布魯菌病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)研究進(jìn)展

顧 盼，吳勝昔，劉學(xué)燕，曾 政，梁望旺，姚 璐

(1.重慶理工大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，重慶 400054；2.重慶市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，重慶 401120)

布魯菌病是由布魯菌感染引起的世界范圍內(nèi)最廣泛傳播的人畜共患病之一，10個(gè)～100個(gè)布魯菌就可能以空氣傳播的形式感染人[1-2]，可引起急性發(fā)熱及潛在的慢性感染，病死率低但發(fā)病率極高，嚴(yán)重威脅人類健康[3-4]。羊布魯菌(B.melitensis)、牛布魯菌(B.abortus)、豬布魯(B.suis)和犬布魯菌(B.canis)是流行在多種家畜、野生哺乳動(dòng)物及人類的主要布魯菌[5]。

不同種屬布魯菌的毒性、傳播方式及宿主特異性等均存在較大差異。布魯菌可隨患病動(dòng)物及其產(chǎn)品如牛奶傳播給人，而這類產(chǎn)品成分往往十分復(fù)雜。因此，精準(zhǔn)及快速地檢測布魯菌一直是國內(nèi)外科學(xué)家研究的熱點(diǎn)，更是布魯菌病防控檢測及反生物戰(zhàn)防護(hù)環(huán)節(jié)中重要的一環(huán)[6-7]。我國現(xiàn)有的布魯菌病實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)(GB/T 18646—2002)包括虎紅平板試驗(yàn)(rose bengal test,RBT)、試管凝集試驗(yàn)(serum agglutination test,SAT)和補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)(complement fixation test,CFT)等方法都有一定的缺陷，比如存在人為判斷檢測結(jié)果的主觀性問題。虎紅平板凝集試驗(yàn)因其敏感性較低、特異性不高而容易漏檢或誤檢，不能區(qū)分免疫抗體和感染抗體，因此只適用于布魯菌病的初篩。試管凝集試驗(yàn)有較高的特異性，但其敏感性依然低，且操作復(fù)雜、耗時(shí)長，整個(gè)檢測過程需要2 d，不適合大批量檢測。補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)敏感性和特異性都不穩(wěn)定，且試劑昂貴，因此其應(yīng)用受到極大限制。隨著分子生物學(xué)及免疫學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的新型技術(shù)不斷涌現(xiàn)，并逐步應(yīng)用到布魯菌病的診斷中。本文對這些新型實(shí)驗(yàn)室診斷方法的研究進(jìn)展做一簡要的綜述。

1 病原學(xué)診斷

1.1 基于聚合酶鏈反應(yīng)的檢測

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)具有簡便快速、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于傳染病的診斷領(lǐng)域?，F(xiàn)階段有多種引物應(yīng)用于布魯菌病的診斷，PCR效果也因引物、選用的PCR方法以及樣本的不同而存在差異(表1)。BCSP31(B4/B5)多應(yīng)用于人布魯菌病的診斷，檢測人的血液樣本時(shí)隨著反應(yīng)循環(huán)數(shù)的增加可進(jìn)一步提高其靈敏度，不同的引物對特異性影響顯著。Addour等比較了3對編碼BCSP 31、牛布魯菌的16 S rRNA以及編碼Omp2基因片段所對應(yīng)的引物B4/B5、F4/R2以及JPF/JPR的靈敏度，分別為98%、88.4%和53.1%[8]。由于不可避免的基因錯(cuò)配可能造成假陽性或假陰性結(jié)果，因而多種單引物技術(shù)的聯(lián)用可作為規(guī)?；\斷布魯菌病的分子診斷方法[9]。PCR在診斷布魯菌病上最大的優(yōu)勢是可精確到布魯菌的屬，其中AMOS PCR是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織 (Office International des Epizooties,OIE)確定的比較成熟的可以鑒別布魯菌主要流行中的病原檢測方法[10]。

