動物細胞規(guī)模化培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)狀

楚品品，蔣智勇，勾紅潮，宋 帥，李 淼，李 艷，李春玲，蔡汝健

(廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動物衛(wèi)生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640)

隨著重組DNA技術(shù)在20世紀(jì)70年代的出現(xiàn)，使得生產(chǎn)特定基因編碼的蛋白質(zhì)成為可能。細菌和酵母細胞的相關(guān)技術(shù)較成熟，并且生長容易，成為了早期生產(chǎn)重組蛋白的主要載體。但是對于生產(chǎn)復(fù)雜的蛋白及需要翻譯后再修飾的蛋白而言，這些生產(chǎn)系統(tǒng)便顯示出了其固有的局限性，而動物細胞培養(yǎng)技術(shù)的應(yīng)用及規(guī)?；囵B(yǎng)的出現(xiàn)很好地彌補了這一缺陷。

動物細胞培養(yǎng)最早可追溯到1885年，離體的雞胚組織于溫生理鹽水中可存活數(shù)天。真正成為一項技術(shù)被廣泛應(yīng)用始于1907年，美國生物學(xué)家Harrison R G[1]成功在試管中培養(yǎng)蛙胚神經(jīng)組織數(shù)周并觀察到細胞突起的生長過程[2]。最初對于動物細胞的培養(yǎng)是為了研究細胞的代謝和生長，隨后發(fā)現(xiàn)其有更廣泛的應(yīng)用，之后細胞培養(yǎng)技術(shù)不斷成熟，被用于生物學(xué)和醫(yī)學(xué)等各個領(lǐng)域。經(jīng)過一個多世紀(jì)的探索與發(fā)展，細胞培養(yǎng)技術(shù)從實驗室走向工業(yè)化生產(chǎn)。隨著基于細胞培養(yǎng)技術(shù)的蛋白質(zhì)醫(yī)藥和疫苗等生物制品成為生物醫(yī)藥的主導(dǎo)以及需求量和質(zhì)量的不斷提高[3-4]，多種動物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)技術(shù)應(yīng)運而生并不斷發(fā)展，倍受科研機構(gòu)和高新技術(shù)企業(yè)的關(guān)注，顯示出了極好的工業(yè)發(fā)展前景[5]。

1 哺乳動物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)方式

按細胞在體外培養(yǎng)時的生長特性將哺乳動物細胞分為貼壁生長型細胞和懸浮生長型細胞，前者體外培養(yǎng)時只有附著于特定的物質(zhì)表面才得以生長繁殖，而后者在體外培養(yǎng)時不需要任何附著物，懸浮狀態(tài)下即可完成整個生長繁殖過程。為了達到生產(chǎn)要求，需要擴大細胞培養(yǎng)的體積及提高細胞培養(yǎng)密度，規(guī)?；毎囵B(yǎng)技術(shù)主要是在pH、溫度、培養(yǎng)基成分等條件可控下，運用生產(chǎn)設(shè)備培養(yǎng)細胞使之達到較高密度用于生產(chǎn)相應(yīng)生物制品的技術(shù)，主要培養(yǎng)方式有貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)。

1.1 貼壁培養(yǎng)

