惡性瘧原蟲的免疫逃避機制研究進展

周雅盼，李 嬌，鮑 麗，段 萍，白 冰，桑曉宇，楊 娜，馮 穎，姜 寧*

(1.沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)，遼寧沈陽 110866；2.遼寧省血液中心，遼寧沈陽 110000)

瘧疾與艾滋病和結(jié)核病稱為非洲三大殺手。在每年記錄的大約3億的瘧疾臨床案例中，有50萬死亡案例發(fā)生在非洲，且主要由惡性瘧原蟲感染引起。瘧原蟲的生活史較為復(fù)雜，中間宿主和終末宿主按蚊之間交替?zhèn)鞑ァＴ谏钪芷诘牟煌A段，瘧原蟲既可在胞內(nèi)也可在胞外生活可通過改變其形狀、運動性和代謝需求以適應(yīng)不同宿主體內(nèi)的不同環(huán)境。為了逃避宿主的免疫清除機制，寄生蟲自身需發(fā)生一系列的變化。瘧原蟲可以通過抗原多態(tài)性、抗原變異、表位隱蔽等多種機制來逃避宿主的免疫清除。

1 感染依賴的抗體增強作用

感染依賴的抗體增強作用最先用于描述病毒。后來也報道了在哺乳動物體內(nèi)寄生蟲的不同發(fā)育階段的感染依賴的抗體增強作用。20世紀90年代初，F(xiàn)ranzen L等發(fā)現(xiàn)CS(子孢子)蛋白重復(fù)區(qū)域的抗體能增強嚙齒動物和人類寄生蟲子孢子入侵肝細胞及在其內(nèi)發(fā)展的能力。在體外培養(yǎng)中，添加富含天冬酰胺的蛋白質(zhì)抗體能加強惡性瘧原蟲裂殖子入侵紅細胞的能力。裂殖子特異性抗體與補體結(jié)合也可促進入侵紅細胞[1]。在體內(nèi)，感染的抗體依賴增強作用也曾被觀察到，在接種伯氏瘧原蟲血液期樣本后死亡率大幅升高；在有性繁殖階段，抗配子體抗體也能增強感染蚊的能力。

2 抗原的多態(tài)性

瘧原蟲抗原高度多態(tài)性可能是宿主抗瘧原蟲免疫反應(yīng)不完全或減弱的主要原因。與其他生物體類似，寄生蟲也容易發(fā)生突變。在哺乳動物體內(nèi)，瘧原蟲是單倍體，突變率為(0.7～1)×10-9個突變/基因[2]。瘧原蟲有24 h～72 h的血液循環(huán)，因此很可能發(fā)生突變，并產(chǎn)生不同的寄生蟲克隆。在蚊體內(nèi)，瘧原蟲進行有性繁殖，兩個單倍體配子體產(chǎn)生4個單倍體子孢子后代。基因重組發(fā)生在有性繁殖階段，會增加基因多態(tài)性。已經(jīng)觀察一些抗原有數(shù)百個單倍型。編碼序列中的多態(tài)性可能是由于點突變，堿基插入或缺失引起的。許多瘧原蟲抗原具有可重復(fù)單位大小和數(shù)量變化的重復(fù)區(qū)域。這種多樣性大多是由免疫壓力造成的，因為突變常發(fā)生在可被抗體或T細胞識別的區(qū)域中。B表位的突變使抗體不能識別寄生蟲，并可能導(dǎo)致用不同的單體型選擇寄生蟲。這對于疫苗開發(fā)很重要，因為以多態(tài)性表位抗原為基礎(chǔ)的疫苗制劑可能具有有限的功效或選擇具有疫苗抗性寄生蟲。例如，基于高度多態(tài)性抗原[3]AMA-1蛋白的疫苗。然而，可以設(shè)想誘導(dǎo)識別多種變體的廣泛抑制性抗體的免疫原可以規(guī)避多態(tài)性。在不同變體中鑒定結(jié)構(gòu)保守約束的研究可為新型多形抗原疫苗鋪路。

T細胞表面分子的多態(tài)性可能對T細胞應(yīng)答具有深遠的影響,并且已經(jīng)顯示限制RTS,S疫苗的效果[4]。T細胞一般分別為CD8+T細胞和CD4+T細胞。寄生蟲蛋白在細胞質(zhì)中被消化產(chǎn)生的CD8抗原肽，被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的轉(zhuǎn)運蛋白轉(zhuǎn)運到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。外源抗原也可通過MHCⅠ類分子的交叉表達來呈現(xiàn)。這些復(fù)合物可被T細胞受體識別。將表位錨定到MHC的氨基酸的突變可以防止肽與MHC的結(jié)合或TCR的識別，從而消除T細胞活性。改變的肽配體(APL)仍然可結(jié)合MHC分子，但是，無論是單獨使用還是與野生型肽同時使用，都可以防止T細胞的增殖，還可以阻止細胞因子的產(chǎn)生或改變其生產(chǎn)模式，即從IFN-γ到IL-10。這些APL也可干擾來自初始T細胞的記憶T細胞的誘導(dǎo)。這種有效的免疫逃逸機制是疫苗研發(fā)的主要障礙。任何基于T細胞疫苗的研究，應(yīng)對T細胞多態(tài)性及其作用進行徹底分析。