在基層布魯菌病診斷中，PCR往往受限于需配備特定的PCR儀，結(jié)果的判定有時(shí)還需借助其他試驗(yàn)完成。而環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)以其可短時(shí)間內(nèi)完成、試驗(yàn)結(jié)果可憑肉眼直接觀察，不需要特定的PCR儀器等顯著優(yōu)勢而廣泛應(yīng)用于流行病學(xué)監(jiān)控、環(huán)境污染監(jiān)測、臨床疾病診斷以及食品安全檢查等方面[12-13]。Ohtsuki R等[14]首次報(bào)道將LAMP技術(shù)應(yīng)用于布魯菌的檢測，設(shè)計(jì)針對編碼BCSP31基因的特異性引物，僅在35 min內(nèi)就成功擴(kuò)增出10 fg的布魯菌DNA，且與Queipo-Ortuno M I等[15]建立的熒光定量PCR相比較，靈敏度相近，特異性更高，耗時(shí)更短。國內(nèi)Song L等[16]建立了針對B.abortus的Omp25 基因的LAMP布魯菌檢測方法，并應(yīng)用于奶樣及血樣的檢測，其最低檢測限可達(dá)到3.81 CFU/mL。LAMP用于布魯菌的檢測，具有良好的特異性與靈敏度，對布魯菌病的早期診斷有著重要的意義。血液樣本單引物PCR試驗(yàn)效果比較的相關(guān)研究見表1[8,11]。

表1 血液樣本單引物PCR試驗(yàn)效果比較

1.2 表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)

傳統(tǒng)的檢測手段依賴于病原菌的分離培養(yǎng)，根據(jù)表型及基因型的特征進(jìn)一步歸類到經(jīng)典的布魯菌種屬。然而，尤其是檢測牛奶這一類復(fù)雜的混合物時(shí)，基因分型的結(jié)果通常與現(xiàn)有的分類法不符以及基因錯(cuò)配都會(huì)造成結(jié)果的誤差。表面增強(qiáng)拉曼技術(shù)(surface-enhanced raman scattering technology,SERS)通過分析分子特定的指紋信息，具有極高的分析靈敏度，其檢測的靈敏度可達(dá)單分子水平[17-18]。若將SERS進(jìn)一步與熒光反應(yīng)連用檢測，可大大提高檢測樣本數(shù)量,實(shí)現(xiàn)多重檢測。據(jù)報(bào)道[19]利用SERE-熒光雙重檢測結(jié)核抗原，其檢測限可達(dá)0.051 1 pg/mL。Meisel S等[1]利用這項(xiàng)技術(shù)檢測牛奶及培養(yǎng)基中經(jīng)甲醛滅活后的的7株布魯菌、2株大腸埃希菌、 4株蒼白桿菌、 5株銅綠假單胞菌和2株耶爾森菌，2 h內(nèi)即可得到精確結(jié)果，培養(yǎng)基和牛奶中的布魯菌的識(shí)別精度分別達(dá)92%和94%，對布魯菌的生物變種的檢測精度也在90%以上。SERS不僅準(zhǔn)確區(qū)分單品種及混合品種的布魯菌，而且能有效識(shí)別布魯菌的生物變種，是潛在的可用于布魯菌病早期診斷的金標(biāo)準(zhǔn)。

2 血清學(xué)診斷

2.1 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

目前用于布魯菌病診斷的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)主要有間接ELISA(indirect ELISA,IELISA)和競爭ELISA(competitive ELISA,CELISA)。ELISA最大的問題就是抗原的選擇[6，20]，世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦O型多糖(O-polysaccharide,OPS)或光滑型布魯菌菌體脂多糖(smooth lipopolysaccharide,sLPS)為標(biāo)準(zhǔn)抗原。但是假陽性結(jié)果是目前基于OPS的診斷方法的一大難題，該法易與含有光滑型布魯菌OPS相似結(jié)構(gòu)的革蘭陰性菌(如大腸埃希菌O157:H7等)發(fā)生交叉反應(yīng)，且不能區(qū)分疫苗接種與自然感染。因此，篩選到可取代OPS或sLPS的可靠抗原一直是各國科學(xué)家研究的焦點(diǎn)，如菌體脂多糖(rough lipopolysaccharide,rLPS)、細(xì)胞漿蛋白及重組BP26蛋白等[21]。使用rLPS或細(xì)胞漿蛋白，可在一定程度上降低假陽性反應(yīng)[22]。Xin T等[23]發(fā)現(xiàn)，布魯菌感染的個(gè)體均會(huì)產(chǎn)生高水平的針對LPS蛋白的抗體，但只有在羊布魯菌16M型和M28型感染的綿羊、羊布魯菌M28和牛布魯菌2308型感染的山羊體內(nèi)檢測到BP26抗體，因此基于BP26蛋白的IELISA檢測方法宿主特異性較高，從而局限了其適用范圍。此外，基于repA蛋白的布魯菌IELISA可有效區(qū)分野毒感染及疫苗接種個(gè)體[24]，這在布魯菌病防控中具有重要意義。

