益生菌微囊化技術(shù)研究進展

孫玉章，崔　栩，馬豐英，王宏華，蔣貽海

(國家動物用保健品工程技術(shù)研究中心/青島蔚藍(lán)生物股份有限公司，山東青島 266001)

益生菌是一類定植于宿主腸道或生殖系統(tǒng)內(nèi)，能通過改善宿主機體微生態(tài)平衡而產(chǎn)生確切有益功效的活性微生物的總稱[1]。目前發(fā)現(xiàn)的益生菌共有18個屬274個種，主要分為三大類，即乳酸菌類(如嗜酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌、屎腸球菌等)、芽胞桿菌類(如枯草芽胞桿菌、地衣芽胞桿菌等)和酵母菌類(如釀酒酵母等)。通過在飼料中添加適當(dāng)水平的益生菌制劑，能夠起到調(diào)節(jié)畜禽腸道菌群平衡、抑制腸道致病菌定殖、提高動物機體免疫力、改善機體營養(yǎng)狀況和提高畜禽的生產(chǎn)性能及抗病性等功能。

活菌數(shù)是評價益生菌產(chǎn)品質(zhì)量的一個重要指標(biāo)，一般認(rèn)為攝入的益生菌數(shù)量至少應(yīng)在106CFU/g～107CFU/g才能在宿主機體腸道中定殖并發(fā)揮其益生功能[2]。因此，如何提高活菌進入腸道的存活率，為益生菌提供有效的物理屏障保護以抵御宿主機體內(nèi)高胃酸和膽鹽等不利環(huán)境是十分必要的。益生菌的微囊化己被證明是提高益生菌在加工和貯存期間存活率和穩(wěn)定性最好的方法之一。本文僅就益生菌的微囊化技術(shù)的研究及應(yīng)用進展進行綜述。

1　微囊化技術(shù)

微囊化技術(shù)是指利用天然或合成的高分子材料作為壁材，將固體、液體或氣體等芯材包埋在生物相容性或可生物降解的聚合物基質(zhì)或殼體內(nèi)的一類技術(shù)[3]。作為可生物降解的微球微粒遞送系統(tǒng)的重要組成部分，微囊化技術(shù)可包裹芯材并形成直徑在1 μm～250 μm范圍內(nèi)的具有半透性或密封囊膜的微型顆粒，具有提高芯材穩(wěn)定性，減少不利或毒性作用等功能。

目前，微囊化技術(shù)已廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥化工、食品加工及農(nóng)業(yè)生物技術(shù)等領(lǐng)域。在醫(yī)藥化工領(lǐng)域，微囊化技術(shù)可將多種水溶性物質(zhì)如蛋白、酶、維生素、納米微粒及各種藥物自發(fā)包埋在微囊內(nèi)，并使包埋的物質(zhì)能夠以可控的速率釋放[4]。在食品加工領(lǐng)域，微囊化技術(shù)可顯著提高益生菌在加工過程中的存活數(shù)量，從而增強了酸乳及酸乳制品、果汁和風(fēng)味面包等的保健功能[5-7]；在農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，微囊化技術(shù)可用于生產(chǎn)獸用口服疫苗，刺激動物機體產(chǎn)生黏膜免疫應(yīng)答[8]。

在動物保健品行業(yè)中，益生菌的微囊化技術(shù)方興未艾。應(yīng)用該技術(shù)不僅可以提高益生菌本身的抗逆性，增強益生菌制劑對高溫、高壓或酸堿性等不良環(huán)境的抵抗能力，而且提高了益生菌制劑在后續(xù)加工、儲存和運輸過程中的存活率和穩(wěn)定性等[9]。