3 抗原變異

抗原變異是指病原體周期性改變暴露在其表面的抗原分子，進而逃避宿主的免疫清除，是病原體生存和進化的重要方法。首先由Brown N在治療藥物治療誘發(fā)的恒河猴慢性復(fù)發(fā)感染中描述。抗體和脾臟可以誘導(dǎo)不同抗原性變異[5]。后續(xù)試驗表明，與抗原多態(tài)性相反，瘧原蟲具有不同等位基因并可歸類為基因組克隆，抗原變異是與瘧原蟲相同的基因組克隆發(fā)生的表型變異。

容易發(fā)生抗原變異的抗原通常在染蟲紅細胞表面表達[6]。包括許多基因家族，如var基因家族，stevor基因家族，rifin基因家族，surfin基因家族，sicavar基因家族和瘧原蟲散開重復(fù)(pir )基因。var基因家族是研究最多的，已被證明是保護性抗血液抗體的靶點。由var基因家族編碼的PfEMP1蛋白是高度多態(tài)性的并且具有不同的可變結(jié)構(gòu)域，稱為Duffy結(jié)合域[7]，對內(nèi)皮細胞上的各種配體有結(jié)合特異性，例如血小板反應(yīng)蛋白，CD36，ICAM-1 ，硫酸軟骨素A，VCAM-1，內(nèi)皮細胞選擇素，αvβ3 整合素，透明質(zhì)酸，PECAM-1，gC1qR/HABP1/p32或內(nèi)皮蛋白C受體[8]。

染蟲紅細胞細胞黏附引起的寄生蟲聚集也參與許多瘧疾的病理反應(yīng)。大多數(shù)的染蟲紅細胞都可以TSP和CD36發(fā)生黏附，只有少數(shù)能與ICAM-1結(jié)合。PfEMP-1蛋白也通過補體受體1與正常紅細胞結(jié)合，形成玫瑰花結(jié)和降低血流速度并且聚集在深層組織后毛細血管微靜脈上，從而避免蟲體隨著血液循環(huán)到達脾臟而被識別清除。染蟲紅細胞聚集的部位往往是低氧環(huán)境，利于蟲體的繁殖，這也是瘧疾主要致病機理之一[9]。惡性瘧原蟲寄生蟲具有分布于14條染色體上的60個變異基因。var基因表達是極其規(guī)范的，只有一種PfEMP1產(chǎn)生并顯示在染蟲紅細胞的表面。在體外，寄生蟲以每個周期2%的速率切換var基因的表達，產(chǎn)生具有新抗原和粘性表型的新克隆[10]。Vir蛋白是pir多基因超家族的成員，也介導(dǎo)了間日瘧原蟲染蟲紅細胞對內(nèi)皮細胞的黏附，導(dǎo)致成熟染蟲紅細胞的聚集。有350個vir基因也是高度多態(tài)的[11]。Stevor和Rifin蛋白參與細胞黏附過程，也是高度多態(tài)的[12]。因此，確定這些多基因家族成員的作用對了解免疫逃避機制有重要作用[13]。

4 表位屏蔽

表位掩蔽是瘧原蟲非特異性抗體阻止特異性抑制性抗體與其表位反應(yīng)的能力。在抗體應(yīng)答建立過程中，IgM先于IgG產(chǎn)生，是單次或與補體組合的頭等體液應(yīng)答。瘧原蟲特異性IgM對子孢子和染蟲紅細胞的活性有抑制作用。然而，具有不同特異性的IgM也可以通過其Fc部分與染蟲紅細胞表面的PfEMP-1分子結(jié)合。結(jié)合PfEMP-1 VARCSA2的NpsIgM和妊娠子宮上皮細胞的受體硫酸軟骨素結(jié)合時，導(dǎo)致大量的染蟲紅細胞在子宮聚集，引起妊娠相關(guān)的瘧疾。這保護了染蟲紅細胞免受由IgG介導(dǎo)的吞噬作用。NpsIgM還結(jié)合MSP DBLMSP和DBLMSP2，并通過表位阻止IgG與這些分子的結(jié)合[14]。這兩種分子在裂殖子生物學(xué)中的作用尚不清楚，但非特異性IgM抗原決定簇掩蔽可能對保護寄生蟲免受特異性IgG抑制反應(yīng)有重要作用。