CELISA的關(guān)鍵因素在于建立特異性好、靈敏度高的單克隆抗體。CELISA相較于IELISA，可以避免交叉反應(yīng)引起的假陽性，此外CELISA可用于多種屬的布魯菌的檢測，因此CELISA用于布魯菌的檢測是研究的熱點(diǎn)。Nielsen K等[25]在原有的CELISA的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn)，以辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的重組A蛋白和G蛋白(PAG蛋白)取代HRP酶標(biāo)抗-抗體，建立了第二代針對SLPS蛋白的CELISA。經(jīng)驗(yàn)證該法的特異性與第一代CELISA及IELISA相近，靈敏度略有下降，但PAG蛋白的使用消除了抗抗體的批次差異，有利于推進(jìn)CELISA試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化操作。

2.2 時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)

時(shí)間分辨免疫熒光技術(shù)(time resolved fluorescent resonance energy transfer， TR-FRET)通過給相應(yīng)的供體(或受體)標(biāo)記上一長壽命熒光基團(tuán)，通過時(shí)間延遲，將特異性熒光與非特異性熒光分辨開來，使理論本底達(dá)到零，有效避免了假陽性反應(yīng)。McGiven J A等[26]首次將TR-FRET應(yīng)用于對布魯菌抗體的檢測，對相應(yīng)cELISA試劑盒進(jìn)行改造，給sLPS標(biāo)準(zhǔn)抗原標(biāo)記上異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)基團(tuán)，通過檢測帶長壽命的熒光基團(tuán)抗布魯菌BM40蛋白單克隆抗體以及陰陽性血清以優(yōu)化反應(yīng)條件，建立布魯菌的TR-FRET檢測方法。將其用于檢測32份牛血清和41份羊血清，僅孵育30 min,且不需要任何洗滌步驟，結(jié)果與IELISA檢測結(jié)果一致，具有100%診斷特異性和敏感性。國內(nèi)鄭騰等[27]以布魯菌的BP26蛋白作為抗原包被成為檢測線，以稀土熒光納米顆粒標(biāo)記的金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcalprotein A,SPA)作為檢測物，檢測715份牛血清，與RBT試驗(yàn)結(jié)果相比，符合率達(dá)92%，且與其他血清無交叉反應(yīng)。此外，TR-FRET技術(shù)快速定量且重復(fù)性好，省去了ELISA反復(fù)洗滌和加樣的步驟，并可同時(shí)檢測低質(zhì)量血清中的抗體和抗原，靈活使用。

2.3 熒光偏振試驗(yàn)

熒光偏振試驗(yàn)(fluorescence polarization assay,FPA)是OIE認(rèn)為敏感性、特異性與ELISA相當(dāng)?shù)脑囼?yàn)，美國于2004年將FPA確定為布魯菌病診斷的官方確證試驗(yàn)。FPA對樣本要求不高，不僅可用于血清檢測，也可用于奶樣的檢測。Nielsen K等[28]對FPA測定感染布魯菌的豬血清做出評價(jià)， FPA的敏感性及特異性分別是93.5%和97.2%，與IELISA(94.0%和97.9%)、CELISA(90.8%和96.6%)的結(jié)果相當(dāng)。此外，通過雙盲試驗(yàn)證實(shí)，F(xiàn)PA還可區(qū)分牛布魯菌感染和疫苗S19免疫接種[29]。

2.4 橫向流動(dòng)免疫檢測技術(shù)

