，小鼠體重下降、精神不振、皮毛槁枯、呼吸加快,心率加快等現(xiàn)象預(yù)示造模成功。有學(xué)者[21-22]采用體重在200 g左右的SD大鼠進(jìn)行15 d內(nèi)給予饑飽失常刺激進(jìn)行氣虛證模型的建立，具體操作為飽食1 d、禁食2 d，共進(jìn)行5個(gè)循環(huán)，同時(shí)每天讓其在水溫為36℃左右的水槽中進(jìn)行游泳至力竭，按大鼠出現(xiàn)消瘦食欲減少、焦慮、神疲和乏力等表現(xiàn)作為模型建立成功的標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)其焦慮程度采用曠場(chǎng)試驗(yàn)法評(píng)價(jià)，具體方法為將箱體底均分為25個(gè)小格,中間9格為中心區(qū)域,四角的4格為角落區(qū)域,剩余12個(gè)格為周邊區(qū)域，記錄大鼠5 min內(nèi)在不同區(qū)域的活動(dòng)時(shí)間，按焦慮程度= (角落活動(dòng)時(shí)間+周邊活動(dòng)時(shí)間) /中心活動(dòng)時(shí)間的方法進(jìn)行判斷[23]。

2.3 疲勞、控制日常攝食量加中藥瀉下法

汪婷婷等[24]采用游泳力竭至疲勞、控制喂食時(shí)間、大黃灌胃瀉下建立氣虛證模型。具體方法為每日大鼠攝食量實(shí)行8:00到20:00進(jìn)行喂食，20:00之后禁食的標(biāo)準(zhǔn)，上午給大鼠灌胃大黃水煎劑按1 mL/100 g的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，下午進(jìn)行負(fù)重游泳，在大鼠尾部纏繞為其體重10%的重物，放入裝有溫水且水深為80 cm的水槽中游泳至力竭，水溫控制在24℃左右，以大鼠鼻尖淹沒水中10 s作為判斷力竭的標(biāo)準(zhǔn)。連續(xù)進(jìn)行21 d建立模型。

2.4 疲勞、控制日常攝食量加水楊酸鈉灌胃法

王麗等[25]采用單日禁食、水楊酸鈉溶液灌胃、游泳至勞累建立氣虛證模型。具體方法是用20 g/L的水楊酸鈉溶液灌胃，每只鼠按每天10 mL/kg的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行，灌胃前后各禁食禁水1 h，從第29天開始增加溫水游泳10 min，同時(shí)實(shí)行單日禁食自由采水，雙日自由進(jìn)食采水，到50 d建立氣虛證模型完成。

3 展望

通過對(duì)大量文獻(xiàn)歸納可知，多數(shù)學(xué)者認(rèn)可并采用以疲勞為主建立模型，中醫(yī)理論中有勞則耗氣這一說法，在此基礎(chǔ)上逐漸添加了控制日常攝食量及中藥瀉下等方法。通過分析比較，發(fā)現(xiàn)疲勞加中藥瀉下法建立模型較快且容易進(jìn)行重復(fù)試驗(yàn)具有較好的效果。在建立氣虛證模型的過程中實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可能出現(xiàn)的焦慮現(xiàn)象，現(xiàn)已有文獻(xiàn)采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)法對(duì)其焦慮程度進(jìn)行判斷，曠場(chǎng)試驗(yàn)主要用來檢測(cè)嚙齒類動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)及探索行為，最早的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為大鼠，現(xiàn)逐漸發(fā)展應(yīng)用到小鼠和其他動(dòng)物，現(xiàn)最常在對(duì)大鼠焦慮程度的判斷采用此方法[26-28]。近幾年，有關(guān)氣虛證動(dòng)物模型建立方法的研究已有很大進(jìn)展相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道也逐漸增多。眾多文獻(xiàn)報(bào)道建立氣虛證模型的方法多種多樣，技術(shù)與設(shè)備也越發(fā)完善。

但氣虛證動(dòng)物模型建立的方法中仍然還用諸多有待解決的問題，主要有以下幾個(gè)方面：①在其描述用語方面就有較大差異，在眾多文獻(xiàn)中對(duì)疲勞狀態(tài)的描述有就有“懶惰”、“懶動(dòng)”、“精神委靡”、“神?！薄ⅰ捌７o力”、“倦怠”、“疲乏”、“蜷縮”等不同的描述。對(duì)疲勞狀態(tài)的認(rèn)識(shí)存在主觀上的差異，從而造成對(duì)其氣虛證模型建立成功與否的評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)存在差異。使其對(duì)各種方法的認(rèn)知停留在各抒己見獨(dú)自摸索的階段。②在常用的氣虛證模型建立的方法中存在不完善的問題，例如在控制日常攝食量建立氣虛證的模型的方法中，存在易把營(yíng)養(yǎng)不良引起的疾病與其氣虛狀態(tài)發(fā)生誤判，這是因?yàn)闆]有統(tǒng)一區(qū)分此誤判的標(biāo)準(zhǔn)。③在試驗(yàn)操作中存在缺陷，例如在利用多因素建立模型時(shí)存在建立模型所用時(shí)間較長(zhǎng)，試驗(yàn)操作等沒用統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)的問題。某些方法雖然可以建立氣虛證模型且符合中醫(yī)理論，但與臨床實(shí)踐不符，對(duì)臨床研究沒有太大意義。有些學(xué)者雖用相同方法建立氣虛證模型，但其操作方式、前期藥物的準(zhǔn)備方法與濃度、給藥及建立模型所用的時(shí)間等都有所不同，各有其不同的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果的判斷各抒己見，沒有形成統(tǒng)一的學(xué)術(shù)共識(shí)。

目前，對(duì)氣虛證相關(guān)描述用語正在逐漸形成通俗易懂且公認(rèn)的客觀描述術(shù)語及評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)有的方法正在不斷完善，新的方法也在不斷創(chuàng)新嘗試。以期能逐漸形成一套公認(rèn)的建立氣虛證模型標(biāo)準(zhǔn)及為判斷氣虛證模型建立成功與否的一套通俗易懂的量化標(biāo)準(zhǔn)。