2　微囊的壁材選擇及包埋工藝

一般而言，益生菌微囊化技術(shù)所選擇的壁材材料應(yīng)與微生物細(xì)胞及其代謝產(chǎn)物具有良好的生物相容性或可比較容易的被生物降解。目前可供選擇的壁材材料按來源可分為天然高分子材料、半合成高分子材料和合成高分子材料等，其中明膠、阿拉伯膠、海藻酸鈉、殼聚糖、蛋白類和淀粉等天然高分子材料由于其性能穩(wěn)定、無毒、生物降解性和生物相容性好、成膜性或成球性優(yōu)良等特點，是益生菌微囊化技術(shù)中最常用的壁材。作為目前應(yīng)用最為普遍的微囊化壁材材料，海藻酸鈉是一種存在于褐藻細(xì)胞壁中的天然多糖，生物相容性高，易與陽離子形成凝膠，并且形成的離子型膠體具有在低pH環(huán)境下穩(wěn)定、在中性或微堿性環(huán)境中又能溶解的特性。由于海藻酸鈉膠體在高親和力離子或高濃度的非離子凝膠誘導(dǎo)劑存在的情況下會導(dǎo)致凝膠穩(wěn)定性下降，因此依據(jù)包裹芯材的生物特性的不同，常聯(lián)合應(yīng)用海藻酸鈉與殼聚糖、微孔淀粉、明膠或乳清蛋白等多種傳統(tǒng)天然高分子壁材材料的單一或多重復(fù)配。

目前，益生菌微囊化方法中應(yīng)用比較廣泛的是擠壓法和乳化法。擠壓法是先將益生菌與親水性膠體均勻混合形成細(xì)胞懸液，然后通過膜孔將細(xì)胞懸液壓入固定液中，從而使壁材析出硬化形成直徑約2 mm～5 mm的囊粒。擠壓法制備過程溫和，操作簡單、成本低廉，但囊徑較大，有可能會降低益生菌細(xì)胞的存活率和代謝率，而且規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)難度較大。乳化法制備海藻酸鈉微囊可分為外源乳化法和內(nèi)源乳化法。外源乳化法是指海藻酸鈉溶液與油相混合形成乳化液，通過加入CaCl2溶液，從海藻酸鈉外部引發(fā)凝膠化反應(yīng)，該方法在完全固化前會出現(xiàn)凝膠相互相聚集現(xiàn)象，導(dǎo)致微囊形態(tài)和流動性差，粒徑分布廣[10]。內(nèi)源乳化法是指將海藻酸鈉溶液和不溶性鈣鹽顆粒(如CaCO3等)分散到油相中形成油包水(W/O)型乳狀液，再加入冰醋酸使海藻酸鈉溶液的pH降低，從而引發(fā)不溶性鈣鹽中Ca2+的釋放，自液滴內(nèi)部形成凝膠微球。研究證明，內(nèi)源乳化法制備的嗜酸乳桿菌微囊的菌體包封率更高，粒徑分布范圍更窄，微囊表面更光滑，呈球性更佳。內(nèi)源乳化法采用難溶性鈣鹽作為鈣源，克服了外源乳化法中CaCl2溶液加入引起的微囊成簇凝聚現(xiàn)象，更易控制微囊粒徑，且粒徑比較均一，比較可能發(fā)展為規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)技術(shù)。內(nèi)源乳化法在包埋蛋白、酶、多肽類藥物的控制釋放和微生物細(xì)胞的固化方面極具優(yōu)勢。

3　益生菌微囊化技術(shù)的應(yīng)用

3.1　微囊化技術(shù)提高益生菌抗逆性的研究

益生菌微囊化技術(shù)要解決的核心問題是提高益生菌的抗逆性。如何確保一定數(shù)量的活菌能夠進入宿主腸道，并且能夠抵御宿主機體內(nèi)高胃酸和膽鹽等不利環(huán)境，對于益生菌發(fā)揮健康功效是十分必要的。國內(nèi)外已有眾多學(xué)者在利用微囊化技術(shù)提高益生菌的抗逆性方面做了大量研究工作[11]。