橫向流動(dòng)免疫檢測技術(shù)(lateral flow assay,LFA)首先應(yīng)用于人布魯菌病的診斷，隨后用于動(dòng)物布魯菌病的診斷[30-32]。它是由加樣墊和吸收墊構(gòu)成的多孔硝基檢測試紙條。Abdoel T等[32]利用牛布魯菌1119-3株的LPS蛋白作為抗原來捕獲血清中的抗體，使用40 nm膠體金顆粒標(biāo)記的相應(yīng)動(dòng)物的IgG為檢測物，分別檢測牛、山羊、綿羊和豬的血清樣本中的布魯菌，結(jié)果顯示，該法與病原菌分離這一金標(biāo)準(zhǔn)的符合率分別達(dá)90%、100%、77%和73%，與RBT及CFT結(jié)果均無明顯差異，提示其有較高的特異性，但存在假陰性結(jié)果。LFA是一種成本低的快速檢測方法，對操作技術(shù)要求低，無需配套設(shè)備，但敏感性低，適用于資源匱乏地區(qū)推廣進(jìn)行初步檢測排查[33]。

2.5 其他技術(shù)

布魯菌的檢測樣本數(shù)往往非常大，這一特點(diǎn)就要求了檢測方法須具有高通量且有效的特點(diǎn)，如AlphaLISA技術(shù)，Luminex技術(shù)等。

2008年，AlphaLISA技術(shù)首次報(bào)道用于布魯菌病診斷[34]。偶聯(lián)抗布魯菌的BM40單克隆抗體受體微珠與結(jié)合了羊布魯菌16M菌株的sLPS抗原供體微珠結(jié)合于615 nm處出現(xiàn)特異性吸收峰，檢測感染及未感染的布魯菌的牛羊血清，敏感性及特異性分別達(dá)96%及98%以上，但存在一定的假陽性反應(yīng)。AlphaLISA技術(shù)具有上樣體積少(50 μL)，可在96/384/1536/3456孔板中操作，可作為布魯菌高通量檢測的選擇方法，適用于布魯菌病防控監(jiān)測。

Luminex技術(shù)被譽(yù)為“真正的臨床應(yīng)用型生物芯片”，基于xMAP技術(shù)原理，將熒光編碼微球、激光檢測、應(yīng)用流體學(xué)和計(jì)算機(jī)運(yùn)算法則等多項(xiàng)技術(shù)進(jìn)行整合，真正實(shí)現(xiàn)了“高通量”檢測。Silbereisen A等[35]以多種方式滅活的布魯菌免疫接種小鼠，成功構(gòu)建出分別針對羊布魯菌(B.Melitensis)和牛布魯菌(B.abortus)的脂多糖的O抗原的單克隆抗體，進(jìn)而建立了基于磁珠的Luminex xMAP檢測方法。相較于ELISA，該法靈敏度顯著提高，能夠檢測到10個(gè)～4 000個(gè)細(xì)胞(樣品體積為50 μL)。此外，該方法可以同時(shí)檢測一系列的相關(guān)樣本，能夠特異性識(shí)別混合樣品如牛奶的布魯菌病原菌。Luminex檢測方法作為布魯菌的檢測方法是有前景的，高通量且高于ELISA的靈敏度，適用于布魯菌病臨床早期診斷。

3 小結(jié)

對于布魯菌病診斷技術(shù)，不同的研究報(bào)道結(jié)果不盡相同。這通常與所選定的樣本、樣本數(shù)量、使用技術(shù)等多種因素有關(guān)。我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)[36]中如補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)和虎紅平板凝集試驗(yàn)因其耗材便宜、無需配套設(shè)備等優(yōu)點(diǎn)在疾控及研究機(jī)構(gòu)廣泛使用，但均存在操作復(fù)雜，結(jié)果受主觀判斷影響等缺點(diǎn)；而酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)等檢測技術(shù)存在成本的問題?？傮w說來，目前布魯菌病診斷方法的研究趨勢總體圍繞四個(gè)方面：削減成本，提高特異性，提高試驗(yàn)方法的實(shí)用性，以及提高區(qū)分感染動(dòng)物和疫苗接種動(dòng)物的可靠性。

