中草藥多糖對樹突狀細胞免疫調(diào)節(jié)作用研究進展

巴雪麗，楊 雨，張愛蓮

(新疆大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院 新疆生物資源基因工程重點實驗室，新疆烏魯木齊 830046)

樹突狀細胞(dendritic cells，DCs)是功能最強大、最有效的抗原遞呈細胞(antigen presenting cells，APC)，是連接先天免疫反應(yīng)和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的橋梁，在免疫反應(yīng)中發(fā)揮著非常重要的作用。DCs可以識別、攝取、處理抗原并將抗原遞呈給未致敏的T淋巴細胞，從而啟動初次免疫應(yīng)答，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[1]。同時，DCs對免疫耐受以及T細胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)也有調(diào)節(jié)作用。因此，近年來以DCs為基礎(chǔ)的抗腫瘤、抗病毒感染以及自身免疫性疾病等免疫學(xué)方面的研究成為熱點。

中草藥在治療人類各種疾病方面具有悠久的歷史，大多數(shù)研究表明中草藥在上調(diào)或下調(diào)免疫反應(yīng)，特別在調(diào)節(jié)DCs成熟方面具有臨床療效。中草藥含有多種有效成分，包含多糖、黃酮類、皂苷及酚類等化合物，對機體存在著普遍的免疫調(diào)節(jié)作用。多糖類化合物是中草藥中起改變免疫作用的主要活性物質(zhì)，主要來源于中草藥的根、莖、葉、皮、種子和花。同時，多糖還具有抗腫瘤、抗病毒、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)活性。研究表明，多糖免疫調(diào)節(jié)作用的發(fā)揮可通過調(diào)節(jié)淋巴細胞的數(shù)量進而增強淋巴細胞的免疫功能，促進淋巴細胞的增殖等途徑。另外，中草藥多糖除了具有增強DCs的成熟和功能作用之外，還可以作為佐劑促進Th1型和Th2型免疫反應(yīng)。而且，多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用是通過多種機制進行，比如，與細胞表面Toll樣受體(Toll like receptor，TLR)結(jié)合，激活核轉(zhuǎn)錄因子(NF-κB)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，進而增強免疫反應(yīng)[2]。本文就中草藥多糖對DCs的免疫調(diào)節(jié)作用及其機制的研究展開綜述，為開發(fā)中草藥多糖的多種免疫調(diào)節(jié)作用提供參考。

1 DCs的生物學(xué)特性

DCs由骨髓或血液的造血干細胞以及外周血單核細胞分化而來，具有獨特的樹突狀細胞形態(tài)，主要發(fā)揮抗原遞呈的作用，也是唯一能誘導(dǎo)初次免疫應(yīng)答的抗原遞呈細胞。DCs通過調(diào)節(jié)自身成熟的狀態(tài)發(fā)揮其遞呈抗原的能力，當外源抗原與DCs表面的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)結(jié)合，未成熟的DCs變?yōu)槌墒斓腄Cs[3]。成熟后的DCs細胞膜表面高度表達MHCⅠ和MHCⅡ類分子及多種具有活化T、B淋巴細胞所需的共刺激分子，如CD40、CD80、CD86等，DCs表面的抗原肽-MHCⅡ類分子復(fù)合物和抗原肽-MHCⅠ類分子復(fù)合物分別被CD4+、CD8+T細胞表面的TCR識別，在黏附分子及其共刺激分子的作用下緊密結(jié)合，從而激活T淋巴細胞發(fā)揮免疫學(xué)效應(yīng)[4]。