規(guī)模化貼壁培養(yǎng)的經(jīng)典方法是轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)是將貼壁細胞置于經(jīng)過表面處理的轉(zhuǎn)瓶內(nèi)，同時注入一定量培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)瓶以一定轉(zhuǎn)速旋轉(zhuǎn)，細胞交替接觸空氣和培養(yǎng)液，以維持細胞的生長繁殖。最早由Wells R P[6]于1870年申請了轉(zhuǎn)瓶的相關(guān)專利，以圓形培養(yǎng)瓶置于轉(zhuǎn)軸上旋轉(zhuǎn)，從而加大細胞的貼壁面積，對細胞進行規(guī)?；囵B(yǎng)。此后，研究者們以最大限度的增大轉(zhuǎn)瓶的內(nèi)表面積為目的設(shè)計了多種內(nèi)部結(jié)構(gòu)，以進一步提高細胞量。如1976年到1991年間，分別提出了在轉(zhuǎn)瓶中加入塑料卷軸、中空環(huán)形小室、泡沫型多孔填充物及波浪形內(nèi)壁等設(shè)計，此外于1999年和2004年打破以往的圓形轉(zhuǎn)瓶的設(shè)計，出現(xiàn)了多角形轉(zhuǎn)瓶和螺旋形轉(zhuǎn)瓶，這些設(shè)計都在一定程度上增大了細胞密度，提高了產(chǎn)量。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)作為傳統(tǒng)的規(guī)?；N壁培養(yǎng)方式，結(jié)構(gòu)及操作相對簡單，耗資少，只需簡單增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)目即可實現(xiàn)擴大培養(yǎng)，產(chǎn)品收獲方便。早期應(yīng)用廣泛，為基于細胞培養(yǎng)生產(chǎn)的藥物及疫苗做出了貢獻。但由于其所需勞動強度較大，培養(yǎng)參數(shù)無法檢控，難以實現(xiàn)均一化，使得批間差異較大，有限的貼附面積限制了產(chǎn)量的進一步提高等原因，以及懸浮培養(yǎng)及固定化技術(shù)的出現(xiàn)和不斷成熟，使得轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)技術(shù)逐漸被淘汰?！吨腥A人民共和國農(nóng)業(yè)部公告》第1708號中明確規(guī)定，自2012年2月1日起，各省級獸醫(yī)行政管理部門停止對轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)生產(chǎn)方式的獸用細胞苗生產(chǎn)線項目的獸藥GMP驗收申請[7]。

1.2 懸浮培養(yǎng)

規(guī)?；瘧腋∨囵B(yǎng)方式類似于微生物發(fā)酵，即細胞在生物反應(yīng)器中隨著培養(yǎng)液的運動而處于分散懸浮的狀態(tài)進行生長繁殖，達到較高的密度，進而用于生產(chǎn)各種產(chǎn)品。懸浮培養(yǎng)可分為全懸浮培養(yǎng)和貼壁微載體懸浮培養(yǎng)，微載體懸浮培養(yǎng)也屬于固定化培養(yǎng)方式，通常所說的懸浮培養(yǎng)是指全懸浮培養(yǎng)。以懸浮培養(yǎng)方式進行規(guī)?；毎囵B(yǎng)始于1965年。Capstick P B等[8]于1962年馴化貼壁生長型細胞乳倉鼠腎細胞(baby hamster kidney 21，BHK-21)進行懸浮生長，并于1965年借鑒微生物發(fā)酵原理在不銹鋼發(fā)酵罐中懸浮培養(yǎng)BHK-21細胞用于獸用疫苗生產(chǎn)，獲得成功[9]。規(guī)?；瘧腋∨囵B(yǎng)因其諸多優(yōu)點，自出現(xiàn)便備受關(guān)注，成為研究熱點[10]。

規(guī)?；瘧腋∨囵B(yǎng)最大的優(yōu)勢在于通過更為精確有效的工藝控制手段，在獲得最大產(chǎn)量的同時能穩(wěn)步提高產(chǎn)品的質(zhì)量。進行懸浮培養(yǎng)的細胞屬于非貼壁依賴性細胞，具有傳代方便(不需消化處理)，易于收獲細胞等特點，除此以外，規(guī)?；瘧腋∨囵B(yǎng)借鑒于微生物發(fā)酵。基于微生物發(fā)酵擁有較成熟的理論和經(jīng)驗，以生物反應(yīng)器為生產(chǎn)設(shè)備的懸浮培養(yǎng)技術(shù)迅速發(fā)展起來，其自動化程度高，節(jié)省了人力的同時也降低了因人為操作而造成的污染，對細胞生長環(huán)境進行實時監(jiān)控，隨時掌握細胞用于生產(chǎn)的最佳狀態(tài)，進而提高了產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量，放大效應(yīng)小，大大提高了細胞密度等。此外，由于血清的使用造成的成本高，批間差異大，生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，以及后續(xù)純化過程復(fù)雜等原因[11]，使得無血清培養(yǎng)液的研發(fā)及使用越來越受到關(guān)注，而懸浮培養(yǎng)過程恰可以實現(xiàn)細胞的無血清生長過程。眾多優(yōu)勢之處使得規(guī)?；瘧腋∨囵B(yǎng)成為了動物細胞規(guī)模化培養(yǎng)的理想模式。

