羊源肺炎克雷伯氏菌的分離與鑒定

謝宇舟，吳翠蘭，李 軍，陶 立，李常挺，彭 昊，馬春霞，潘 艷

（廣西獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西南寧530001）

克雷伯氏菌屬為腸桿菌科的成員，有肺炎克雷伯氏菌、產(chǎn)酸克雷伯氏菌、植生克雷伯氏菌和土生克雷伯氏菌這4個(gè)種[1]。肺炎克雷伯氏菌（Klebsiella pneumoniae）是一種條件性致病菌，可引起肺炎、子宮炎、腹瀉等疾病[2]。隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷增大，由肺炎克雷伯氏菌引起的疾病致死率較高，它不僅給養(yǎng)殖行業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也嚴(yán)重危害人類的健康。

2017年8月，我們對死亡黑山羊的檢測中分離到1株肺炎克雷伯氏菌，現(xiàn)將病原菌的主要特征報(bào)告如下。

1　材料與方法

1.1　病料

采集自廣西某山羊場病死羊的肺臟。

1.2　細(xì)菌分離

取病死羊的肺臟在無菌操作工作臺(tái)接種于麥康凱平板上，放置在37℃恒溫箱培養(yǎng)24h后觀察細(xì)菌生長情況。然后挑取單個(gè)菌落進(jìn)行革蘭氏染色、鏡檢和肉湯培養(yǎng)。

1.3　細(xì)菌生化試驗(yàn)

將分離到的細(xì)菌接種于微量生化反應(yīng)管，放置在37℃恒溫箱培養(yǎng)24 h后觀察細(xì)菌生長特性，在《臨床常見細(xì)菌、真菌鑒定手冊》[3]進(jìn)行比對。

1.4　細(xì)菌16S rRNA基因測序和分析

采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取細(xì)菌的DNA，應(yīng)用16S rRNA細(xì)菌鑒定引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳、回收、克隆、測序。并對測序結(jié)果進(jìn)行分析。

1.5　細(xì)菌致病性試驗(yàn)

取12只健康小白鼠均分為兩組，每組各6只，分別為試驗(yàn)組和對照組。試驗(yàn)組小鼠的攻毒劑量為0.3mL/只（濃度為2×108 CFU/mL），對照組則注射等量的生理鹽水。然后繼續(xù)培養(yǎng)，觀察小鼠的身體狀況。

1.6　藥敏試驗(yàn)

采用紙片瓊脂擴(kuò)散的方法進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，藥敏紙片購自杭州濱和微生物試劑有限公司，按照該公司試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行操作，然后放置在37℃恒溫箱培養(yǎng)12～24h后，觀察抑菌圈情況。

2　結(jié)果

2.1　細(xì)菌分離和鑒定

將肺組織劃線接種于麥康凱平板上，置于37℃培養(yǎng)24h后，菌生長良好，菌落顏色為紅色。菌落有點(diǎn)黏稠，挑取單個(gè)菌落時(shí)具有拉絲現(xiàn)象，經(jīng)鏡檢為革蘭氏陰性、短桿菌。

2.2　細(xì)菌生化鑒定

分離株的生化特性結(jié)果V-P試驗(yàn)、枸櫞酸鹽、葡萄糖、乳糖、尿素酶試驗(yàn)均為陽性；吲哚、甲基紅和明膠水解試驗(yàn)為陰性（表1）。該生化特性結(jié)果與《臨床常見細(xì)菌、真菌鑒定手冊》的克雷伯氏菌屬肺炎克雷伯氏菌的生化特性相符合。

表1　藥敏試驗(yàn)結(jié)果

2.3　分離菌16S rRNA擴(kuò)增和測序分析

該分離株經(jīng)PCR擴(kuò)增、電泳，得到了相應(yīng)的目的片段（圖1）。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行測序。用生物學(xué)軟件對該分離株的測序結(jié)果進(jìn)行分析，得到了長為1438 bp的片段，命名為GXSL。

圖1　分離株16S rRNA擴(kuò)增電泳圖

用MegAlign對9株肺炎克雷伯氏菌參考株和GXSL分離株進(jìn)行核苷酸同源性比較，結(jié)果GXSL與肺炎克雷伯氏菌的同源性在97.1%以上（圖2）。

用MEGA7用MegAlign對9株肺炎克雷伯氏菌參考株和GXSL分離株進(jìn)行核苷酸進(jìn)化樹分析，該分離株與肺炎克雷伯氏菌在同一分支上（圖3）。

以上分析結(jié)果表明，獲得的GXSL分離株為肺炎克雷伯氏菌。

2.4　分離菌的致病性試驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)組接種分離菌5h后開始表現(xiàn)為精神沉郁、不好動(dòng)，24h內(nèi)小鼠死亡4只，在48h內(nèi)6只小鼠全部死亡，死亡率為100%，而對照組小鼠表現(xiàn)正常。將死亡小鼠進(jìn)行解剖發(fā)現(xiàn)心和肺嚴(yán)重出血，肝有壞死點(diǎn)。將小鼠病變組織在麥康凱平板進(jìn)行劃線、培養(yǎng)，回收到與接種菌一樣的細(xì)菌。

圖2　氨基酸同源性比較

圖3　核苷酸進(jìn)化樹

2.5　藥敏試驗(yàn)

藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示該菌對頭孢噻肟、阿米卡星、頭孢曲松和鏈霉敏感，對強(qiáng)力霉素、慶大霉素、青霉素G、氧氟沙星、蒽諾沙星、卡那霉素、復(fù)方新諾明、諾氟沙星、阿奇霉素、多粘菌素B、利福平和環(huán)丙沙星這12種藥物耐藥（表2）。