來自某些人類/靈長類瘧原蟲的子孢子感染可能導(dǎo)致復(fù)發(fā)。在開放的血液感染被免疫系統(tǒng)完全清除或通過藥物治療后，血液中瘧原蟲可能會再次出現(xiàn)并引發(fā)新的臨床攻擊。這些不分裂和代謝活躍的休眠子可長期持續(xù)存在于受感染宿主的肝臟中。來自感染的恒河猴肝臟的組織學(xué)分析沒有顯示任何針對源自這些子孢子或晚期裂殖體的細胞免疫應(yīng)答的跡象。這表明，休眠子不會引發(fā)任何免疫反應(yīng)，也不會導(dǎo)致含有瘧原蟲肽的MHC分子的表達。

在除紅細胞以外的其他細胞類型，例如血小板、巨噬細胞和DC中已經(jīng)觀察到含有裂殖子的囊泡。Wykes MN等人發(fā)現(xiàn)裂殖子也可以在表達CD317的DC中分裂，并最終引發(fā)新的感染。在嚙齒動物感染瘧疾期間，也中觀察到淋巴循環(huán)中有含子孢子的囊泡，稱為休眠子。這可以解釋感染的復(fù)發(fā)或潛伏期。然而，對于休眠子，這些囊泡可能沒有吞噬細胞攝取的識別信號，并且可能不表達其表面上的寄生蟲抗原。

5 與宿主蛋白質(zhì)同源性

參與宿主細胞侵襲的許多瘧原蟲抗原具有與參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的宿主蛋白強烈同源的區(qū)域。血小板反應(yīng)蛋白1型重復(fù)域和血管性血友病因子-類似A結(jié)構(gòu)域存在于CS蛋白，血栓反應(yīng)蛋白相關(guān)無名蛋白(TRA),CS蛋白TRAP相關(guān)蛋白子孢子表面蛋白改變血栓形成的分泌蛋白(TRAMP)和血小板反應(yīng)蛋白相關(guān)的頂端裂殖子蛋白中[15]。這些分子參與瘧原蟲發(fā)育的不同階段，子孢子和裂殖子運動，以及入侵蚊子中腸、唾液腺、肝細胞和紅細胞。許多裂殖子蛋白如MSP-1、MSP-4、MSP-5、MSP-8和MSP-10，PfRipr和有性繁殖階段蛋白，例如p25或p28，含有表皮生長因子結(jié)構(gòu)域。瘧原蟲蛋白與宿主蛋白有同源性，由于宿主對其本身的蛋白質(zhì)是耐受的，所以不會誘導(dǎo)這些同源區(qū)域中包含的表位產(chǎn)生抗體。用具有強佐劑的含有這些基團的免疫原免疫可能逃避免疫耐受，但可能具有誘導(dǎo)自身免疫的風(fēng)險。

6 免疫抑制

骨髓細胞是針對瘧原蟲的有效免疫應(yīng)答的必要介質(zhì)。單核細胞、巨噬細胞和中性粒細胞吞噬染蟲紅細胞，最終消滅瘧原蟲。單核細胞/巨噬細胞的吞噬可以通過PfEMP-1和CD36的相互作用介導(dǎo)，而不誘導(dǎo)或增加保護性促炎癥反應(yīng)。然而，在感染期間，攝入瘧疾色素或血紅素(血紅蛋白被寄生蟲消化的產(chǎn)物)后吞噬細胞功能可能會減少。色素負載的巨噬細胞不能吞噬更多的染蟲紅細胞，并且它們產(chǎn)生自由基氧中間體的能力也降低了。樹突狀細胞是誘導(dǎo)適應(yīng)性免疫應(yīng)答所必需的[16]。CD36和CD51(αv整聯(lián)蛋白鏈)通過表達PfEMP-1的寄生蟲參與DC損傷、DC成熟及其產(chǎn)生T細胞應(yīng)答的能力，導(dǎo)致促炎細胞因子如IL-12的產(chǎn)生減少，并增加免疫抑制細胞因子如IL-10的產(chǎn)生。