布魯菌分布范圍廣，可通過接觸患病動(dòng)物或食用患病動(dòng)物產(chǎn)品傳染給人，給動(dòng)物和人造成了嚴(yán)重的健康威脅。實(shí)驗(yàn)室診斷是其中重要的一環(huán)，現(xiàn)有的診斷方法都有其相應(yīng)的適用范圍的優(yōu)缺點(diǎn)?？偠灾?，病原檢測方法的敏感性均高于血清學(xué)診斷方法；而血清學(xué)診斷方法中，敏感性以IELISA、FPA為高，特異性以LFA、CELISA、IELISA為高，而AlphaLISA技術(shù)及Luminex技術(shù)具有高通量的顯著優(yōu)勢，成本則以FPA和TR-FRET占優(yōu)勢。因此，多種診斷方法如敏感性高的初篩方法與特異性高的復(fù)篩方法聯(lián)合使用，是現(xiàn)階段布魯菌病診斷的主要方法。

[1] Meisel S,Stockel S,Elschner M,et al.Raman spectroscopy as a potential tool for detection ofBrucellaspp.in milk[J].Appl Environ Microbiol,2012,78(16):5575-5583.

[2] Mirnejad R,Jazi F M,Mostafaei S,et al.Epidemiology of brucellosis in Iran:A comprehensive systematic review and meta-analysis study[J].Microb Pathog,2017,109:239-247.

[3] Suarez-Esquivel M,Ruiz-Villalobos N,Jimenez-Rojas C,et al.Brucellaneotomaeinfection in humans,Costa Rica[J].Emerg Infect Dis,2017,23(6):997-1000.

[4] Tuon F F,Gondolfo R B,Cerchiari N.Human-to-human transmission ofBrucella-a systematic review[J].Trop Med Int Health,2017,22(5):539-546.

[5] Olsen S C,Palmer M V.Advancement of knowledge ofBrucellaover the past 50 years[J].Vet Pathol,2014,51(6):1076-1089.

[6] Mandal S S,Duncombe L,Ganesh N V,et al.Novel solutions for vaccines and diagnostics to combat brucellosis[J].ACS Cent Sci,2017,3(3):224-231.

[7] Zamri-Saad M,Kamarudin M I.Control of animal brucellosis:The Malaysian experience[J].Asian Pac J Trop Med,2016,9(12):1136-1140.

[8] Baddour M M,Alkhalifa D H.Evaluation of three polymerase chain reaction techniques for detection ofBrucellaDNA in peripheral human blood[J].Can J Microbiol,2008,54(5):352-357.

[9] Wang Y,Wang Z,Zhang Y,et al.Polymerase chain reaction-based assays for the diagnosis of human brucellosis[J].Ann Clin Microbiol Antimicrob,2014,13:31.

[10] Sergueev K V,Filippov A A,Nikolich M P.Highly sensitive bacteriophage-based detection ofBrucellaabortusin mixed culture and spiked blood[J].Viruses,2017,9(6):144.

[11] Mitka S,Anetakis C,Souliou E,et al.Evaluation of different PCR assays for early detection of acute and relapsing brucellosis in humans in comparison with conventional methods[J].J Clin Microbiol,2007,45(4):1211-1218.

[12] Trangoni M D,Gioffre A K,Ceron Cucchi M E,et al.LAMP technology:Rapid identification ofBrucellaandMycobacteriumaviumsubsp.paratuberculosis[J].Braz J Microbiol,2015,46(2):619-626.

[13] Notomi T,Mori Y,Tomita N,et al.Loop-mediated isothermal amplification (LAMP):principle,features,and future prospects[J].J Microbiol,2015,53(1):1-5.

[14] Ohtsuki R,Kawamoto K,Kato Y,et al.Rapid detection ofBrucellaspp.by the loop-mediated isothermal amplification method[J].J Appl Microbiol,2008,104(6):1815-1823.

[15] Queipo-Ortuno M I,Colmenero J D,Reguera J M,et al.Rapid diagnosis of human brucellosis by SYBR Green I-based real-time PCR assay and melting curve analysis in serum samples[J].Clin Microbiol Infect,2005,11(9):713-718.

[16] Song L,Li J,Hou S,et al.Establishment of loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for rapid detection ofBrucellaspp.and application to milk and blood samples[J].J Microbiol Methods,2012,90(3):292-297.

[17] Stockel S,Meisel S,Lorenz B,et al.Raman spectroscopic identification ofMycobacteriumtuberculosis[J].J Biophotonics,2017,10(5):727-734.