表2　藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3　分析討論

近年來，肺炎克雷伯氏菌已成為危害人類和動(dòng)物的重要條件致病性菌之一[4]。肺炎克雷伯氏菌首先是從病人的大葉性肺炎中分離到的；在動(dòng)物界中，滕濤等[4]從團(tuán)頭魴的潰瘍處和肝脾病灶部位、彭智偉等[5]從水貂肝臟病變組織、王孝友等[6]從兔的肺肝等病變組織、賀番等[7]從奶牛乳房炎中分離到肺炎克雷伯氏菌，這些研究表明，由肺炎克雷伯氏菌感染的動(dòng)物逐漸增多，該病原已成為備受關(guān)注的人獸共患病病原。

本研究從病死羊的肺臟中分離到1株革蘭氏陰性短桿菌。生化試驗(yàn)鑒定結(jié)果V-P試驗(yàn)、枸櫞酸鹽、葡萄糖、乳糖、尿素酶試驗(yàn)均為陽性；吲哚、甲基紅和明膠水解試驗(yàn)為陰性。該菌的形態(tài)特征和生理生化特性均與肺炎克雷伯氏菌相符合，初步判定為肺炎克雷伯氏菌。

由于16S rRNA基因具有細(xì)菌屬、種的特征，現(xiàn)已被用來作為細(xì)菌鑒型的依據(jù)[1]。本研究對分離株GXSL和9株肺炎克雷伯氏菌參考株基于16S rRNA基因的核苷酸同源性比較和核苷酸進(jìn)化樹分析，結(jié)果表明分離株GXSL與肺炎克雷伯氏菌的同源性在97.1%以上；核苷酸進(jìn)化樹分析顯示，該分離株與肺炎克雷伯氏菌在同一分支上，這更進(jìn)一步說明該分離株為肺炎克雷伯氏菌。由此可見，對于細(xì)菌的分離鑒定我們需要借助于傳統(tǒng)的分離鑒定方法和新型的分子生物學(xué)方法相結(jié)合，所得的結(jié)果更加可靠。

肺炎克雷伯氏菌是致病性強(qiáng)的病原菌，陳興生等[8]從死牛體內(nèi)分離到毒力較強(qiáng)的肺炎克雷伯氏菌；馮娜等[9]報(bào)道接種肺炎克雷伯氏菌的小鼠在24h全部死亡。而本研究在致病性試驗(yàn)中，該分離株也使小白鼠100%致死，并使小白鼠出現(xiàn)心和肺嚴(yán)重出血、肝有壞死點(diǎn)等癥狀，說明本試驗(yàn)分離株GXSL的致病性也很強(qiáng)。由于肺炎克雷伯氏菌致病相關(guān)毒力因子比較多，因此，其毒力基因的確定還要待進(jìn)一步的研究。

本試驗(yàn)還對該菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)，分離出4種較敏感的藥物：頭孢噻肟、阿米卡星、頭孢曲松和鏈霉敏感，其余對強(qiáng)力霉素等12種藥物耐藥，這試驗(yàn)結(jié)果與馮娜等[9]的報(bào)道結(jié)果基本一致。這種耐藥性的產(chǎn)生可能由于各種抗菌藥物的廣泛使用，加之，肺炎克雷伯氏菌可以產(chǎn)生各種使抗生素失活的酶，從而導(dǎo)致耐藥性的普遍存在[10]。

本研究通過微生物學(xué)手段和分子生物學(xué)技術(shù)從病死羊的肺臟中分離鑒定出1株肺炎克雷伯氏菌，并成功篩選了幾種較敏感性藥物，為治療和預(yù)防該菌對羊的危害提供可靠的數(shù)據(jù)。

[1]房海，陳翠珍，張曉軍，等.羊肺炎克雷伯氏菌感染癥及病原菌檢測與系統(tǒng)發(fā)育分析[J].中國人獸共患病雜志，2005,21(10)：895-899.

[2]周玉龍，李國軍，李陽，等.奶牛肺炎克雷伯氏菌的分離與鑒定[J].中國奶牛，2007,(6)：36-38.

[3]陳瑜.臨床常見細(xì)菌、真菌鑒定手冊[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2009：68-69.

[4]滕濤，梁利國，謝駿，等.團(tuán)頭魴源肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定[J].水生態(tài)學(xué)雜志，2016,37(6)：95-99.

[5]彭智偉，張長生，梁宇翔，等.水貂肝臟中肺炎克雷伯氏菌的鑒定[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，2016(01)：148-149.

[6]王孝友，王永康，楊睿，等.兔肺炎克雷伯氏菌的分離與鑒定[J].中國養(yǎng)兔，2011,4：10-18.

[7]賀番，賀瑜，孟寧生，等.奶牛乳房炎克雷伯氏菌的分離鑒定[J].畜牧獸醫(yī)柯基信息，2015,11：19-21.

[8]陳興生，葉育桐.牛肺炎克雷伯氏菌的分離和鑒定[J].中國獸醫(yī)雜志，1997,23(3)：13.

[9]馮娜，高翔，肖敏，等.牛源肺炎克雷伯氏菌的分離鑒定及遺傳進(jìn)化樹分析[J].中國獸醫(yī)科學(xué)，2016,46(11)：1358-1364.

[10]王召朋，柴同杰，牟特，等.青島地區(qū)兔肺炎克雷伯氏菌分離鑒定[J].山東畜牧獸醫(yī)，2012,33(5)：16-18.