2 中草藥多糖對DCs的免疫調(diào)節(jié)作用

2.1 中草藥多糖對DCs成熟和功能的影響

成熟DCs可以通過提供抗原信號、共刺激信號(MHC Ⅰ和MHC Ⅱ類等共刺激分子)以及細胞因子信號等方式使抗原特異性T細胞活化和增殖，并使抗原特異性T細胞根據(jù)不同的免疫反應(yīng)分化成為不同類型的輔助性T細胞(helper T cell,Th cell)[5]。成熟的DCs遞呈抗原后，自身可以分泌 IL-12等細胞因子，IL-12可以促進Th1型免疫反應(yīng)和細胞毒性T淋巴細胞(cytotoxic T lymphocytes,CTL)反應(yīng)，使T細胞分泌γ干擾素(IFN-γ)[6]。越來越多的研究表明，中草藥提取物中的多糖可以通過增強DCs表面分子的表達和細胞因子的分泌而促進DCs成熟，進而提高DCs抗原遞呈能力，降低DCs吞噬能力，促進淋巴細胞增殖，誘導(dǎo)DCs啟動免疫反應(yīng)，增強DCs發(fā)揮重要的免疫調(diào)節(jié)作用的功能。

Lin J等[7]研究發(fā)現(xiàn),黃芪多糖對小雞骨髓來源的DCs具有免疫調(diào)節(jié)作用。不同劑量的黃芪多糖提取物與小雞骨髓來源DCs共培養(yǎng)后，發(fā)現(xiàn)可顯著增加DCs表面分子CD40和CD80的表達，且IL-12的分泌量增高。顯微觀察發(fā)現(xiàn)黃芪多糖處理后的DCs與未經(jīng)黃芪多糖提取物處理的細胞相比，細胞形態(tài)發(fā)生明顯的變化，顯示出更加成熟的狀態(tài)?；旌狭馨头磻?yīng)結(jié)果顯示，黃芪多糖刺激DCs后可以促進小雞T淋巴細胞增殖，細胞培養(yǎng)上清液中IL-2的表達量有所增加。

體外研究發(fā)現(xiàn)，使用一定濃度的靈芝多糖處理DCs后其表面分子CD40、CD80、CD86和MHC Ⅱ類等的表達量顯著增加[8]；小鼠體內(nèi)免疫試驗表明，靈芝多糖促進DCs在抗原遞呈階段誘導(dǎo)特異性CTL反應(yīng)發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，增加IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-12/IL-23 p40的產(chǎn)生[9]。Lin Y L等[10]通過對人單核細胞誘導(dǎo)產(chǎn)生DCs的研究發(fā)現(xiàn)，靈芝多糖可以增強細胞表面CD80、CD86、CD83、CD40和CD54，以及人白細胞抗原(HLA)-DR的表達，IL-12和IL-10等細胞因子的分泌，降低DCs吞噬能力，促進DCs刺激T細胞分泌IFN-γ和IL-10。

此外，有研究表明，杜仲多糖[11]、甘草多糖[12]都能夠分別促進DCs表面MHC類分子和上述共刺激分子的表達，提高促炎性細胞因子IL-12、TNF-α等的產(chǎn)生，降低內(nèi)吞能力，增強抗原遞呈能力和T細胞增殖，發(fā)揮免疫增強作用。

2.2 中草藥多糖對DCs介導(dǎo)的抗腫瘤免疫調(diào)節(jié)作用的影響

大多數(shù)腫瘤的發(fā)生是由于機體的免疫功能異?；蛘呤遣荒茏R別出非正常的細胞，使腫瘤細胞在一定的條件下迅速增殖分化，形成腫瘤。DCs是機體內(nèi)抗原遞呈能力最強的細胞，可以有效阻止腫瘤的轉(zhuǎn)移，發(fā)揮長期監(jiān)視腫瘤和殺傷腫瘤的作用，達到消滅腫瘤的目的。目前，美國FDA已經(jīng)批準了治療腫瘤的DCs療法用于臨床應(yīng)用。DCs抗腫瘤疫苗可以誘導(dǎo)抗原特異性免疫應(yīng)答，將腫瘤抗原信息傳遞給免疫系統(tǒng)，重建免疫監(jiān)視和殺死癌細胞。但是大多數(shù)體外誘導(dǎo)的DCs成熟能力低，遷移能力差，細胞存活率不理想[13]。而多糖可以激活DCs的免疫活性，促進細胞表面分子及IL-1、IL-2、TNF-α、IFN-γ等細胞因子的生成，增加體內(nèi)抗體的形成，從而增強機體的抗腫瘤能力。