實現(xiàn)規(guī)?；瘧腋∨囵B(yǎng)的關(guān)鍵技術(shù)主要有4個，即貼壁細胞的馴化改造，個性化培養(yǎng)基的研制，生物反應(yīng)器的選擇及培養(yǎng)工藝的選擇及優(yōu)化。生產(chǎn)用大多數(shù)細胞為貼壁生長型細胞，要實現(xiàn)規(guī)?；瘧腋∨囵B(yǎng)，第一步就是對貼壁細胞進行馴化或者改造以適應(yīng)懸浮生長狀態(tài)。如1997年，一株馬-達二氏犬腎細胞(Madin-Darby canine kidney，MDCK)通過連續(xù)傳代的方式被馴化為懸浮細胞；2009年，另一株MDCK細胞通過轉(zhuǎn)染入siat7e基因被成功改造[12]。此外還有小鼠骨髓瘤NS0細胞(mouse myeloma line NS0)、人胚腎細胞(human embryo kidney-293，HEK293)、 BHK21細胞、非洲綠猴腎細胞(African green monkey kidney，Vero)、中國倉鼠卵巢細胞(Chinese hamster ovary cell，CHO)和人類視網(wǎng)膜細胞永生化和細胞系細胞(cell line derived from primary human retina cells that were immortalized upon transfection with the E1 region of adenovirus type 5，PER-C6)等實現(xiàn)了懸浮生長，并用于生產(chǎn)。其中CHO細胞因其諸多優(yōu)點，成為工業(yè)化生產(chǎn)重組蛋白應(yīng)用最廣泛的細胞系[13-14]。隨著多種可用商業(yè)化培養(yǎng)基的開發(fā)和優(yōu)化使得馴化過程變得相對容易[15]。同時對于不含血清培養(yǎng)基的開發(fā)很好的規(guī)避了血清帶來的弊端，經(jīng)過無血清培養(yǎng)基、無動物源培養(yǎng)基，到無蛋白源培養(yǎng)基和化學(xué)成分限定培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的開發(fā)已經(jīng)實現(xiàn)質(zhì)的飛躍[16]。但是對于馴化的懸浮細胞而言，由于不同細胞營養(yǎng)需求不同，對懸浮狀態(tài)的適應(yīng)性不同，用于生產(chǎn)的目的也不同，所以需要個性化的無血清培養(yǎng)基來支持。研究表明，個性化培養(yǎng)基的使用能夠明顯提高產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量[17]。

生物反應(yīng)器作為懸浮培養(yǎng)的關(guān)鍵設(shè)備，必須能夠為細胞生長、繁殖及代謝提供穩(wěn)定無菌的環(huán)境，具備良好的混合功能和低剪切力，此外還要具有規(guī)模的可放大性以滿足生產(chǎn)的需要。攪拌式生物反應(yīng)器的建立，成功的解決了懸浮培養(yǎng)過程中細胞剪切敏感性以及傳氧問題等，成為懸浮細胞規(guī)?；囵B(yǎng)的首選，迄今為止應(yīng)用最為廣泛[18]，最大體積已達20 000 m3。與攪拌式生物反應(yīng)器相比，氣升式生物反應(yīng)器因其耗電量低、剪切力低、內(nèi)部無結(jié)構(gòu)，滅菌更徹底等優(yōu)點，得到一定程度的應(yīng)用，最大體積達17 000 m3。除此之外，一次性生物反應(yīng)器開發(fā)，因其具有反應(yīng)器預(yù)先滅菌，即開即用，省去在線清洗、滅菌，以及驗證，一次性投入低，避免交叉污染等優(yōu)點，很大程度的促進細胞培養(yǎng)的發(fā)展，成為生物制藥領(lǐng)域發(fā)展的一個重要方向[19-20]。不同反應(yīng)器還要選擇合適的培養(yǎng)工藝，流加培養(yǎng)和灌注培養(yǎng)相比分批培養(yǎng)更有優(yōu)勢，流加培養(yǎng)在分批培養(yǎng)的基礎(chǔ)上補充新的培養(yǎng)液[21]，灌注培養(yǎng)是增加了截留裝置，保留細胞始終在反應(yīng)器中而只有培養(yǎng)液的不斷流動。灌注培養(yǎng)較好的實現(xiàn)了營養(yǎng)物質(zhì)的補給及代謝廢物的排出，成為將來的發(fā)展趨勢，但是培養(yǎng)基的利用率較低而且操作及裝置過于復(fù)雜，有待進一步的突破和優(yōu)化[22-24]。