[18] Pavlicek R L,Crane N J,Ghebremedhin M,et al.Diagnostic bacteriology:Raman spectroscopy[J].Methods Mol Biol,2017,1616:249-261.

[19] Zou F,Zhou H,Tan T V,et al.Dual-mode SERS-fluorescence immunoassay using graphene quantum dot labeling on one-dimensional aligned magnetoplasmonic nanoparticles[J].ACS Appl Mater Interfaces,2015,7(22):12168-12175.

[20] Ayala S M,Hasan D B,Celestino C A,et al.Validation of a simple universal IELISA for the diagnosis of human brucellosis[J].Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2014,33(7):1239-1246.

[21] Mcgiven J A,Nicola A,Commander N J,et al.An evaluation of the capability of existing and novel serodiagnostic methods for porcine brucellosis to reduce false positive serological reactions[J].Vet Microbiol,2012,160(3-4):378-386.

[22] Nielsen K,Smith P,Yu W,et al.Serological discrimination by indirect enzyme immunoassay between the antibody response toBrucellasp.andYersiniaenterocoliticaO:9 in cattle and pigs[J].Vet Immunol Immunopathol,2006,109(1-2):69-78.

[23] Xin T,Yang H,Wang N,et al.Limitations of the BP26 protein-based indirect enzyme-linked immunosorbent assay for diagnosis of brucellosis[J].Clin Vac Immunol,2013,20(9):1410-1417.

[24] Wang J Y,Wu N,Liu W H,et al.A repA-based ELISA for discriminating cattle vaccinated withBrucellasuis2 from those naturally infected withBrucellaabortusandBrucellamelitensis[J].Mol Cell Probes,2014,28(5-6):251-254.

[25] Nielsen K,Smith P,Yu W L,et al.Validation of a second generation competitive enzyme immunoassay (CELISA) for the diagnosis of brucellosis in various species of domestic animals[J].Vet Immunol Immunopathol,2008,125(3-4):246-250.

[26] Mcgiven J A,Thompson I J,Commander N J,et al.Time-resolved fluorescent resonance energy transfer assay for simple and rapid detection of anti-Brucellaantibodies in ruminant serum samples[J].J Clin Microbiol,2009,47(10):3098-3107.

[27] 鄭 騰，張?bào)w銀，李宋玨，等.布魯氏菌抗體時(shí)間分辨熒光檢測方法的建立[J].獸醫(yī)科技,2014,46(10):60-63.

[28] Nielsen K,Gall D,Smith P,et al.Validation of the fluorescence polarization assay as a serological test for the presumptive diagnosis of porcine brucellosis[J].Vet Microbiol,1999,68(3-4):245-253.

[29] 毛開榮.布魯氏菌病流行特點(diǎn)與防控措施[C]//中國獸醫(yī)發(fā)展論壇專題報(bào)告文集,北京，2010:81-85.

[30] Smits H L,Abdoel T H,Solera J,et al.ImmunochromatographicBrucella-specific immunoglobulin M and G lateral flow assays for rapid serodiagnosis of human brucellosis[J].Clin Diagn Lab Immunol,2003,10(6):1141-1146.

[31] Irmak H,Buzgan T,Evirgen O,et al.Use of theBrucellaIgM and IgG flow assays in the serodiagnosis of human brucellosis in an area endemic for brucellosis[J].Am J Trop Med Hyg,2004,70(6):688-694.

[32] Abdoel T,Dias I T,Cardoso R,et al.Simple and rapid field tests for brucellosis in livestock[J].Vet Microbiol,2008,130(3-4):312-319.

[33] Gordon J,Michel G.Analytical sensitivity limits for lateral flow immunoassays[J].Clin Chem,2008,54(7):1250-1251.

[34] Mcgiven J A,Sawyer J,Perrett L L,et al.A new homogeneous assay for high throughput serological diagnosis of brucellosis in ruminants[J].J Immunol Methods,2008,337(1):7-15.

[35] Silbereisen A,Tamborrini M,Wittwer M,et al.Development of a bead-based Luminex assay using lipopolysaccharide specific monoclonal antibodies to detect biological threats fromBrucellaspecies[J].BMC Microbiol,2015,15:198.

[36] 中國獸藥典委員會(huì).中華人民共和國獸藥典：三部(2010年版)[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社,2010:82-86.