急性血液期感染引起單核細胞的強烈活化，這可能導(dǎo)致單核細胞、B細胞、T細胞和DCs的凋亡。急性感染也可導(dǎo)致胸腺細胞凋亡和消耗，從而減少新生幼稚T細胞的產(chǎn)量。另一方面，長期活化的T細胞(αβ和γδ)在持續(xù)的血液感染或多次再感染期間也可以進入無過敏階段[17]。瘧原蟲感染激活檢測點抑制劑分子在CD4+和CD8+T細胞中的表達，如程序細胞死亡蛋白1、程序死亡配體1(PD-L1)、PD-L2、淋巴細胞活化基因3和細胞毒性T淋巴細胞抗原-4。在嚙齒動物模型中，阻斷這些分子有助于清除血液瘧原蟲和建立T細胞記憶[18]。感染期間調(diào)節(jié)性T細胞通常會擴張，它們的主要作用是控制過度的促炎反應(yīng)，這取決于寄生蟲種類是有益還是有害的[19]?？傊?，導(dǎo)致免疫抑制的這些機制可能有利于瘧原蟲的存活并阻止宿主建立有效記憶應(yīng)答。此外，盡管預(yù)防免疫發(fā)病機制對宿主可能有益，但確保宿主存活對寄生蟲的存活有利[20]。

7 逃避補體系統(tǒng)

人體補體系統(tǒng)是防止病原體入侵的前線防御機制。人類和微生物在整個進化過程中已經(jīng)產(chǎn)生了微妙的共存分子機制，微生物通過這種機制來逃避補體攻擊[21]。不同病原體常見的逃避策略是將可溶性人補體調(diào)節(jié)劑劫持到其表面以保護補體的活化。當(dāng)惡性瘧原蟲以裂殖子形式暴露于人體血液時，F(xiàn)H及其選擇性剪接形式的FH樣蛋白1會迅速聚集。FH中的結(jié)合位點會識別裂殖子，并將Pf92確定為其直接相互作用的伴侶蛋白。當(dāng)與裂殖子結(jié)合后，F(xiàn)H保留輔因子活性，這是一個允許它下調(diào)補體的替代途徑的關(guān)鍵功能。在缺乏Pf92的惡性瘧原蟲中，C3b裂解模式的變化與補體激活的負調(diào)節(jié)一致。同時這些結(jié)果還表明，F(xiàn)H的聚集使惡性瘧原蟲裂殖子受到保護從而免于補體介導(dǎo)的裂解，這為研究瘧原蟲免疫逃避機制提供了新方向，并表明外殼蛋白在補體調(diào)節(jié)和宿主感染互作中的重要作用[22]。

8 瘧原蟲TatD-like DNase

研究發(fā)現(xiàn)中性粒細胞抵抗病原微生物的一種新機制，中性粒細胞特定類型的細胞死亡稱為NETosis，NETosis是產(chǎn)生中性粒細胞胞外陷阱網(wǎng)(NETs)的過程，由DNA、顆粒狀的抗菌肽、組蛋白和蛋白酶等組成，其中DNA是骨架結(jié)構(gòu)。NETs的結(jié)構(gòu)決定了它能捕獲并殺死細菌、真菌、原蟲、病毒等病原微生物的特性。因此，中性粒細胞產(chǎn)生的NETs是一種抗感染的重要的免疫反應(yīng)。除了抗微生物的功能，NETosis還參與了許多炎癥和自身免疫性疾病以及非傳染性疾病的調(diào)節(jié)。而病原微生物可以分泌一種DNase來降解宿主NETs結(jié)構(gòu)中的DNA骨架，破壞NETs對微生物的作用，來逃避宿主的先天性免疫清除作用。

不同種類的瘧原蟲都有編碼TatD-like DNase的基因序列，且該酶在各種瘧原蟲中都十分保守，說明該酶在蟲體的發(fā)育與繁殖中有重要作用，該蛋白的N端有一個信號肽序列，說明它可能能分泌到胞外發(fā)揮作用進一步研究發(fā)現(xiàn)，TatD-like DNase的表達情況與蟲株的致病力強弱有直接的關(guān)系，致病力強的蟲株的TatD-like DNase表達量明顯的高于致病力弱的蟲株，瘧原蟲TatD-like DNase缺失株能誘導(dǎo)宿主的中性粒細胞和巨噬細胞細胞產(chǎn)生大量的NETs，而野生株可以通過分泌TatD-like DNase到蟲體外，拮抗宿主的免疫反應(yīng)，研究還發(fā)現(xiàn)使用TatD-like DNase重組蛋白質(zhì)免疫的小鼠對瘧原蟲的抵抗力更強，因此TatD-like DNase是瘧疾疫苗的潛在候選抗原[23]。

9 展望

瘧疾疫苗的研究已經(jīng)經(jīng)歷了一段很艱難的路程，人工合成的許多保護性抗原已經(jīng)在人體實驗中取得部分保護作用[24]，但是瘧疾疫苗研究目前尚未取得突破性進展，其中一個重要的原因是瘧原蟲的免疫逃避機制[25]。免疫逃避削弱了瘧疾疫苗的作用，同時給疫苗的研制及使用帶來了困難。由于針對寄生蟲的新宿主免疫機制不斷被發(fā)現(xiàn)，寄生蟲新的免疫逃逸機制將被揭開，瘧疾疫苗的研制將更進一步深入。

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