懸浮培養(yǎng)技術(shù)盡管有諸多優(yōu)點并且是動物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)的理想模式，但仍然存在諸多問題有待解決，如生產(chǎn)用大多數(shù)細胞為貼壁生長型細胞，難以實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)，雖然已有細胞株能夠滿足蛋白質(zhì)類藥物的生產(chǎn)，但對于多種病毒疫苗的生產(chǎn)卻難以實現(xiàn)。此外，反應(yīng)器的剪切力，混合效果及擴大培養(yǎng)等問題，雖然得到一定程度的解決，但仍期待更好的解決方案。

1.3 固定化培養(yǎng)

細胞固定化規(guī)模培養(yǎng)方式來源于固定化酶技術(shù)，即將細胞以物理或化學(xué)手段限定于一定空間區(qū)域內(nèi)進行生長繁殖，達到較大的細胞密度，進而用于生產(chǎn)。由于生產(chǎn)過程需要細胞保持較高的活性，因此需要采取相對溫和的方法對細胞進行固定，通常采用吸附法或者包埋法[25]，由此衍生出的固定化規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)有微載體培養(yǎng)，中空纖維系統(tǒng)培養(yǎng)，微囊化培養(yǎng)等，其中微載體技術(shù)最為成熟并且應(yīng)用最廣。

1.3.1 微載體培養(yǎng) 微載體細胞培養(yǎng)技術(shù)由荷蘭學(xué)者van Wezel A L[26]于1967年提出并創(chuàng)立，微載體的出現(xiàn)和不斷成熟彌補了轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)等傳統(tǒng)貼壁細胞培養(yǎng)工藝的缺陷，成為貼壁細胞規(guī)?；囵B(yǎng)的重要方法，也使得細胞培養(yǎng)的工業(yè)化更上一個臺階。

微載體是指一類直徑在60 μm～250 μm的無毒、非剛性、密度均一的微球型顆粒，允許貼壁依賴性細胞貼附在其表面進而以懸浮狀態(tài)生長[27-28]。微載體培養(yǎng)技術(shù)綜合了貼壁培養(yǎng)和懸浮培養(yǎng)的優(yōu)點，提高了貼壁細胞的培養(yǎng)規(guī)模，在有限的空間里提供更大的貼附面積；貼壁細胞在微載體上生長失去接觸抑制，可形成多層，獲得更高的細胞密度；實現(xiàn)了貼壁細胞培養(yǎng)的自動化可控化管理，減少了人力，降低了污染幾率，提高了產(chǎn)品產(chǎn)量的同時還保證了質(zhì)量。雖然微載體培養(yǎng)很好的解決了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)貼壁細胞存在的問題，但也出現(xiàn)了新的問題，微載體培養(yǎng)繼承了懸浮培養(yǎng)的缺陷，剪切力對細胞的損害，凋亡細胞不及時的清除等可引起細胞的大面積死亡；隨著細胞數(shù)量的增加要及時補充微載體，但是微載體的補給增加了操作難度和污染幾率；微載體對細胞的生物學(xué)作用還不清楚；不能實現(xiàn)培養(yǎng)的階段性控制；對反應(yīng)器的要求更高；此外微載體的價格普遍昂貴；沒有一種微載體適合所有細胞；部分微載體難以降解和回收等[29-31]。