楊凱舟等[12]利用海藻酸鈉、乳清蛋白和維生素E(分別為20 g/kg、30 g/kg和100 g/kg)為壁材制備的長雙歧桿菌微囊在酸奶中保存21 d仍能保持106CFU/g以上的活菌數(shù)，耐胃酸試驗2.0 h時活菌數(shù)仍高達3.16×107CFU/g，較好地解決了長雙歧桿菌不耐酸、不耐氧的缺點。張琳等[13]利用乳化凝膠法制備的布拉迪酵母菌和糞腸球菌微囊顯著提高了益生菌對儲存、高溫、胃液和腸液等體內(nèi)和體外不良環(huán)境的抗性，同時腸內(nèi)緩釋試驗證實，50 min時布拉迪酵母菌和糞腸球菌微囊的釋放率分別可達71.74%和87.47%。Zhou H B等[14]以海藻酸鈉為初層包埋材料，分別以海藻糖、殼聚糖為二層、三層包埋材料獲得的嗜熱乳酸鏈球菌微囊化制品在冷凍干燥后的活菌計數(shù)為8.34lg CFU/g±0.30lg CFU/g，在模擬胃液中處理2.0 h后的存活數(shù)為6.45lg CFU/g±0.09lg CFU/g，長期儲存穩(wěn)定性實驗證明其多層包埋處理的益生菌微囊化制品具有極佳的穩(wěn)定性和耐酸性。

3.2　益生菌微囊化技術(shù)應(yīng)用于動物保健品的研究

微囊化技術(shù)顯著提升了益生菌的抗逆性，為益生菌制劑在動物保健品等工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。Rishi P等[15]研究發(fā)現(xiàn)，利用微囊化的植物乳桿菌益生元復(fù)合制劑飼喂酒精性肝病的大鼠模型，能夠顯著調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)的酒精、內(nèi)毒素和轉(zhuǎn)氨酶水平，并在一定程度上修復(fù)受損的肝組織結(jié)構(gòu)。張慧等[16]證實，在飼糧中添加0.5 kg/1 000 kg的益生菌微囊化制品能顯著提高育肥豬的平均日增重、降低料重比并顯著降低腸道內(nèi)的大腸埃希菌含量，對育肥豬的生長有促進作用。魏衎等[17]利用微囊化的雞源乳酸乳球菌全程飼喂肉仔雞，42日齡時的肉仔雞與對照組相比，平均日增重提高了16.94%，料重比降低了16.13%，胸腺相對重量提高了46.56%，法氏囊相對重量提高了16.67%，極大提升了肉仔雞的生長性能。胡銳等[18]采用噴霧干燥工藝制備的中藥復(fù)合益生元微囊制劑能夠極顯著提高斜帶石斑魚機體的免疫活性細(xì)胞吞噬率、超氧化物歧化酶活性和溶菌酶活性，顯著提高了斜帶石斑魚的存活率和抗病性。

當(dāng)前飼用抗生素仍然是我國畜禽養(yǎng)殖業(yè)中用于抑制病原微生物增殖和促進畜禽生長的主要飼料添加劑之一，隨著我國養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化、產(chǎn)業(yè)化程度的提高，以及畜禽肉制品國際化、標(biāo)準(zhǔn)化的要求，限制甚至禁止抗生素的使用是將來集約化畜禽養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的必然趨勢。益生菌作為一種微生態(tài)制劑和潛在的抗生素替代品，具有調(diào)節(jié)腸道菌群平衡，預(yù)防病原微生物感染和提高飼料利用率等優(yōu)點，并且不存在抗生素耐藥性和藥物殘留的問題，因此益生菌制劑在動物保健品等領(lǐng)域的應(yīng)用越來越受到重視。雖然目前受限于益生菌特性和制劑工藝流程，益生菌制劑應(yīng)用于規(guī)?；笄蒺B(yǎng)殖場的實例還不多[19-20]，而微囊化技術(shù)正是推動益生菌制劑作為抗生素替代品和動物保健品廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖業(yè)的重要助推器之一。