藏紅花多糖可以作為佐劑增強DCs的成熟，提高TNF-α和IL-1β的分泌，同時可以增強CTL和自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)的活性，增強DC疫苗殺傷腫瘤抗原的能力。藏紅花多糖聯(lián)合DC疫苗治療B16黑色素瘤細胞株的荷瘤小鼠模型時發(fā)現(xiàn)，聯(lián)合多糖組較單獨DC疫苗組的瘤重及腫瘤平均直徑明顯減小，表明藏紅花多糖能有效地增強DC疫苗的抗腫瘤免疫反應(yīng)能力[14]。

Aipire A等[15]通過體外研究發(fā)現(xiàn)甘草多糖處理DCs后，CD40、CD80、CD86和MHC Ⅱ的表達量顯著上調(diào)，細胞培養(yǎng)液上清中IL-1β、IL-6、IL-12 和TNF-α的濃度顯著升高，而且呈現(xiàn)出劑量依賴方式。進一步研究發(fā)現(xiàn)甘草多糖處理的骨髓來源的DCs對腫瘤組織的生長能夠產(chǎn)生明顯的抑制作用，而且表現(xiàn)出早期治療組的效果明顯優(yōu)于晚期治療組，提高了腫瘤抑制率，延長小鼠的存活時間。黃芪分離出來的多糖既可以增強骨髓來源的DCs的成熟及IL-12、TNF-α的分泌，又可以與腫瘤裂解物共同處理DCs用于腫瘤攻擊試驗，還可以增強小鼠對淋巴瘤的預(yù)防及治療作用。

從上述不難看出，中草藥多糖通過改變DCs表面分子及細胞因子的表達量而改變DCs的成熟狀態(tài)，增強了DCs的功能，從而發(fā)揮DCs的抗腫瘤作用。

2.3 中草藥多糖對DCs介導(dǎo)的抗病毒免疫調(diào)節(jié)作用的影響

病毒性疾病嚴重威協(xié)著人類和動物健康。耐藥性的出現(xiàn)和新病毒的傳播將是對抗病毒性疾病的新挑戰(zhàn)。尋找和開發(fā)具有安全性、顯著性和低毒性的新型抗病毒制劑是當今人類面臨的緊迫問題。傳統(tǒng)中草藥由于其優(yōu)勢，包括資源豐富，價格低廉，副作用小，已成為抗病毒治療的研究重點。大多數(shù)研究已表明中草藥多糖在抗病毒方面具有顯著的效果，研究發(fā)現(xiàn)中草藥多糖通過增強DCs表面分子以及細胞因子的分泌而發(fā)揮抗病毒作用。

Feng H B等[16]研究發(fā)現(xiàn)，將川明參多糖配伍口蹄疫疫苗可以顯著增加MHC類分子的表達，同時可以顯著提高共刺激類分子CD40、CD80和CD86的表達，因此川明參多糖作為口蹄疫疫苗的佐劑可以促進DCs的成熟和功能，進而發(fā)揮抗病毒的免疫調(diào)節(jié)作用。Song X等[17]研究者發(fā)現(xiàn)，硫酸化的川明參多糖對于感染了強新城疫病毒的小雞具有抗病毒作用。Feng H B等[18]研究發(fā)現(xiàn),磷酸化的川牛膝多糖作為口蹄疫疫苗佐劑通過上調(diào)MHCⅡ分子的表達，增加細胞因子的分泌以及增加DCs表面分子CD40,CD80,CD86的表達量，進而促進DCs的成熟而發(fā)揮抗病毒免疫增強作用。

Du X G等[19]研究表明黃芪多糖作為乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)DNA 疫苗佐劑，通過上調(diào)MHC Ⅰ/Ⅱ,CD40,CD80以及 CD86分子的表達刺激DCs的成熟，進而增強DNA疫苗的抗病毒作用。Wu Y J等[20]研究發(fā)現(xiàn),茯苓多糖作為H1N1流感疫苗和乙型肝炎抗原疫苗佐劑，通過刺激DCs產(chǎn)生IL-12p70和TNF-α，進而促進DCs的成熟，增強DCs的抗原遞呈能力。DCs在人類免疫缺陷病毒(HIV)感染中通過影響病毒的傳輸，靶細胞感染，以及對HIV抗原的遞呈具有重要作用。DCs通過分泌炎性細胞因子和干擾素(IFNs)，改變T細胞增殖和分化，參與具有免疫失調(diào)特點的慢性艾滋病毒感染。

