水貂阿留申病膠體金免疫層析試紙條與對流免疫電泳對比試驗(yàn)

劉 潔，李 偉，任二軍，劉進(jìn)軍，韓學(xué)良

（石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院，河北石家莊050041）

水貂阿留申病(Aleutian disease of mink，AD)又稱漿細(xì)胞增多癥，是由細(xì)小病毒科的水貂阿留申病毒(Aleutian mink disease virus，ADV)引起水貂的一種慢性、消耗性、免疫抑制性傳染病。成年水貂病理變化及臨床癥狀為高免疫球蛋白血癥、動(dòng)脈炎及腎小球腎炎，水貂皮張質(zhì)量及繁殖能力下降，容易繼發(fā)其他疾病，幼貂常發(fā)生急性間質(zhì)性肺炎甚至死亡[1]。目前沒有有效的疫苗預(yù)防，也無特效藥治療，所以對貂群進(jìn)行快速高效靈敏的檢測從而消除AD抗體陽性水貂就成了控制該病最有效的方法。目前國內(nèi)外研究出診斷AD檢測方法主要有碘凝集實(shí)驗(yàn)、對流免疫電泳（Counter Immunoelectrophoresis,CEP）、基因芯片法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)法、膠體金免疫層析試紙條(gold immunochromatography assay,GICA)、熒光定量PCR法等。本試驗(yàn)利用GICA和CEP兩種方法對河北某貂場隨機(jī)采取的血清樣本進(jìn)行檢測，并對二者的符合情況及檢測成本進(jìn)行比較。

1　材料

1.1　試驗(yàn)動(dòng)物

隨機(jī)選取河北某貂場籠養(yǎng)水貂192只。

1.2　儀器

電泳槽及電泳儀（北京六一廠）、微波爐、電子天平、移液器（eppendorf），打孔器、砂輪、注射器針頭、玻璃板（10cm×10cm×1mm）、100ml錐形瓶、肝素鈉抗凝毛細(xì)采血管(20ul)、毛細(xì)管盒、工業(yè)橡皮泥、剪指刀。

1.3　試劑

CEP診斷抗原和陽性血清來自丹麥進(jìn)口分裝；電泳緩沖液（Tris base 2.408g，巴比妥鈉 4.064g，巴比妥 1.024g，溶于 500mL蒸餾水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至8.4-8.6）；1.0%瓊脂糖凝膠；ADV抗體膠體金快速檢測試紙條（貨號：9903）由北京納百景奕（NBGen）生物科技有限公司提供。

2　方法

2.1　血樣采集

一人保定水貂，一人用剪指刀剪掉水貂趾甲，用毛細(xì)采血管采血，虹吸至2/3處，用工業(yè)橡皮泥封口，放入毛細(xì)管盒，并做好標(biāo)記。常溫或4℃冰箱過夜放置自然分離血清。

2.2　試紙條檢測

2.2.1　樣品準(zhǔn)備

將采血梳用記號筆編號，寫清籠舍號，采血后，按標(biāo)記順序粘貼在標(biāo)記好的采血梳粘性凹槽內(nèi)，并對齊下沿，以便后期操作。

2.2.2　操作步驟

根據(jù)待檢樣本數(shù)量，取出足量的反應(yīng)微孔，將其放置于微孔架上備用；用滴管向微孔中加入標(biāo)記刻度量的ADV快速檢測稀釋液 （約100ul），將下端對齊的采血梳按標(biāo)記順序插入反應(yīng)微孔，可稍微晃動(dòng)，以保證血樣充分溶解；浸泡兩分鐘后，取出采血梳；插入待檢試紙條，計(jì)時(shí)5min；用剪刀剪掉吸水端，終止反應(yīng)。

2.2.3　結(jié)果判定

質(zhì)控線（C線）顯色，檢測線（T線）不顯色，結(jié)果為陰性；質(zhì)控線（C線）顯色，檢測線（T線）也顯色，結(jié)果為陽性。

2.3　對流免疫電泳檢測

實(shí)驗(yàn)方法步驟及結(jié)果判定參考本課題組之前發(fā)表文章[2]。

3　結(jié)果

CEP和GICA兩種檢測方法的陽性檢出率見表1，符合率見表2。從表1可以看出，GICA的檢出率為57.81%，CEP檢出率為56.25%，GICA的檢出率比CEP高1.56%。從表2可以看出，CEP陽性的GICA檢測全部為陽性，CEP陰性、GICA陽性的為3只，不符合的數(shù)量為3只，GICA和CEP檢出都為陽性的108只，都為陰性的81只，符合數(shù)是189只，符合率是98.44%。