1.3.2 中空纖維系統(tǒng)培養(yǎng) 中空纖維細胞培養(yǎng)系統(tǒng)由Knazek P A等[32]于1972年提出。一般的細胞體外培養(yǎng)是在二維平面上生長，失去了體內(nèi)的立體空間性，而中空纖維系統(tǒng)很好的模擬了細胞在體內(nèi)的三維生存狀態(tài)。中空纖維類似于毛細血管，管壁為半透膜，允許一些小分子物質(zhì)及規(guī)定的物質(zhì)通過。多數(shù)纖維集中于圓筒中構(gòu)成中空纖維培養(yǎng)系統(tǒng)的培養(yǎng)室，纖維內(nèi)外形成兩個腔室，培養(yǎng)液流動于纖維內(nèi)，細胞生長在纖維外腔室。該培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)點在于很好的模擬了細胞在體內(nèi)的三維生長狀態(tài)；體積小，卻能夠在很小的體積里提供相當(dāng)大的表面積，供細胞高密度生長；不存在剪切力對細胞的破壞；細胞生長周期長；通過選擇半透膜孔徑就可以控制某些代謝物質(zhì)的流動，從而控制對細胞的影響或者濃縮產(chǎn)物；獲得高濃度和高純度的產(chǎn)物。缺點在于對于細胞的觀察比較困難；物質(zhì)的流動造成纖維膜的堵塞；過量氣體的產(chǎn)生或者細胞的生長破壞纖維。

1.3.3 微囊化培養(yǎng) 微囊培養(yǎng)起源于20世紀(jì)70年代，屬于包埋法，卻又區(qū)別于傳統(tǒng)的包埋法(僅將細胞包埋入生化材料內(nèi))，它是以選擇性半透膜同時包裹擬培養(yǎng)細胞、培養(yǎng)介質(zhì)及營養(yǎng)物質(zhì)形成的微囊體，微囊內(nèi)形成了允許細胞生長的微環(huán)境，而微囊處于培養(yǎng)系統(tǒng)大環(huán)境之中，通過半透膜與囊內(nèi)進行一定的物質(zhì)交換。該系統(tǒng)的優(yōu)點在于半透膜的存在保護了細胞免受剪切力等物理損傷；獲得高的細胞密度；產(chǎn)物濃度高，方便純化處理等。缺點在于微囊的制作過程復(fù)雜，成功率不高，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)難以控制[33]，微囊內(nèi)死亡細胞極易影響活細胞以及產(chǎn)物的形成，另外產(chǎn)物的收集必須破壁，無法實現(xiàn)連續(xù)化生產(chǎn)等[34]。微囊化培養(yǎng)更多的趨向于臨床應(yīng)用[35]。

2 問題及展望

自實行動物細胞規(guī)?；囵B(yǎng)以來，以細胞培養(yǎng)為基礎(chǔ)的各種產(chǎn)品在產(chǎn)量和質(zhì)量上都有了飛躍性的發(fā)展。但是各種培養(yǎng)技術(shù)和方法都存在著阻礙其廣泛應(yīng)用的不足之處，諸如生產(chǎn)用細胞多數(shù)為貼壁細胞，難以實現(xiàn)懸浮培養(yǎng)；微載體的關(guān)鍵技術(shù)為少數(shù)大公司所有，使得微載體使用的成本高；中空纖維培養(yǎng)技術(shù)纖維材料還有待開發(fā)；各種反應(yīng)器還不能夠更好的符合各種培養(yǎng)方法的要求；一次性反應(yīng)器的體積還有待增大；無血清培養(yǎng)基開發(fā)成本高，使用范圍窄等。在科技不斷發(fā)展的今天，這些不足有待更新和改善，以更好地實現(xiàn)細胞規(guī)?；囵B(yǎng)。而作為動物細胞培養(yǎng)的理想方式，無血清全懸浮培養(yǎng)體系的建立，將可以從根本上解決動物細胞規(guī)模放大問題，以更好的符合生物醫(yī)藥行業(yè)的發(fā)展和需求。

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