上述研究表明，中草藥多糖通過刺激活化的DCs，促進DCs的成熟，改變DCs的功能，增加表面分子及細胞因子的分泌，從而發(fā)揮抗病毒的免疫調(diào)節(jié)作用。

2.4 中草藥多糖增強 DCs免疫調(diào)節(jié)作用的機制

研究表明多糖與DCs等免疫細胞表面PRRS結(jié)合，激活下游分子的表達，進而啟動免疫應(yīng)答，發(fā)揮相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。DCs表達的PRR主要包括信號轉(zhuǎn)導(dǎo)受體(如TLR)、胞吞受體(如C型凝集素受體)和調(diào)理吞噬細胞的受體(如補體受體)等。這些受體可以通過啟動信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與免疫調(diào)節(jié)，從而使機體做出特異性免疫免疫應(yīng)答。在DCs分化的過程中，TLR信號通路的激活在DCs功能的發(fā)揮中是必不可少的。因此，目前關(guān)于多糖與DCs表面TLR2或者TLR4受體結(jié)合，激活NF-κB、MAPK等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的報道較多，而通過其他信號通路發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的研究報道較少。

Lemmon H R等[21]選取人參多糖為研究對象，不同劑量的人參多糖作用于DCs，采用基因芯片技術(shù)分析TLRs相關(guān)膜受體等信號分子的基因在mRNA水平的變化，初步確定人參多糖可以結(jié)合DCs表面受體TLR2和TLR4，激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，調(diào)節(jié)通路中分子的表達，改變固有的免疫作用。Zhang X R等[22]研究表明，枸杞多糖與DCs表面受體TLR2和TLR4的結(jié)合，誘導(dǎo)DCs成熟，當加入TLR受體抑制劑時能抑制枸杞多糖對DCs的誘導(dǎo)作用。在Toll樣受體信號通路的下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子中，NF-κB通路的作用必不可少，NF-κB的核轉(zhuǎn)位及其下游差異基因的活化是通過多種胞外刺激信號產(chǎn)生，從而使DCs的免疫活性及分化方向發(fā)生改變。

Lu H L等[23]研究發(fā)現(xiàn),云芝多糖是一種新型的TLR2通路興奮劑，通過劑量依賴方式僅僅活化TLR2信號通路，并不參與其他TLR信號通路的活化。通過TLR2信號通路依賴方式上調(diào)DCs表面分子CD86和MHCⅡ的表達，促進DCs的成熟，增加IL-12p40和IL-12p70細胞因子的分泌，進而增強DCs的免疫作用。

Kim J Y等[24]研究發(fā)現(xiàn),當歸多糖是一種天然TLR4配體，與TLR4結(jié)合后，可以提高信號通路中ERK、JNK、p38和MAPK等下游信號分子的磷酸化以及NF-κB、p50/p65核轉(zhuǎn)錄，增強DCs的成熟。同時，當歸多糖通過NF-κB和p38等信號通路的活化，增加細胞CCR7等趨化因子在樹突狀細胞中的表達，改變樹突狀細胞的遷移方向，使其遷向淋巴結(jié)。Qin T[25]在研究中發(fā)現(xiàn),猴頭菇多糖對DCs誘導(dǎo)作用的抑制可以通過加入TLR4受體抗體和NF-κB、ERK、 p38和MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子抑制劑，說明猴頭菇多糖與表面TLR4受體結(jié)合后，可以激活下游信號轉(zhuǎn)導(dǎo)分子誘導(dǎo)DCs成熟。Zhang A L等[26]體外研究發(fā)現(xiàn)，向培養(yǎng)的DCs中加入一定量的TLR4抑制劑TAK-242之后，再加入一定濃度的一枝蒿多糖處理DCs，檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理后DCs表面分子CD86和CD40的上調(diào)表達顯著被抑制，細胞因子IL-12和TNF-α的增加也被顯著抑制，表明一枝蒿多糖通過TLR4信號通路中誘導(dǎo)DCs的成熟以及細胞因子的產(chǎn)生。此外，黃芪多糖[27]、甘草多糖[12]等也被證實通過 TLR4激活NF-κB等細胞內(nèi)信號通路，發(fā)揮相應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)作用。