表1　對流免疫電泳與試紙條的陽性檢出率

表2　對流免疫電泳與試紙條的符合率

4　討論

1972-1974年Cho等在加拿大首次應(yīng)用CEP診斷AD，該方法原理是利用ADV抗體（被檢水貂血清）和抗原（臟器或細(xì)胞抗原）在電場作用下進(jìn)行反應(yīng)，抗原由陰極向陽極移動(dòng)，而抗體則由陽極向陰極運(yùn)動(dòng)，二者在兩孔之間接觸，在瓊脂凝膠中形成肉眼可見的灰白色沉淀線[3]。CEP法重復(fù)性好，與病理剖檢結(jié)果的符合率達(dá)到100%；特異性強(qiáng)，達(dá)到97%；特異性高則敏感性低，敏感性僅75%，因此當(dāng)水貂在感染ADV初期或轉(zhuǎn)歸期時(shí)由于抗體水平較低則可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果，這也是每年在11月份左右只檢疫1次而不能檢測出所有陽性水貂的重要原因[4]。在AD的各種診斷方法中，CEP是世界公認(rèn)的并且應(yīng)用最為廣泛的。但該法仍存在一些弊端，結(jié)果判定的誤差較大，抗原多是細(xì)胞抗原或臟器抗原等全病毒抗原，存在著散毒的危險(xiǎn)，耗時(shí)較長，需要特殊儀器設(shè)備和較高的技術(shù)支持，不適合于現(xiàn)場診斷。GICA是以硝酸纖維素膜為固相載體，通過毛細(xì)管作用原理，以膠體金為標(biāo)記物來顯示結(jié)果的一種新型的檢測技術(shù)[5]。該方法操作簡便、快捷，一般只要5～10min便可得到檢測結(jié)果，且需要血量少，只需一滴血即可，減少了感染的機(jī)會(huì)。結(jié)果清楚、易于判斷、誤差小，不需要任何儀器、成本低廉，對操作人員技術(shù)要求不高，不受外界環(huán)境的影響等，非常適用于現(xiàn)場及自動(dòng)化檢測，缺點(diǎn)是由于采血后需要按標(biāo)記順序?qū)⒉裳堈迟N在標(biāo)記好的采血梳凹槽內(nèi)，且檢測試劑試紙條取出后應(yīng)盡快使用，必須同時(shí)采血同時(shí)檢測，增加現(xiàn)場工作勞動(dòng)量。

本研究共檢測水貂血清樣品192個(gè)，采用GICA和CEP進(jìn)行檢測，結(jié)果GICA的陽性檢出率為57.81%，CEP檢出率為56.25%，二者符合率是98.44%。CEP檢測陽性的GICA檢測全部為陽性，CEP陰性、GICA陽性的為3只，不符合的數(shù)量為3只，而在檢測中發(fā)現(xiàn)不符合的這3份血清T線顯色條帶相對較淺，推測可能是由于血清中AD抗體含量較低，而GICA敏感性比CEP相對較高，造成CEP未檢出。徐磊等用PBS對AD陽性血清進(jìn)行倍比稀釋，用GICA分別進(jìn)行檢測，結(jié)果當(dāng)血清稀釋倍數(shù)至8倍時(shí)，仍能用GICA檢測出，而傳統(tǒng)的CEP法在血清稀釋到4倍就不能檢出，推測GICA的敏感性是CEP的至少2倍。他們同時(shí)用GICA和CEP分別檢測了45只水貂，結(jié)果GICA陽性率為71.1%，CEP陽性率為62.2%，說明GICA法檢出率較高，敏感性較好[6]。在檢測成本方面，CEP法1只份抗原成本為2.00元，加上凝膠、緩沖液、陽性血清等每只的檢測成本至少為2.50元，而GICA一只份成本也在2.50元左右，成本相當(dāng)。

5　結(jié)論

膠體金免疫層析試紙條檢測阿留申病有快速、簡單、敏感性高、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，檢測成本和對流免疫相當(dāng)，還可進(jìn)行現(xiàn)場檢測，可以代替對流免疫電泳檢測方法。

[1]閆喜軍,肖家美,籍玉林.我國水貂阿留申病流行現(xiàn)狀、特點(diǎn)及防治技術(shù)[J].特種經(jīng)濟(jì)動(dòng)植物,2004,(05)：44.

[2]任二軍,劉潔,劉進(jìn)軍,等.水貂阿留申病碘凝集與對流免疫電泳檢測方法比較[J].經(jīng)濟(jì)動(dòng)物學(xué)報(bào),2017,(3)：134-136.

[3]Cho Hj Fau-Ingram D G,Ingram D G.Antigen and antibody in Aleutian disease in mink.II.The reaction of antibody with the Aleutian disease agent using immunodiffusion and immunoelectroosmophoresis[J].(0008-4050(Print)).

[4]于凱,倪佳,馮二凱,等.水貂阿留申病診斷抗原研究概述[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2017,(4)：116-119.

[5]莊金秋,梅建國,沈志強(qiáng).膠體金免疫層析技術(shù)在獸醫(yī)臨床診斷中的應(yīng)用進(jìn)展[J].中國動(dòng)物檢疫,2012,(9)：70-75.

[6]徐磊.水貂阿留申膠體金免疫層析診斷方法的初步建立[D].City：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院,2010.