3.3 益生菌微囊化技術(shù)應(yīng)用于黏膜免疫疫苗的研究

黏膜免疫系統(tǒng)是指機體與外界相通的腔道黏膜表面的免疫系統(tǒng)，主要由消化道、呼吸道、泌尿生殖道黏膜及某些外分泌腺(如唾液腺、淚腺及乳腺等)黏膜相關(guān)的淋巴組織組成[21]。研究證實，哺乳動物的胃腸道黏膜上皮及固有層內(nèi)含有大量免疫細(xì)胞及免疫分子，能夠通過分泌型IgA和IgM阻止病原微生物在黏膜上皮層的黏附和定殖。益生菌是誘導(dǎo)黏膜免疫極好的免疫佐劑和疫苗載體。

Eratte D等[22]研究證實，微囊化技術(shù)可以顯著提高干酪乳桿菌黏附在腸壁絨毛上的存活能力，因此可以作為不影響其功能特性的腸道黏膜微粒遞送系統(tǒng)。Poorbaghi S L等[23]研究證實，利用微囊化的嗜酸乳桿菌作為免疫佐劑，能夠有效地調(diào)節(jié)H9N2亞型禽流感滅活疫苗刺激體液免疫產(chǎn)生的抗體滴度，而且與攻毒后對照組相比，嗜酸乳桿菌微囊組極顯著地降低了雞體腸道內(nèi)的病毒載量。Jiang T等[24]以海藻酸鈉和殼聚糖為壁材多層包埋表達M細(xì)胞歸巢肽與BmpB抗原肽融合蛋白的重組植物乳桿菌，在模擬胃液和模擬小腸液試驗中的2.0 h存活率高達65%，首次通過口服免疫小鼠4周后，在血清和糞便樣品中分別檢測到了特異性IgG和IgA的高水平表達，表明益生菌的微囊化技術(shù)有助于研究和開發(fā)新型黏膜免疫的疫苗載體和遞送系統(tǒng)。

4　展望

微囊化技術(shù)作為21世紀(jì)重點研究和開發(fā)的高新技術(shù)之一，已經(jīng)在醫(yī)藥化工、食品加工和農(nóng)業(yè)生物技術(shù)等多個領(lǐng)域取得了重要進展。但就益生菌的微囊化技術(shù)而言，目前國內(nèi)的研究主要還是局限于益生菌用于食品加工和飼料添加劑的微囊化包埋工藝條件的優(yōu)化上，對于包埋后益生菌與微囊壁材的相互作用機理等上游基礎(chǔ)研究和規(guī)?；S生產(chǎn)等下游應(yīng)用推廣的實例均較匱乏。

隨著現(xiàn)代免疫學(xué)、分子生物學(xué)和疫苗學(xué)的發(fā)展，黏膜免疫和口服疫苗得到了越來越多學(xué)者的關(guān)注。然而，由于缺少能夠有效遞送抗原到達黏膜免疫誘導(dǎo)位點的載體，多年來口服疫苗的發(fā)展一直很緩慢。作為被動黏膜免疫遞送系統(tǒng)的重要組成部分，基于革蘭陽性菌增強基質(zhì)(Gram-positive bacterial enhancer matrix，GEM)建立的新型益生菌表面展示系統(tǒng),已經(jīng)在動物體內(nèi)外試驗中展示出良好的應(yīng)用潛力[25]，不僅可以作為天然的免疫佐劑激活機體的先天性免疫，還能刺激免疫細(xì)胞產(chǎn)生特異性抗體和Th1/Th2型平衡的免疫應(yīng)答。微囊化技術(shù)的發(fā)展為黏膜免疫口服疫苗的研究和開發(fā)開辟了新的途徑，利用生物可降解的高分子壁材包埋GEM顆粒，理論上可以持續(xù)傳遞抗原至消化道黏膜、包被抗原不受胃酸和消化酶的影響，而且可以作為新型黏膜免疫佐劑和遞送抗原載體，其應(yīng)用前景廣闊。