3 結(jié)語

中草藥多糖通過調(diào)節(jié)DCs的成熟狀態(tài)及DCs細胞因子的分泌進而增強免疫反應(yīng)，也可以通過增強DCs表面共刺激分子和MHC分子的表達而提高免疫反應(yīng)，綜合以上研究表明中草藥多糖可以作為疫苗佐劑提高特異性免疫反應(yīng)。而上述DCs功能大多是通過中草藥多糖的免疫調(diào)節(jié)作用而實現(xiàn)。已有大量學(xué)者開展多糖類物質(zhì)作為增強機體免疫功能藥物的研究，迄今為止已對100余種中草藥多糖的生物學(xué)作用進行了研究，已將人參多糖、香菇多糖、黃芪多糖等一批具有顯著免疫調(diào)節(jié)作用，而且毒性作用小、不良反應(yīng)少的多糖類新藥用于臨床治療。

盡管人們已對DCs開展了大量的研究，但由于DCs的異質(zhì)性，使得中草藥多糖對不同類型DCs的影響尚不明確。DCs可分為髓樣和漿狀體DCs，未來的研究應(yīng)該探討中草藥多糖對不同類型DCs的作用，以及DCs在系統(tǒng)和黏膜組織中的分布，中草藥多糖如何作為免疫抑制或免疫耐受佐劑，中草藥多糖處理后DCs如何發(fā)揮其他的免疫反應(yīng)?？偟膩碚f，要想真正闡明中草藥多糖對DCs免疫調(diào)節(jié)作用的機理，對此領(lǐng)域的研究仍有待進一步深入。

參考文獻:

[1] Ueno H,Klechevsky E,Schmitt N,et al.Targeting human dendritic cell subsets for improved vaccines[C]//Seminars Immunol， Academic Press,2011,23(1):21-27.

[2] Li J Y,Li J,Zhang F.The immunoregulatory effects of Chinese herbal medicine on the maturation and function of dendritic cells[J].J Ethnopharmacol,2015,171:184-195.

[3] O'neill L A J,Golenbock D,Bowie A G.The history of Toll-like receptors-redefining innate immunity[J].Nat Rev Immunol,2013,13(6):453.

[4] Li J Y,Wang X,Wang W,et al.Pleurotusferulaewater extract enhances the maturation and function of murine bone marrow-derived dendritic cells through TLR4 signaling pathway[J].Vaccine,2015,33(16):1923-1933.

[5] Kalinski P.Dendritic cells in immunotherapy of established cancer:Roles of signals 1,2,3 and 4[J].Curr Opin Invest Drugs,2009,10(6):526.

[6] Carreno B M,Becker-Hapak M,Huang A,et al.IL-12p70-producing patient DC vaccine elicits Tc1-polarized immunity[J].J Clin Invest,2013,123(8):3383.

[7] Lin J,Kang H,Liang J,et al.CpG oligonucleotides and astragalus polysaccharides are effective adjuvants in cultures of avian bone-marrow-derived dendritic cells[J].Bri Poult Sci,2015,56(1):30-38.

[8] Zhu N,Lv X,Wang Y,et al.Comparison of immunoregulatory effects of polysaccharides from three natural herbs and cellular uptake in dendritic cells[J].Int J Biol Macromol,2016,93:940-951.

[9] Cao L Z,Lin Z B.Regulatory effect ofGanodermalucidumpolysaccharides on cytotoxic T-lymphocytes induced by dendritic cellsinvitro[J].Acta Pharmacol Sinica,2003,24(4):321-326.

[10] Pi C C,Chu C L,Lu C Y,et al.Polysaccharides fromGanodermaformosanumfunction as a Th1 adjuvant and stimulate cytotoxic T cell responseinvivo[J].Vaccine,2014,32(3):401-408.

[11] Feng H B,Fan J,Song Z,et al.Characterization and immunoenhancement activities ofEucommiaulmoidespolysaccharides[J].Carbohyd Polymers,2016,136:803-811.

[12] Li J Y,Wang X,Wang W,et al.Pleurotus ferulae water extract enhances the maturation and function of murine bone marrow-derived dendritic cells through TLR4 signaling pathway[J].Vaccine,2015,33(16):1923-1933.

[13] 姚冰清,張俊萍.基于樹突狀細胞的抗腫瘤策略與思考[J].中國癌癥防治雜志,2016,8(1):55-58.

[14] Chang J M,Hung L M,Chyan Y J,et al.Carthamustinctoriusenhances the antitumor activity of dendritic cell vaccines via polarization toward Th1 cytokines and increase of cytotoxic T lymphocytes[J].Evidence-Based Compl Alter Med,2011,doi:10.1093/ecam/nen068.

[15] Aipire A,Li J Y,Yuan P F,et al.Glycyrrhizauralensiswater extract enhances dendritic cell maturation and antitumor efficacy of HPV dendritic cell-based vaccine[J].Sci Rep,2017,7.

[16] Feng H B,Fan J,Qiu H,et al.Chuanminshenviolaceumpolysaccharides improve the immune responses of foot-and-mouth disease vaccine in mice[J].Int J Biol Macromol,2015,78:405-416.

[17] Song X,Zhang Y,Yin Z,et al.Antiviral effect of sulfatedChuanmingshenviolaceumpolysaccharide in chickens infected with virulent Newcastle disease virus[J].Virology,2015,476:316-322.

[18] Feng H B,McDonough S P,Fan J,et al.PhosphorylatedRadixCyathulaeofficinalispolysaccharides act as adjuvant via promoting dendritic cell maturation[J].Molecules,2017,22(1):106.

[19] Du X G,Zhao B,Li J,et al.Astragaluspolysaccharides enhance immune responses of HBV DNA vaccination via promoting the dendritic cell maturation and suppressing Treg frequency in mice[J].Int Immunopharmacol,2012,14(4):463-470.

[20] Wu Y J,Li S,Li H,et al.Effect of a polysaccharide fromPoriacocoson humoral response in mice immunized by H1N1 influenza and HBsAg vaccines[J].Int J Biol Macromol,2016,91:248-257.

[21] Lemmon H R,Sham J,Chau L A,et al.High molecular weight polysaccharides are key immunomodulators in North American ginseng extracts:characterization of the ginseng genetic signature in primary human immune cells[J].J Ethnopharmacol,2012,142(1):1-13.

[22] Zhang X R,Zhou W,Zhang Y.Immunoregulation andLyciumbarbarum[M].inLyciumbarbarumand Human Health.Springer Netherlands,2015:27-44.

[23] Lu H L,Yang Y,Gad E,et al.Polysaccharide krestin is a novel TLR2 agonist that mediates inhibition of tumor growth via stimulation of CD8 T cells and NK cells[J].Clin Cancer Res,2011,17(1):67-76.

[24] Kim J Y,Kim Y J,Kim J S,et al.Adjuvant effect of a natural TLR4 ligand on dendritic cell-based cancer immunotherapy[J].Cancer Let,2011,313(2):226-234.

[25] Qin T,Ren Z,Huang Y,et al.SelenizingHericiumerinaceuspolysaccharides induces dendritic cells maturation through MAPK and NF-κB signaling pathways[J].Int J Biol Macromol,2017,97:287-298.

[26] Zhang A L,Yang Y,Wang Y,et al.Adjuvant-active aqueous extracts fromArtemisiarupestrisL.improve immune responses through TLR4 signaling pathway[J].Vaccine,2017,35(7):1037-1045.

[27] Zhou L J,Liu Z,Wang Z,et al.Astragaluspolysaccharides exerts immunomodulatory effects via TLR4-mediated MyD88-dependent signaling pathwayinvitroandinvivo[J].Sci Rep,2017,7.